СПОСОБ КОСВЕННОЙ ОЦЕНКИ ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ ПО ПРИЗНАКУ ЦИТОПАТОГЕННОСТИ Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/00 

Изобретение относится к медицине, а конкретно микробиологии, и касается оценки вирулентности штаммов возбудителя мелиоидоза и сапа.

Как известно, мелиоидоз и сап относятся к особо опасным инфекциям, а возбудители их Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei вызывают тяжелое заболевание у людей и многих видов животных. В реализации патогенности этих близкородственных видов микроорганизмов имеют значение многие факторы, такие как экзотоксин, термостабильный летальный токсин, антиген 8, а также внеклеточно секретируемые ферменты, как протеазы, фосфолипазы, щелочная фосфатаза, гемолизины (1,3-5).

В генетических исследованиях часто возникает необходимость одновременного и быстрого изучения большого количества штаммов, отбора среди них вирулентных и авирулентных вариантов, клонового анализа популяции по степени патогенности.

Общепринятым способом определения вирулентности микроорганизмов является заражение чувствительных лабораторных животных с расчетом LD₅₀. Наиболее близким аналогом предлагаемому способу являются «Методические рекомендации по лабораторной диагностике мелиоидоза», где описана соответствующая методика (2). Однако использование животных сопряжено со многими сложностями и ограничениями: длительностью эксперимента, опасностью контакта с инфицированными животными, относительно высокой стоимостью и сложностью их разведения и содержания.

Цель изобретения - разработка менее дорогого и ускоренного способа косвенной оценки вирулентности штаммов возбудителя мелиоидоза и сапа на растительной модели Peireskia aculeata (Пейреския шиповатая).

P.aculeata - неприхотливое комнатное растение из семейства кактусовых, характеризуется быстрым ростом, устойчивое к болезням. В отличие от других растительных моделей жизненный цикл Р.aculeata составляет многие годы. При ее использовании не требуется проращивать семена, применять специальные питательные смеси. Листья этого растения длительное время сохраняют первоначальный вид во влажной камере. Применение Р.aculeata характеризуется низкой себестоимостью, поскольку для изучения одного штамма достаточно одной листовой пластинки.

Подготовка растения

На начальном этапе молодой побег, имеющий 5-6 междоузлий (черенок), срезают по косой острым стерильным ножом над почкой, удаляют нижние листья, ставят в чистую воду, в которую добавляют активированный уголь, после появления корней сажают в почву на глубину один-два сантиметра. В работе используют растение возрастом не менее 1 года, выращенное в комнатных условиях, имеющее здоровый вид. Отбирают листья длиной 3,5-4,0 см, промывают их дистиллированной водой, помещают в чашку Петри на ватный тампон, смоченный дистиллированной водой, нижней стороной вверх. Все компоненты (дистиллированная вода, чашка Петри, ватный тампон, скальпель) должны быть стерильными.

Подготовка бактериальной культуры для заражения растений и животных

Штаммы В.pseudomallei и В.mallei выращивают на питательном агаре (Difco) или на агаре на основе гидролизата казеина в течение 48 ч при 32°С, готовят взвеси концентрацией 1×10⁹ м.к./мл в 0,15 М NaCl по стандартному образцу мутности ООО «Ормет» (СОП №1-98) и делают десятикратные разведения до 1×10¹ м.к./мл. Для заражения используются все полученные разведения.

Инфицирование растений

Нижнюю сторону листовой пластинки обрабатывают 70% этиловым спиртом, скальпелем с обеих сторон от центральной жилки делают по 3-4 насечки длиной 2 см, затем наносят 1 стандартную бактериологическую петлю взвеси В.pseudomallei и В.mallei в 0.15 М NaCl в различных концентрациях в зависимости от целей и задач исследования. В качестве контроля используют стерильный 0.15 М NaCl. Чашки с посевами инкубируют при 32°С. Инфицированные образцы просматривают через 24 и 48 ч. Уровень цитопатогенности штаммов оценивают визуально по степени повреждения листовой пластинки (мацерация, изъязвление и почернение листовой пластинки, табл.1). Параллельно определяют вирулентность для животных.

Заражение животных

Для исследования используют золотистых хомячков весом 75 г. Заражение культурами В.pseudomallei и В.mallei проводят подкожно в область внутренней поверхности бедра, в дозах 1×10⁰-1×10⁸ м.к. (по 5 животных на дозу) и учитывают динамику гибели в группах. Вирулентные свойства оценивают по количеству павших животных, рассчитывая LD₅₀ по Керберу. В течение срока наблюдения (21 день) проводят вскрытие, оценивают характер патоморфологических изменений внутренних органов павших животных, выделяют и идентифицируют бактериальные культуры.

Степень цитопатогенности В.pseudomallei и В.mallei для Р.aculeata сопоставляют с уровнем вирулентности для золотистых хомячков.

Таким образом, предлагаемый метод заключается в предварительном отборе внешне здоровых листьев Р.aculeata, приготовлении десятикратных разведений от 1×10⁹ до 1×10¹ м.к./мл взвесей штаммов В.pseudomallei и В.mallei, выращенных на питательном агаре Difco при 32°С в течение 48 часов, нанесении полученной суспензии из каждой заражающей дозы в объеме одной бактериологической петли на стерильные насечки пластинки листа, помещении листьев с культурами на стерильный влажный тампон в чашку Петри и инкубации при 32°С 24-48 часов, определении уровня цитопатогенности по степени изменения листовой пластинки: 4 степень, когда через 48 часов мацерация, изъязвление и почернение листа шире зоны нанесения культуры, 3 степень, когда мацерация, изъязвление и почернение листовой пластинки в пределах зоны нанесения культуры, 2 степень, когда мацерация отсутствует, изъязвление и почернение листовой пластинки в пределах зоны нанесения культуры, возможен рост культуры, 1 степень, когда мацерация отсутствует, изъязвление и потемнение листовой пластики по ходу насечек, возможен рост культуры, в контроле - стерильный лист с нанесенными насечками без добавления культуры - отсутствуют изменения листовой пластинки.

Пример 1. Сравнительный анализ цитопатогенности штаммов В.pseudomallei и В.mallei для Р.aculeata

Лист Р.aculeata промывают дистиллированной водой, помещают в чашку Петри на ватный тампон, смоченный дистиллированной водой, нижней стороной вверх, которую обрабатывают 70% этиловым спиртом, скальпелем с обеих сторон от центрального сосуда делают по 3-4 насечки длиной 2-3 см, затем наносят взвеси В.pseudomallei и В.mallei в растворе 0.15 М NaCl в различных концентрациях от 1×10⁹ м.к./мл соответственно стандартному образцу мутности ООО «Ормет» (СОП №1-98) и ниже в объеме одной стандартной бактериологической петли. Чашки с посевами инкубируют при 32°С. Инфицированные образцы просматривают через 24 и 48 ч. Уровень цитопатогенности штаммов оценивают визуально по степени повреждения листовой пластинки (мацерация, изъязвление и почернение листовой пластинки, табл.1). Результаты представлены в таблице 2.

Пример 2. Сравнительный анализ вирулентности штаммов В.pseudomallei и В.mallei для золотистых хомячков

Животных заражают культурами В.pseudomallei и В.mallei в дозах 1×10⁰-1×10⁸ м.к./мл (по 5 животных на дозу) и учитывают динамику гибели в группах. В течение срока наблюдения (21 день) проводят вскрытие, оценивают характер патоморфологических изменений внутренних органов павших животных, выделяют и идентифицируют бактериальные культуры. Результаты представлены в таблице 3.

Пример 3. Сравнительный анализ вирулентности и цитопатогенности штаммов В.pseudomallei и В.mallei

Степень цитопатогенности для растительной модели Р.aculeata коррелирует с уровнем вирулентности изученных штаммов для золотистых хомячков.

Штаммы В.pseudomallei, вирулентные для золотистых хомячков (LD₅₀ 1×10^0-1 м.к.), дают 3-4 степень поражения листовой пастинки Р.aculeata, штаммы с низкой вирулентностью не вызывают ее повреждения, с промежуточными значениями вирулентности (LD₅₀ 1×10^2-3 м.к.) - поражают листовую поверхность до 1-2 степени.

В случае В.mallei, характеризующегося более низкой ферментативной активностью, наблюдается иная закономерность. Вирулентные штаммы (LD₅₀ 1×10^0-1 м.к.) дают 1-2 степень поражения листовой пластинки, со сниженной вирулентностью (LD₅₀ 1×10⁵ м.к.) - не вызывают ее повреждения.

Пример 4. Определение уровня цитопатогенности штамма В.pseudomallei VPA** (ревертант)

Листья Р.aculeata помещают в стерильные чашки Петри на ватные тампоны, смоченные стерильной дистиллированной водой. Нижнюю сторону листовых пластинок протирают 70% раствором этилового спирта, делают насечки стерильным скальпелем с обеих сторон центральной жилки и наносят взвеси культуры B.pseudomallei VPA** (ревертант) в концентрации 1×10⁸-10² м.к./мл в объеме одной бактериологической петли. Инкубация составляет 48 ч при 32°С. В качестве контроля используют стерильный 0.15 М NaCl. О цитопатогенности штамма судят по зоне мацерации, изъязвления и почернения листовой пластинки и дозе, вызвавшей эти изменения. Результаты представлены в таблице 5.

Приведенные данные свидетельствуют о довольно высокой чувствительности метода и возможности использования его в различных вариантах: для косвенной оценки вирулентности, выбора дозы заражения животных для окончательного определения вирулентности, сравнительного анализа вирулентности большого количества штаммов по признаку цитопатогенности, отбора вирулентных штаммов и со сниженной вирулентностью, для более тонкого анализа изменения вирулентности отдельных штаммов В.pseudomallei и В.mallei.

Таким образом, предложенный способ обладает высокой производительностью, чувствительностью, воспроизводимостью, универсальностью, простотой и доступностью проведения и может применяться для предварительной оценки вирулентности штаммов В.pseudomallei и В.mallei.

Литература

1. Мелиоидоз. Сб.научн.тр. Под ред. Н.Г.Тихонова. - Волгоград: Ниж. - Волж.кн.изд-во, 1995. - 224 с.

2. МУ 4.2.2787-10.4.2 Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика мелиоидоза. Методические указания (утв.Роспотребнадзором 06.12.2010).

3. Пивень Н.Н., Смирнова В.И., Каплиев В., Позолкова Г.М., Храпова Н.П. Роль поверхностных антигенов Pseudomonas pseudomallei в патогенезе мелиоидоза // Журн.микробиол. - 1991. - №10. - С.8-12.

4. Сап.Сб.научн.тр. Под ред. Н.Г.Тихонова. - Волгоград: Ниж. - Волж. кн. изд-во, 1995. - 128 с.

5. Dejsilbert S., Butraporn R., Chiewsilp D. High activity of acid phosphatase of Pseudomonas pseudomallei as a possible attribute relating to its pathogenesity // Jap.J.Med.Sci.Biol. - 1989. - vol.42, №2. - p.39-49.

Изобретение касается косвенной оценки вирулентности возбудителей мелиоидоза и сапа по признаку цитопатогенности. В качестве объекта для косвенной оценки применяют внешне здоровые листья растения Peireskia aculeata, на стерильной поверхности которых делают насечки, на них наносят в разной концентрации заражающие дозы исследуемых штаммов Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei, помещают на влажный тампон и инкубируют при 32°С в течение 24-48 ч. Степень их цитопатогенности оценивают визуально по повреждению листовой пластинки - мацерация, изъязвление и почернение. Параллельно определяют уровень вирулентности штаммов возбудителей для лабораторных животных и степень цитопатогенности для Р.aculeata соотносят с вирулентностью для лабораторных животных. Изобретение обеспечивает высокую чувствительность, воспроизводимость, универсальность, простоту и доступность проведения исследования. 5 табл., 4 пр.

Способ косвенной оценки вирулентности штаммов патогенных буркхольдерий по признаку цитопатогенности, включающий приготовление взвесей клеток исследуемых штаммов Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei разной концентрации с последующим их введением лабораторным животным, отличающийся тем, что в качестве объекта для косвенного определения вирулентности применяют листья Peireskia aculeata, на которые наносят в разной концентрации заражающие дозы исследуемых штаммов В.pseudomallei и В.mallei, для чего первоначально отбирают внешне здоровые листья, готовят десятикратные разведения от 1×10⁹ до 1×10¹ м.к./мл взвесей штаммов В. pseudomallei и В.mallei, выращенных на питательном агаре Difco при 32°С в течение 48 ч, после чего из каждой заражающей дозы наносят взвесь в объеме одной стандартной бактериологической петли на предварительно нанесенные насечки на стерильной пластинке листа, помещают на стерильный влажный тампон в чашку Петри, инкубируют при 32°С 24-48 ч, о цитопатогенности судят по степени изменения листовой пластинки - 4-я степень, когда через 48 ч мацерация, изъязвление и почернение листа шире зоны нанесения культуры, 3-я степень, когда мацерация, изъязвление и почернение листовой пластинки в пределах зоны нанесения культуры, 2-я степень, когда мацерация отсутствует, изъязвление и почернение листовой пластинки в пределах зоны нанесения культуры, возможен рост культуры, 1-я степень, когда мацерация отсутствует, изъязвление и потемнение листовой пластики по ходу насечек, возможен рост культуры, контролем опыта служит стерильный лист с нанесенными насечками без добавления бактерий на котором отсутствуют изменения листовой пластинки, степень цитопатогенности для Р. aculeata соотносят с вирулентностью для лабораторных животных.