ИНАКТИВИРОВАННАЯ БИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ И АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ И АДЕНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/295 A61P31/12 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к получению инактивированных вакцин против респираторно-кишечной патологии крупного рогатого скота, вызываемой вирусами адено- и вирусной диареи.

Вирусная диарея и аденовирусная инфекция крупного рогатого скота - остро протекающие, контагиозные вирусные болезни, главным образом, телят, характеризующиеся поражением органов респираторно-кишечного тракта. Болезни регистрируются во всех странах мира, в том числе и в России. Вирусы вызывают заболевания у крупного рогатого скота, поражая от 40-60 % животных и обуславливая в 20-30 % случаев вспышки респираторно-кишечных болезней. Как правило, данные вирусы вызывают заболевания в ассоциации в 80-85 % случаях, при этом смертность телят достигает 27-30 % (1).

Известна вакцина для профилактики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, включающая антигены аденовируса КРС штамм В-10, который инактивировали димером этиленимином (ДЭИ) в конечной концентрации 0,1 % и в качестве адъюванта использовали аэросил (2).

Известны также вакцины для специфической профилактики вирусной диареи, включающие антигены вируса диареи КРС штаммы Оригон, С-24 V, Нью-Йорк, которые инактивировали формалином и в качестве адъюванта была использована гидроокись алюминия (3).

Вакцины обладают высокой эффективностью, однако они имеют ряд недостатков. Так, например, вакцины применяют раздельно, что связано с огромными затратами труда ветеринарных специалистов, многократным беспокойством животных, созданием у них стрессового состояния, что неблагоприятно отражается на иммунологической реактивности животных к прививке.

В задачу наших исследований входит получить вакцину, обеспечивающую создание длительного напряженного иммунитета в организме животного против аденовирусной инфекции и вирусной диареи КРС и не обладающую реактогенными свойствами.

Поставленная задача достигается тем, что инактивированная бивалентная вакцина против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота включает в себя антигены аденовируса первого серотипа В-10 с инфекционным титром 6-7 lg ТЦД₅₀/мл, штамма «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 17-8 lg ТЦД ₅₀/мл, инактивированных формалином, концентрированных в 5 раз полиэтиленгликолем 6000 и депонированных на гидроокиси алюминия при следующем соотношении компонентов (об. %):

антиген аденовируса КРС первого   типа В-10 с инфекционным титром   6-7 lg ТЦД ₅₀/мл концентрированный в 5 раз;   10 % ПЭГ- 6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCI 30-37 антиген вируса вирусной диареи КРС штамма «Оригон»   с инфекционным титром 7-8 lg. ТЦД₅₀/мл;   концентрированный в 5 раз 8-9 % ПЭГ-6000   в растворе 0,5-0,6 М NaCI 30-37 формалин 40% 0,5-0,8 гидроокись алюминия афицинальная 6,0 % остальное.

Пример

Для приготовления инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота берут вируссодержащий материал аденовируса первого серотипа В-10 с инфекционным титром 6-7 lg ТЦД ₅₀/мл (Тканевых Цитопатических Доз), полученную вируссодержащую суспензию инактивируют формалином в конечной концентрации 0,2-0,3 % и концентрируют в 5 раз исходного объема полиэтиленгликолем 6000 в конечной концентрации 10,0 %. Далее берут антиген вируса вирусной диареи КРС штамм «Оригон», полученный из вируссодержащей суспензии с инфекционным титром 7-8 lg ТЦД ₅₀/мл, инактивируют формалином 0,2-0,3 % конечной концентрации при температуре 37-38°С в течение 72 часов при рН 7,2-7,4. Полученные антигены концентрируют полиэтиленгликолем (ПЭГ 6000) в конечной концентрации 8 % и ресуспендируют в 0,5-0,6 М NaCl, затем антигены смешивают в равных объёмах 1:1 и добавляют официнальный адъювант 6 % ГОА до 2-3 % конечной концентрации в полученной вакцине.

Конкретные примеры приготовления вакцины отражены в табл.1.

Для определения безвредности вакцины использовали два вида лабораторных животных - белых мышей весом 15-18 г и кроликов весом 2,5 кг. Вакцину вводили внутримышечно однократно в дозе 0,2 и 1 мл соответственно. В течение 10-дневного наблюдения вакцинированные животные оставались живыми, на месте введения вакцины не образовывалось некроза тканей. Таким образом, вакцина предложенного состава полностью безвредна для животных, данные представлены в таблице 3.

Испытание эффективности вакцины с различными соотношениями компонентов проводили на лабораторных крысах. Вакцину в указанных в табл. 1. концентрациях вводили животным двукратно с интервалом 14 дней, внутримышечно в дозе 0,2 мл. Формировали пять опытных групп. Вакцину каждой концентрации вводили 5-ти крысам. Первой группе вводили с минимальными значениями компонентов, второй группе - оптимальное, третьей - максимальное, четвертой меньше минимального и пятой - больше максимального.

Кровь для определения уровня специфических антител брали из сердца до иммунизации (фон) и через две недели после последней вакцинации. Титр специфических антител определяли в реакции нейтрализации на культуре клеток (РН). При этом уровни специфических антител при оптимальной и максимальной концентрациях компонентов существенно не отличались, а дальнейшее увеличение концентрации компонентов не приводило к увеличению уровней специфических антител. Использование для иммунизации вакцины в дозах меньше минимальных оказалось неэффективным, так как не вызывало выработку антител в титрах, обеспечивающих защиту против этих инфекций.(табл. 1)

Уровень специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных представлен в табл. 2 ( минимальное, оптимальное и максимальное).

Способ профилактики аденовирусной инфекции и вирусной диареи КРС с помощью предложенной вакцины заключается в следующем.

Иммунизацию крупного рогатого скота проводили по следующей схеме.

Три группы клинически здоровых телят, не содержащих в сыворотке крови специфических антител (по 5 голов в группе, всего 15 животных). Животным первой группы вводили инактивированную бивалентную вакцину против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота внутримышечно дважды с интервалом 14 дней по 1 мл. Животным второй и третьей группы вводили в соответствии с утвержденными наставлениями по применению коммерческие моновакцины против аденовируса и вируса вирусной диареи внутримышечно по 10 мл двукратно с интервалом 14 дней. Через 14 дней после второй иммунизации от всех животных брали пробы крови из яремной вены в количестве 5-8 мл. Результаты представлены в табл. 3.

Активность вакцин по уровню антител в сыворотке крови телят к аденовирусу и вирусу ВД КРС представлены в табл. 4.

Таким образом, в крови животных иммунизированных предложенной вакциной, отмечался не только более высокий уровень специфических антител к вирусу вирусной диареи и аденовирусу крупного рогатого скота, но и удалось уменьшить дозу вакцины в десять раза, что, в свою очередь, обеспечивало защиту животных сразу против двух инфекций с меньшими трудозатратами.

Предложенную вакцину вводят животным внутримышечное двукратно с интервалом 13-16 дней в дозе 1 мл.

Высокая профилактическая активность предложенной вакцины по сравнению с известными вакцинами того же назначения была подтверждена испытаниями, проведенными в условиях животноводческих хозяйств, и обеспечивает длительный (не менее б месяцев) напряженный иммунитет, не обладает реактогенными свойствами.

Вакцина апробирована нами с положительным результатом с 2004-2007 гг. на кафедре ветеринарной вирусологии московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им К. И Скрябина и хозяйстве «ООО Аграрное» Орехово-Зуевского района.

Полученная вакцина позволит снизить экономический ущерб, причиняемый данными вирусами животноводству Российской Федерации, и найдет применение в неблагополучных хозяйствах.

Источники информации

1. Автореф. дисс. к.в.н. Курбанбекова З.Д. Эпизоотическая ситуация по респираторно-кишечным болезням молодняка крупного и мелкого рогатого скота в центральных районах Таджикистана. М.: - 2007 гг.- с. 9.

2. Дисс. к.б.н. Литвинов О.Б. Экспериментальные исследования по разработке инактивированной вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота. М.: - 1984 гг.- с.39.

3. Книга. Сюрин В.Н. Вирусные болезни животных. М.-ВНИТИБП.-1998 гг.- с.139.

ТАБЛИЦА 1 Антигенная активность инактивированной бивалентной вакцины против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота показатели Изготовление вакцины С минимальными значениями параметров С оптимальными значениями параметров С максимальными значениями Со значениями параметров Ниже мини-альных Выше максимальных штамм «Оригон» вируса вирусной диареи с инфекционным титром 7 lg ТЦД ₅₀/мл 7,75 lg ТЦД ₅₀/мл 8 lg ТЦД ₅₀/мл 6 lg ТЦД ₅₀/МЛ 8,5 lg ТЦД ₅₀/мл инактивацию проводят формалином концентрации 0,2 %при температуре 0,2% 0,25% 0,3% 0,1% 0,35% 37°С 37,5°С 38°С 36°С 38°С полученный антиген штамма «Оригон» концентрируют полиэтиленгликолем в растворе 0,5-0,6 М NaCl 8% 8,5% 9% 7,5% 9,5% 0,5 М 0,55 М 0,6 М 0,4 М 0,7 М адъювант ГОА в концентрации до 2% до 2,5% до 3% до 1,5% до 3,5% Стабильность вакцины при хранении Не менее 12 месяцев Не менее 12 месяцев Не менее 12 месяцев Менее 12 месяцев Не менее 12 месяцев Антигенная активность вакцины. Титр антител
1:64-1:128 Титр антител
1: 1024-1:4096 Титр антител
1: 1024-1:4096 Титр антител
1:16-1:32 Титр антител
1:32-1:128 Безвредность. безвредная безвредная безвредная безвредная безвредная Стерильность. стерильная стерильная стерильная стерильная стерильная Иммуногенность 85-90% 85-90% 85-90% 60% 74%

Таблица 2 Уровень специфических антител в сыворотке крови иммунизированных крыc Бивалентная вакцина против аденовирусной инфекции и вирусной диареи КРС Титры антител при иммунизации 1 группа, доза 0,1 мл 2 группа, доза 0,2 мл 3 группа, доза 0,4 мл фон 21сут после последней иммунизации фон 21 сут после последней иммунизации фон 21 сут после последней иммунизации К аденовирусу 0 1:64 0 1:256 0 1:512 К вирусу диареи КРС 0 1:32 0 1:256 0 1:256

Таблица 3
Исследование предложенной вакцины на безвредность Наименование вакцины Кол-во животных Дни наблюдения (гибель животных) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Инактивированная Бивалентная вакцина против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота Белые мыши и крысы Минимальная концентрация 5 - - - - - - - - - - Оптимальная концентрация 5 - - - - - - - - - - Максимальная концентрация 5 - - - - - - - - - -

Таблица 4 Исследование антителообразования в сыворотке крови телят Вид антигена Уровень специфических антител при иммунизации предложенная Протатипы (моновакцины) Вакцина против аденовирусной инфекции КРС Вакцина против вирусной диареи КРС фон После иммуниза
ции фон После иммунизации фон После иммунизации Аденовирус 0 1:512 0 1:128 0 0 Вирус вирусной диареи 0 1:256 0 0 0 1:128

Группа изобретений относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина включает антиген аденовируса первого серотипа В-10, инактивант, адъювант концентрированный ПЭГ-6000 в конечной концентрации 10%. Дополнительно вакцина содержит антиген вируса вирусной диареи «Оригон», концентрированный 8-9% ПЭГ-6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCl. В качестве инактиванта вакцина содержит афицинальный формалин, а в качестве адъюванта афицинальную ГОА, при этом компоненты входят в состав вакцины в следующем соотношении (об.%): антиген аденовируса первого типа В-10 с инфекционным титром 6-7 lg ТЦД₅₀/мл, концентрированный 5 раз ПЭГ-6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCl - 30-37, антиген вируса вирусной диареи штамма «Оригон» с инфекционным титром 7-8 lg ТЦД₅₀/мл, концентрированный 5 раз ПЭГ-6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCl - 30-37, формалин 40% - 0,5-0,8, ГОА афицинальная 6,0% остальное. Вакцину вводят телятам внутримышечно двукратно с интервалом 13-16 дней в дозе 1,0 мл. Вакцина имеет высокую профилактическую активность. 4 табл.

1. Инактивированная бивалентная вакцина против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, включающая антиген аденовируса первого серотипа В-10, инактивант, адъювант концентрированный ПЭГ-6000 в конечной концентрации 10%, отличающаяся тем, что вакцина дополнительно содержит антиген вируса вирусной диареи «Оригон», концентрированный 8-9% ПЭГ-6000 в растворе 0,5-0,6 М NaCl, в качестве инактиванта - афицинальный формалин, а в качестве адъюванта - афицинальная ГОА, при этом компоненты входят в состав вакцины в следующем соотношении, об.%:
антиген аденовируса первого типа В-10 с   инфекционным титром 6-7 lg ТЦД ₅₀/мл,   концентрированный 5 раз ПЭГ-6000   в растворе 0,5-0,6 М NaCl 30-37 антиген вируса вирусной диареи штамма «Оригон»   с инфекционным титром 7-8 lg ТЦД ₅₀/мл,   концентрированный 5 раз ПЭГ-6000 в растворе   0,5-0,6 M NaCl 30-37 афицинальный формалин 0,5-0,8 ГОА афицинальная остальное

2. Способ профилактики аденовирусной инфекции и вирусной диареи КРС, включающий введение вакцины, охарактеризованной в п.1, которую вводят телятам внутримышечно двукратно с интервалом 13-16 дней в дозе 1,0 мл.