ШТАММ БАКТЕРИЙ Burkholderia cepacia - АВИРУЛЕНТНЫЙ ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОФАГА, ЛИЗИРУЮЩЕГО ВОЗБУДИТЕЛЯ САПА Российский патент 2008 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается штамма Burkholderia cepacia KM 203, способного продуцировать бактериофаг, лизирующий культуры возбудителя сапа (Burkholderia mallei).

Известно, что культуры возбудителя сапа чувствительны к фагам филогенетически близкородственного высокопатогенного вида Burkholderia pseudomallei (А.с. №561398, А.с. №561399, А.с. №561400, Ростовский-на-Дону Государственный НИПЧИ, Адимов Л.Б., Токарев С.А., Кирдеев В.К., А.с. №14205, Болгария). Недостаток данных бактериофагов заключается в том, что штамм-продуцент является возбудителем высоко опасной инфекции - мелиоидоза и требует соблюдения соответственного режима работы с ним. Необходимо отметить и то, что представленные бактериофаги не могут применяться в дифференциальной диагностике, так как обладают литической активностью как по отношению к сапным, так и к мелиоидозным культурам.

Способность другого родственного непатогенного вида В. cepacia продуцировать бактериофаги, обладающие литической активностью в отношении клеток возбудителя сапа, до настоящего времени не исследована.

Цель изобретения заключается в получении штамма В. cepacia - источника бактериофага, лизирующего культуры гетерологичного патогенного микроорганизма - возбудителя сапа, а также в расширении ассортимента штаммов-носителей сапных бактериофагов.

Для достижения цели осуществлен скрининг имевшегося в нашем распоряжении набора клинических и музейных культур непатогенных буркхольдерий коллекции ВолгоградНИПЧИ (32 штамма) и отобран штамм В. cepacia В623, который из всей коллекции авирулентных буркхольдерий оказался способным продуцировать бактериофаг, лизирующий культуры возбудителя сапа.

Выявленный штамм В.cepacia B623 обладает свойствами, характерными для вида B.cepacia: клетки представляют собой подвижные грамотрицательные не образующие спор палочки; штамм хорошо растет в аэробных условиях на обычных питательных средах, которые используют в работе с буркхольдериями (мясо-пептонном агаре, бульоне, триптиказо-соевом агаре, бульоне с добавлением 4-5% глицерина) при 37°С и оптимуме рН от 6,8 до 7,2.

На плотных питательных средах через 24-48 ч культуры образуют гладкие круглые полупрозрачные колонии кремового цвета в S-форме; в жидких питательных средах через 24-48 ч вызывают помутнение среды и образование пленки на поверхности.

Биохимическая активность B.cepacia B623 проверена стандартными методами изучения основных родовых и видовых свойств: в тесте Хью-Лейфсона окисление глюкозы (+), ферментация (-); оксидаза (+), каталаза (+), желатиназа (+), аргининдигидролаза (-), лизиндекарбоксилаза (-), орнитин-декарбоксилаза (-), ассимиляция L-арабинозы (Ara +), бета-галактозидаза (+).

Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам: агглютинируется сывороткой против типового штамма B.cepacia 25416 до диагностического титра.

Изучение литической активности бактериофага В. cepacia B623 проводили, используя в качестве индикаторных 14 имеющихся в коллекции ВолгоградНИПЧИ штаммов B.mallei Ц4, Ц5, 11, 8, В-120, Иванович, Будапешт, Р1, 10230, 5584, Z-12, Загреб, Богор 37, Муксувар 11. Чувствительность индикаторных культур к фагу, содержащемуся в хлороформном лизате В. cepacia KM 203, определяли методом агаровых слоев по Грациа.

Бактериофаг, содержащийся в хлороформном лизате В.cepacia B623, вызывал образование прозрачных негативных колоний диаметром 1-2 мм на газонах всех исследуемых культур 14 штаммов B.mallei.

Одновременно было выяснено, что бактериофаг, содержащийся в хлороформном лизате В. cepacia B623, не лизировал ни одну из исследованных мелиоидозных культур.

Таким образом, установлено, что спонтанно продуцируемый бактериофаг штамма В. cepacia B623 лизирует культуры всех исследованных штаммов патогенного гетерологичного вида - возбудителя сапа с образованием негативных колоний и не лизирует ни одну из исследованных культур возбудителя мелиоидоза.

При электронной микроскопии был обнаружен фаг с гексагональной головкой и сравнительно длинным отростком, имеющим наружный чехол, отнесенный согласно классификации Тихоненко А.С. к V морфологической группе.

При подкожном заражении золотистых хомячков и белых мышей суточной агаровой культурой в дозе 1×10⁸ м.к./мл гибель животных не наступала в течение 30 сут (срок наблюдения). В конце опыта животных усыпляли хлороформом, вскрывали с целью выделения культуры и делали посевы из внутренних органов отпечатками на МПА. Посевы инкубировали в течение 5 сут при 37°С. По окончании срока инкубации рост микроорганизмов не обнаруживали.

Данный штамм В. cepacia B623 принят на депонирование 27 декабря 2006 г. в Государственную коллекцию патогенных бактерий «Микроб», в которой ему присвоен номер B.cepacia KM 203.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Определение культурально-морфологических свойств B.cepacia КМ 203.

Для культивирования штамма используют общепринятые в исследованиях бурхольдерий плотные или жидкие питательные среды на основе мясо-пептонного или триптиказо-соевого бульонов.

Через 24-48 ч на плотных питательных средах вырастают однородные колонии диаметром 3-5 мм в S-форме кремового цвета; в жидких питательных средах через 24-48 ч культуры вызывают помутнение среды и образование пленки на поверхности.

Клетки В.cepacia KM 203 окрашиваются по Грамму отрицательно, при световой микроскопии имеют форму палочек, не образующих спор; в «раздавленной» капле бактерии подвижны.

Пример 2. Исследование штамма В. cepacia на наличие бактериофага, лизирующего культуры сапа.

Для выявления спонтанной фагопродукции у штамма В. cepacia KM 203 в качестве индикаторного штамма использовали B. mallei 10230. Лизирующую активность фага в отношении индикаторных культур определяли по образованию негативных колоний, используя метод агаровых слоев по Грациа.

Штамм B. cepacia KM 203 обладал спонтанной фагопродукцией, бактериофаг, лизирующий культуры сапа, продуцировался в титре 10^-5.

Выявленный фаг лизировал все 14 штаммов B. mallei, имеющихся в коллекции.

Пример 3. Электронно-микроскопическое изучение морфологии фага В. cepacia KM 203.

Для электронно-микроскопического изучения морфологии фага B. cepacia KM 203 использовали суспензию, приготовленную методом смыва фаговых частиц с поверхности негативных колоний. Суспензию в объеме 0,3-0,5 мл собирали пипеткой и помещали на предметное стекло, затем в этот объем добавляли 1% раствор цитрата свинца. После 1-2 мин экспозиции часть суспензии наносили на сетку-подложку с формварной клеткой и подвергалась микроскопированию в электронном микроскопе JEM-100 SX при инструментальном увеличении 30-50 тыс.

Были обнаружены фаги с гексагональной головкой и сравнительно длинным отростком, имеющим наружный чехол, которые были отнесены к V морфологической группе по классификации Тихоненко А.С.

Пример 4. Определение вирулентности штамма B. cepacia KM 203.

Вирулентность штамма проверяли на двух видах лабораторных животных - золотистых хомячках и белых мышах. Заражение животных производили подкожно взвесью суточной агаровой культуры в дозе 1×10⁸ м.к./мл. За животными наблюдали в течение 1 месяца от момента заражения. В течение срока наблюдения гибель животных не наступала. В конце опыта животных усыпляли хлороформом, вскрывали и проводили с целью выделения культуры посевы из внутренних органов отпечатками на МПА. Посевы инкубировали в течение 5 сут при 37°С. По окончании срока инкубации рост микроорганизмов не обнаруживали.

Таким образом, установлено, что штамм В. cepacia KM 203 спонтанно продуцирует бактериофаг, лизирующий с образованием негативных колоний культуры всех исследованных штаммов патогенного гетерологичного вида - возбудителя сапа и не лизирует ни одну из исследованных культур возбудителя мелиоидоза. Штамм В. cepacia KM 203 не вирулентен для белых мышей и золотистых хомячков (LD₅₀>10⁸ м.к.); обладает характерными для вида В.cepacia культурально-морфологическими свойствами и спектром биохимической активности.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается штамма Burkholderia cepacia, способного продуцировать бактериофаг, лизирующий культуру возбудителя сапа Burkholderia mallei. Штамм депонирован в коллекции РосНИПЧИ «Микроб», и ему присвоен номер Burkholderia cepacia KM 203. Штамм не вирулентен для белых мышей и золотистых хомячков, обладает характерными для вида B.cepacia культурально-морфологическими свойствами и спектром биохимической активности.

Штамм бактерий Burkholderia cepacia KM 203 (коллекция РосНИПЧИ «Микроб») - авирулентный продуцент бактериофага, лизирующего возбудителя сапа.