СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММУННОЙ МУЛЬТИВАЛЕНТНОЙ СЫВОРОТКИ ПРОТИВ ПНЕВМОЭНТЕРИТОВ МОЛОДНЯКА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ВИРУСНОГО ГЕНЕЗА Российский патент 2010 года по МПК A61K39/42 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам приготовления иммунной мультивалентной сыворотки против пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота (КРС) вирусного генеза, и может быть использовано для иммунокоррекции при помощи заместительной иммунотерапии материнскими антителами и создания пассивного иммунитета у телят при тяжелом поражении респираторно-кишечными инфекциями вирусного происхождения.

Уровень техники

Известен способ получения иммунной сыворотки, включающий иммунизацию животных, обескровливание их для отбора сыворотки, в котором, с целью повышения выхода сыворотки путем использования костно-мышечной ткани животных, после обескровливания животных тушки с удаленными внутренними органами и кожей подвергают замораживанию-оттаиванию с последующим измельчением и отжатием из них крови. (см. авт. св. SU №533102, кл. А61K 35/16, А61K 35/34, опубл. 20.03.2000 г.)

Недостатком данного способа является невысокая эффективность действия полученной иммунной сыворотки.

Известен способ получения иммунной сыворотки, включающий введение антигена в смеси с адъювантом Фрейнда в подколенные лимфоузлы и повторную иммунизацию антигеном внутримышечно и внутривенно с последующим выделением сыворотки, в котором, с целью получения моноспецифической сыворотки к тейхоевой кислоте стафилококков, в качестве антигена используют тейхоевую кислоту стафилококков, которую вводят внутривенно с аутологичной кровью, обработанной гепарином (см. авт. св. SU №1775908, кл. А61K 39/395, опубл. 15.08.1994 г.).

Недостатком этого способа является сложность получения препарата и недостаточная эффективность действия полученной иммунной сыворотки.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту и принятым авторами за прототип является способ приготовления иммунной мультиливалентной сыворотки против пневмоэнтеритов молодняка КРС, заключающийся в выборе доноров, отборе крови от доноров, обработке ее и получении сыворотки из крови с последующим исследованием на безвредность и активность полученной сыворотки, при этом основными этапами получения сыворотки являются: хранение крови при комнатной температуре 5-6 часов, хранение крови при 0-(+4)С° 48-72 часа, отсос сыворотки в стерильные емкости, карболизация фенолом до конечной концентрации 0,5%, стерилизация фильтрацией через пластинки «СФ», расфасовка, этикировка, контроль стерильности, безвредности, активности (см. Методические рекомендации по диагностике и лечебно-профилактическим мероприятиям при вирусных респираторных заболеваниях крупного рогатого скота, Южное отделение ВАСХНИЛ, НИИ экспериментальной ветеринарии, Харьков, 1979, с.41).

Недостатками данного способа являются:

- применение для консервации сыворотки раствора фенола, который по своим химическим характеристикам является высокотоксичным веществом;

- при проверке сыворотки на активность применение несколько видов различных серологических реакций (РСК, РНВГ, РЗГА) с различными сроками и формой учета титров;

- отбор крови от доноров различных половозрастных групп (не родственных), содержащей антитела, соответствующие только общему вирус-бактериальному фону хозяйства, и практически не имеющей специфических родственных (материнских) антител, оптимально приемлемых организмом реципиента.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа приготовления иммунной мультивалентной сыворотки против пневмоэнтеритов молодняка КРС вирусного генеза, обладающей:

- высокой активностью специфических антител;

- отсутствием токсических веществ, вводимых в организм животного;

- точно определенной активностью;

- ускоренным сроком приготовления;

- ускоренным сроком и эффективностью действия ее в организме против ассоциированных инфекций вирусного генеза;

- простотой приготовления.

Технический результат, который может быть получен с помощью предлагаемого изобретения, сводится к исключению использования токсических веществ, точности определения активности сыворотки, ускорению сроков ее приготовления, повышению чувствительности при определении наличия и титра антител к заболеваниям.

Технический результат достигается с помощью способа приготовления иммунной мультивалентной сыворотки против пневмоэнтеритов молодняка КРС вирусного генеза, включающего выбор доноров, отбор донорской крови, выдерживание при комнатной температуре для свертывания, отделение сгустка крови, обработку сыворотки, размещение в холодильнике, проведение контроля на безвредность и активность, расфасовку стерильной емкости, при этом в качестве доноров используют материнскую или близкородственную группу крупного рогатого скота, ранее переболевшую вирусными респираторно-кишечными инфекциями, причем предварительно исследуют кровь и сыворотку на выявление или ранее регистрируемые пневмоэнтериты вирусного генеза путем реакции непрямой гемагглютинации, затем кровь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа и помещают в холодильник при температуре 4-6°С на 12-16 часов для полной ретракции кровяного сгустка, после проведения контроля емкости снаружи обрабатывают 1%-ным раствором средства «Жавель-солид», откупоривают в стерильном помещении, центрифугируют, фильтруют и сливают в стерильные емкости, затем облучают ультрафиолетовыми лучами с длиной 254-256 нм в течение 1 часа и озонируют кровь в режиме закрытого контура.

Таким образом, технический результат достигается за счет того, что в способе приготовления иммунной мультивалентной сыворотки в качестве основных компонентов используют материнскую или родственную высокоимунную сыворотку от ранее переболевших вирусными респираторно-кишечными инфекциями коров, причем ее компоненты могут произвольно меняться в зависимости от того, по каким вирусным респираторно-кишечным инфекциям неблагополучно то или иное хозяйство, при приготовлении сыворотки полностью исключается применение химических бактерицидных препаратов (например мертиолят, фенол и пр.), чем полностью исключается токсичность препарата, применение реакции непрямой гемагглютинации, позволяющей единовременно, в короткий срок определить титр антител сразу на все респираторно-кишечные вирусные инфекции, что значительно сокращает время приготовления сыворотки, наличие в сыворотке специфических антител доноров родственных групп, быстрое, оптимальное усвоение препарата организмом реципиента.

Сущность способа приготовления иммунной мультивалентной сыворотки против пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота (КРС) вирусного генеза заключается в следующем. Отбор донорской группы животных проводят после тщательного эпизоотического обследования хозяйства и установления причины заболевания телят и типа его возбудителя. Доноров для приготовления сыворотки отбирают из матерей или близкородственных групп животных, где содержатся матери больных телят. Отбор проводят из расчета титра антител на проблемное заболевание. При этом предварительно исследуют кровь и сыворотку на выявление или ранее регистрируемые пневмоэнтериты вирусного генеза путем реакции непрямой гемагглютинации, затем кровь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа и помещают в холодильник при температуре 4-6°С на 10-12 часов для полной ретракции кровяного сгустка, после ретракции емкости снаружи обрабатывают 1%-ным раствором средства «Жавель-солид», откупоривают в стерильном помещении, центрифугируют, фильтруют и сливают в стерильные емкости. Затем пропускают через аппарат УФО и озонирования крови «НАДЕЖДА-О» со встроенными ртутно-кварцевыми лампами, излучающими ультрафиолетовые волны короткого диапазона (80% - 254 нм) в режиме закрытого контура. Процедура производится с предварительно подготовленным стерильным флаконом (объем 450 мл, заполненным сывороткой до 300 мл для замещения воздуха кислородом при сохранении герметичной упаковки), кислород из флакона с помощью встроенного роликового насоса аппарата прокачивается через камеру облучателя и возвращается во флакон. Способ обеспечивает достижение концентрации 1200 мкг/л озона, обладающего сильным бактерицидным эффектом, за 20 минут. Таким образом, стерильность достигается не только обработкой сыворотки крови озоном, но и дополнительным ультрафиолетовым облучением.

Кроме того, остаточный озон, содержащийся в сыворотке, при введении стимулирует окислительно-восстановительные процессы окружающих тканей, чем улучшает и ускоряет ее усвоение организмом.

Примеры конкретного выполнения способа приготовления иммунной мультивалентной сыворотки против пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота вирусного генеза.

Пример. Отбор донорской группы животных проводят после тщательного эпизоотического обследования хозяйства и установления причины заболевания телят и типа возбудителя.

Доноров для приготовления сыворотки отбирают из матерей или близкородственных групп животных, где содержатся матери больных телят. Для этого от клинически здоровых коров, прошедших полную диспансеризацию и весь курс профилактических исследований, предварительно отбирают 10 мл крови, и сыворотку исследуют методом реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) на выявленные или ранее регистрируемые в хозяйстве пневмоэнтериты вирусного происхождения.

Перед формированием донорской группы животных по результатам исследования проводят отбор животных. Отбор проводят из расчета титра антител на проблемное заболевание. Чем выше титр антител, а следовательно, и выше их количество в сыворотке, тем больше это животное подходит для отбора донорской крови. Расчет необходимого титра, обеспечивающего более или менее стабильный иммунитет у теленка, рассчитывают по наличию антител к определенному заболеванию у группы больного молодняка и общему иммунному фону (для определения наличия циркуляции этих заболеваний в хозяйстве на данный момент). В этом случае во внимание берут не величину титров антител у телят, а их наличие, т.к. у большинства больных и ослабленных телят гуморальный иммунитет очень низкий и выработка антител может быть незначительной.

Так, в хозяйствах Ставропольского края у наибольшего процента телят выявлены антитела к (по убыванию) хламидиозу парагриппу-3, респираторно-синцитиальной инфекции и инфекционному ринотрахеиту, в меньшей степени - к аденовирусной инфекции. Для ранее регистрируемой в хозяйстве вирусной диарее ни клинических признаков, ни антител у телят выявлено не было. Но антитела к возбудителю вирусной диареи КРС в невысоких титрах были обнаружены у нескольких коров, которые тоже были отобраны в донорскую группу.

Следовательно, и матери-доноры подбираются соответственно указанному списку заболеваний. Для остальных вирусных заболеваний, которые были ранее зарегистрированы в данных хозяйствах, но антител к ним у телят не обнаружено, было достаточно невысоких титров донорских антител для создания профилактического иммунного фона.

Аналогичный отбор проводят по любым другим проблемным вирусным инфекциям. При отборе в группу клинически здоровых, прошедших общее диспансерное обследование матерей-доноров были отобраны животные, у каждого из которых высокие титры отмечают не менее чем по двум проблемным заболеваниям. После формирования группы доноров проводят отбор донорской крови в пределах 800-1200 мл от одного животного. Кровь отбирают стерильной иглой с гибкой полиуретановой или силиконовой трубкой в стерильные емкости (сосуды, банки) объемом 2000 см³ с широким горлом. Сосуды заполняют не более чем на 2/3. Индивидуальности отбора не придерживаются. Кровь выдерживают 1 час при комнатной температуре, затем ставят в холодильник при температуре 4-6°С на 10-12 часов для полной ретракции кровяного сгустка, после ретракции емкости снаружи обрабатывают 1%-ным раствором средства «Жавель-солид», откупоривают в стерильном помещении, центрифугируют, фильтруют и сливают в стерильные емкости. Затем пропускают через аппарат УФО и озонирования крови «НАДЕЖДА-О» со встроенными ртутно-кварцевыми лампами, излучающими ультрафиолетовые волны короткого диапазона (80% - 254 нм) в режиме закрытого контура. Процедуру проводят с предварительно подготовленным стерильным флаконом (объем 450 мл, заполненным сывороткой до 300 мл для замещения воздуха кислородом при сохранении герметичной упаковки), кислород из флакона с помощью встроенного роликового насоса аппарата прокачивают через камеру облучателя и возвращают во флакон. Способ обеспечивает достижение концентрации 1200 мкг/л озона, обладающего сильным бактерицидным эффектом, за 20 минут. После этого из каждого флакона отбирают по 1-2 мл сыворотки стерильным шприцем в общую пробирку. Отобранную сборную пробу исследуют на стерильность в соответствии с ГОСТ 28085-89. Одновременно ставят биопробу на белых мышах для исключения токсичности препарата. Эта же сборная сыворотка дополнительно исследуется в РНГА на все проблемные вирусные инфекции. Общий титр на каждое заболевание регулярно фиксируется в рабочем журнале. Для иммунизации используется только стерильная и нетоксичная сыворотка с оптимальными титрами антител. Применение иммунной мультивалентной сыворотки для пассивной лечебно-профилактической иммунизации молодняка КРС, показано на примере.

Иммунную мультивалентную сыворотку применяют для пассивной лечебно-профилактической иммунизации молодняка КРС с 3-4-недельного возраста в лечебной дозе 0,5-0,7 мл на 1 кг живой массы теленка. Вводят подкожно однократно 1 раз в 18-20 дней до пяти-шести-месячного возраста в зависимости от формы и тяжести заболевания, общего состояния и веса животного, в профилактических дозах 0,3-0,5 мл/кг соответственно. При осложнении вирусной инфекции секундарной бактериальной флорой мультивалентную сыворотку применяют в сочетании с антибиотиками после выявления бактериального ПБА, определения его чувствительности с предварительной подтитровкой антибиотика. Сыворотку, приготовленную предложенным способом, используют в ряде хозяйств Ставропольского края с выраженным лечебным эффектом, так, при систематическом ее использовании в к-зе п/з «Кубань» Кочубеевского района: после 3-4-кратного введения сыворотки телятам 1-2-месячного возраста, их падёж сократился на 20%, при введении ее группе больных 3-4-месячных телят - на 30%, после регулярного применения в течение 6 месяцев - на 60-70%, к концу года падёж телят от вирусных респираторно-кишечных инфекций прекратился совсем.

Предлагаемое изобретение по сравнению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества:

- полное исключение попадания с препаратом в организм реципиента токсических веществ;

- высокая активность специфических антител в получаемой сыворотке;

- единый метод и точность определения активности сыворотки;

- более быстрое и оптимальное усвоение препарата организмом реципиента за счет оксигенации тканей организма и усиления обменных процессов в них на месте введения озонированной сыворотки;

- ускоренный срок действия и более результативный терапевтический эффект за счет более повышенных концентраций антител против возбудителей респираторно-кишечных инфекций вирусной этиологии;

- простота приготовления указанной сыворотки.

Изобретение относится к области ветеринарии и биотехнологии. Способ включает выбор доноров, отбор донорской крови, выдерживание при комнатной температуре для свертывания, отделение сгустка крови, обработку сыворотки, размещение в холодильнике, проведение контроля на безвредность и активность, расфасовку в стерильные емкости. При этом в качестве доноров используют материнскую и близкородственную группу крупного рогатого скота, ранее переболевшую вирусными респираторно-кишечными инфекциями, причем предварительно исследуют сыворотку на наличие антител к ранее регистрируемым пневмоэнтеритам вирусного генеза путем постановки реакции непрямой гемагглютинации. Затем кровь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 часа и помещают в холодильник при температуре 4-6°С на 12-16 часов для полной ретракции кровяного сгустка. После проведения контроля сыворотки на безвредность и активность, емкости снаружи обрабатывают 1%-ным раствором средства «Жавель-солид», откупоривают в стерильном помещении, фильтруют, центрифугируют и сливают в стерильные емкости. Затем сыворотку облучают ультрафиолетовыми лучами с длиной 254-256 нм в течение 1 часа и озонируют в режиме закрытого контура. Способ не использует токсические вещества, повышает точность определения активности сыворотки и ускоряет сроки ее приготовления, а полученная данным способом сыворотка обладает высокой специфичностью и стерильностью.

Способ приготовления иммунной мультивалентной сыворотки против пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота вирусного генеза, включающего выбор доноров, отбор донорской крови, выдерживание при комнатной температуре для свертывания, отделение сгустка крови, обработку сыворотки, размещение в холодильнике, проведение контроля на безвредность и активность, расфасовку в стерильные емкости, отличающийся тем, что в качестве доноров используют материнскую и близкородственную группу крупного рогатого скота, ранее переболевшую вирусными респираторно-кишечными инфекциями, причем предварительно исследуют сыворотку на наличие антител к ранее регистрируемым пневмоэнтеритам вирусного генеза путем постановки реакции непрямой гемагглютинации, затем кровь выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч и помещают в холодильник при температуре 4-6°С на 12-16 ч для полной ретракции кровяного сгустка, после проведения контроля на безвредность и активность емкости снаружи обрабатывают 1%-ным раствором средства «Жавель-солид», откупоривают в стерильном помещении, фильтруют, центрифугируют и сливают в стерильные емкости, затем сыворотку облучают ультрафиолетовыми лучами с длиной 254-256 нм в течение 1 ч и озонируют в режиме закрытого контура.