СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОБ КРОВИ С ЭКСТРАКТАМИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ Российский патент 2010 года по МПК G01N33/50 G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при приготовлении проб крови с экстрактами пищевых продуктов, преимущественно для диагностики индивидуальной чувствительности организма к пищевым продуктам, создания индивидуальных диет и повышения защитных функций организма.

Известны способы приготовления проб крови с пищевыми продуктами, при которых проводят отбор крови у пациента с выделением клеток, например, белых клеток крови, смешивают ее с подготовленным пищевым продуктом - аллергеном (антигеном) и проводят инкубацию (например, WO 93/25904 А1, 1993; WO 95/15494 А1, 1995; US 5147785 A, 1992; FR 2467401 A, 1981). Приготовленные пробы используют для определения пищевой аллергии человека на основании их последующего анализа. Однако такие способы трудоемки, так как требуют, в частности, сложного процесса выделения клеток. Полученные пробы недостаточно информативны и не позволяют обеспечить высокую степень достоверности получаемых в результате последующего анализа результатов.

Известен, например, способ приготовления проб крови с экстрактами пищевых продуктов, при котором к 100 мкл капиллярной или венозной крови пациента, содержащей антикоагулянт, например, 10% 3,2%-го раствора цитрата натрия в забуференном физиологическом растворе, добавляют 10 мкл соответствующего экстракта; смесь перемешивают, инкубируют в течение часа и помещают в стандартные капилляры (RU 2152616 С1, 2000). Приготовленные таким образом пробы используются для диагностики индивидуальной чувствительности организма к пищевым продуктам путем измерения и анализа скорости оседания эритроцитов. Однако такие пробы не обеспечивают высокой точности последующего анализа.

Из известных способов наиболее близким к предложенному является способ приготовления проб крови с экстрактами пищевых продуктов, состоящий из подготовки исходной крови, включающей отбор цельной крови у пациента, добавление к ней антикоагулянта, выдержку в течение 1-3 часов и ее перемешивание, подготовки раствора экстракта пищевого продукта, включающей предварительную обработку исходного пищевого продута и последующую вытяжку физиологическим раствором с добавлением антиоксиданта, и смешивания подготовленных исходной крови и раствора экстракта пищевого продукта, включающего добавление к подготовленной исходной крови подготовленного раствора экстракта пищевого продукта в количестве 4-12 об.% с последующим их инкубированием при одновременном перемешивании (RU 2216735 С1, 2003). Приготовленные пробы используются для диагностики индивидуальной чувствительности организма к таким пищевым продуктам на основе анализа величины скорости оседания эритроцитов в капиллярах с тестовыми смесями и в контрольной смеси. При подготовке исходной крови в этом способе не предусматривается ее эффективная изоляция от внешней среды. В качестве исходного пищевого продукта в этом способе используют любые пищевые продукты или их смеси, характерные для данного ареала. При этом не оговорены иные требования при подготовке раствора экстракта пищевого продукта к самому пищевому продукту (наличия или отсутствия тепловой обработки, заморозки и т.д.).

Приготовленные таким способом пробы крови с экстрактами пищевых продуктов, однако, недостаточно информативны, что не позволяет обеспечить высокую достоверность и точность диагностики на основе последующих анализов таких проб.

Задача, решаемая изобретением, заключается в создании способа приготовления проб крови с экстрактами пищевых продуктов, лишенного недостатков прототипа. Технический результат, обеспечиваемый изобретением, состоит в повышении информативности проб крови с экстрактами пищевых продуктов за счет оптимизации условий и режимов приготовления проб при реализации отсутствия искажений результатов анализа и повышения стандартизации экстрактов. Это позволяет повысить достоверность и точность последующего анализа, например, диагностики индивидуальной чувствительности организма к пищевым продуктам.

Это достигается тем, что в способе приготовления проб крови с экстрактами пищевых продуктов, состоящем из подготовки исходной крови, включающей отбор цельной крови у пациента, добавление к ней антикоагулянта, выдержку в течение 1-3 часов и ее перемешивание, подготовки раствора экстракта пищевого продукта, включающей предварительную обработку исходного пищевого продукта и последующую вытяжку физиологическим раствором с добавлением антиоксиданта, и смешивания подготовленных исходной крови и раствора экстракта пищевого продукта, включающего добавление к подготовленной исходной крови подготовленного раствора экстракта пищевого продукта в количестве 4-12 об.% с последующим их инкубированием при одновременном перемешивании, в качестве исходного пищевого продукта используют гомогенат натурального пищевого продукта, не подвергшегося термообработке, при подготовке раствора экстракта пищевого продукта вначале приготавливают маточный раствор и определяют концентрацию белка в нем, а затем приготавливают на основе маточного раствора рабочий раствор путем разведения маточного раствора до рабочей концентрации раствором антиоксиданта в физиологическом растворе, при этом в качестве критерия степени разведения выбирают такое содержание белка, концентрация которого соответствует содержанию основного действующего белка в исходном пищевом продукте. В качестве антиоксиданта при приготовлении маточного и рабочего растворов могут использовать фенол в количестве 0,2 об.% раствора по отношению к физиологическому раствору или иные антиоксиданты. Концентрацию белка в маточном и рабочем растворах могут определять методом Бредфорда. Отбор цельной крови у пациента с последующей выдержкой могут осуществлять в одноразовые вакутейнеры. Перемешивание цельной крови после выдержки в вакутейнерах могут осуществлять путем их медленного переворачивания или медленного взбалтывания, затем, после переливания всего объема цельной крови в герметичную одноразовую пробирку, также путем ее медленного переворачивания или медленного взбалтывания.

Достижение указанного выше технического результата обеспечивается всей совокупностью существенных признаков.

В соответствии с предложенным способом подготавливают исходную кровь. Для этого отбирают цельную кровь у пациента, преимущественно венозную, в количестве, достаточном для проведения анализа, например, около 18 мл. Забор осуществляют в одноразовые пробирки - преимущественно в вакутейнеры (пробирки с откачанным до отрицательного давления воздухом) объемом 9-10 мл, содержащие антикоагулянт - например, 1 мл раствора 3,2% цитрата натрия. Вакутейнеры обеспечивают минимальное нежелательное взаимодействие отобранной крови с внешней средой. Количество пробирок с отбираемой кровью может составлять, например, две. Полученные образцы выдерживают в течение не менее одного часа и не более трех часов, что необходимо для того, чтобы кровь, как система, пришла в равновесное состояние после процесса ее забора из кровеносного русла. Указанные пределы определены экспериментально и являются объективными критериями (выход за которые приведет к недостоверным результатам исследования), обусловленными биохимическими процессами, протекающими в крови. Затем, перед смешиванием цельной крови с раствором экстракта пищевого продукта, ее перемешивают (без резкого взбалтывания), например, путем медленного переворачивания или аккуратного (медленного) взбалтывания вакутейнеров. Непосредственно перед смешиванием преимущественно переливают весь объем крови от одного пациента в одноразовую стерильную пластиковую пробирку, например, на 50 мл, которую закрывают герметичной крышкой и также медленно, без резкого взбалтывания, перемешивают, переворачивая ее или перебалтывая, например, качательными движениями, например, в течение одной минуты. Такое перемешивание позволяет получить высокую степень однородности и плотности подготовленной крови, что дополнительно способствует повышению точности последующего анализа проб.

В качестве исходного пищевого продукта для приготовления раствора его экстракта используют гомогенат натурального пищевого продукта, не подвергшегося термообработке. При этом преимущественно подбирают пищевой продукт из нескольких независимых источников для создания представительной выборки (например, от 5 до 10 источников), желательно характерных для ареала проживания конкретного пациента. Исходный пищевой продукт подвергают предварительной обработке, включающей, при необходимости, гигиеническую очистку и приготовление гомогената. Например, мясной или рыбный продукт моется, очищается, из него удаляются кости, жир, пленки; далее продукт пропускается через высокоскоростные электромясорубку или биологический диспергатор до получения гомогената (продукта, состоящего из мелких однородных фракций). Например, продукты, нуждающиеся в обзжиривании, вначале также проходят указанную обработку, затем промываются с помощью ацетонового или спиртового раствора, фильтруются, например, на воронке Бюхнера, и подсушиваются, например, в вакуум-эксикаторе (таким образом может приготавливаться, например, гомогенат из орехов). Например, крупы моют и сушат в потоке теплого воздуха феном, после чего проводят их помол в кофемолке. Например, овощи и фрукты моют, очищают от кожуры и семян, выделяют их съедобную часть и пропускают через миксер, кофемолку или деструктор. Например, в сыворотке или обезжиренном молоке в качестве подготовки достаточно проверить отсутствие нехарактерных фракций (осадка и др.) и при необходимости удалить их, а продукт поместить, например, в пластиковую центрифужную пробирку. Использование в качестве исходных пищевых продуктов гомогенатов натуральных пищевых продуктов, не прошедших термообработку (т.е. подготовленных для анализа свежих "сезонных" продуктов), способствует повышению точности анализа на индивидуальную чувствительность организма к таким продуктам, основанным на использовании приготовленных указанным образом проб. При этом обеспечивается стабильность результатов анализа и отсутствие их искажений, что является одной из основных составляющих повышения информативности проб.

Для подготовки экстракта пищевого продукта может использоваться принцип вытяжки продукта физиологическим раствором с добавкой любого антиоксиданта (например, WO 94/09824 А1, 1994; DE 2352724 A, 1975; US 4364938 A, 1982). В модификации этот метод в применении к предложенному способу может быть реализован преимущественно следующим образом. Для приготовления маточного раствора экстракта пищевого продукта к полученному гомогенату, помещенному в количестве 3-5 г в центрифужную пробирку, например, объемом 15 мл, добавляют 7-10 мл, например, 0,2% раствора фенола в физиологическом растворе. В качестве антиоксиданта могут использоваться и другие аналогичные по функции вещества - меркаптоэтанол, ионол и др. В качестве физиологического раствора может использоваться любой изотонический водный раствор, близкий к сыворотке крови, например, раствор Рингера-Локка и др. Такое соотношение экстракта и растворителя является оптимальным для получения маточного раствора любых пищевых продуктов (что выявлено опытным путем). Далее пробирку для прохождения вытяжки помещают преимущественно в ракель вортекса. Экстракцию осуществляют, например, в течение 24 часов при температуре 4°С. После прохождения экстракции полученную суспензию центрифугируют, например, в течение 20-30 минут при 4500 об/мин. Осадок отбрасывают. Надсадочную жидкость (супернатант) фильтруют преимущественно через мембранные фильтры, например, Millex GV с диаметром пор 0,45 мкм, и далее через фильтр с диаметром пор, например, 0,22 мкм в стерильную пробирку. В результате получают маточный раствор.

В маточном растворе определяют концентрацию белка. При этом может использоваться, как наиболее чувствительный и устойчивый, метод Бредфорд, основанный на реакции красителя с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками (например, Bredford M.M. A Rapid and Sensitive for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. "Anal. Biochem.", 1976, v.72, p.248-254). В модификации применительно к предложенному способу этот метод может быть реализован следующим образом. Приготавливают реактив Бредфорд - 0,05 г кумасси ярко-голубого G-250 растворяют в мерной колбе вместимостью 500 мл в 25 мл 95% спирта, прибавляют 50 мл 85% раствора ортофосфорной кислоты и доводят объем раствора водой до заданной метки. Далее, например, 0,1 мл препарата (маточного раствора), содержащего 0,01-0,10 мг белка, помещают в пробирку, прибавляют 5 мл реактива Бредфорд, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре от 2 до 60 мин. Далее измеряют оптическую плотность посредством спектрофотометра с длиной волны 595 нм. В качестве раствора сравнения используют смесь этих же реактивов, но без препарата. Необходимость определения концентрации белковой компоненты обусловлена, в частности, тем, что белки являются основными химическими компонентами крови, влияющими на скорость оседания эритроцитов, которую легко контролировать. Измеряя концентрацию белка в растворе экстракта пищевого продукта, которая дает клинический результат, можно составить таблицу необходимого содержания основного действующего белка для каждого пищевого продукта, а затем, готовя на основе свежего пищевого продукта маточный раствор, при помощи разведения, получить аналогичную концентрацию белка.

Таким образом, на основе маточного раствора приготавливают рабочий раствор путем разведения маточного раствора до рабочей концентрации раствором антиоксиданта, преимущественно 0,2% раствором фенола в физиологическом растворе. В качестве критерия степени разведения выбирают такое содержание белка, концентрация которого соответствует содержанию основного действующего белка в пищевом продукте. Т.е. разведение маточных растворов идет исходя из данных, полученных для конкретной партии пищевых продуктов, так, чтобы рабочее разведение соответствовало содержанию основного действующего белка в пищевом продукте. Например, содержание белка (в мг/мл) в рабочем растворе и в маточном растворе составляет для козьего молока - 0,1-0,5 и 13-16, капусты - 0,1-0,5 и 0,6-1,0, говядины - 0,2-0,5 и 0,8-1,2, баранины - 0,1-0,2 и 1,5-1,3, сельди - 0,2-0,5 и 1,0-2,0, шампиньонов - 0,03-0,06 и 0,6-0,9, кешью - 0,1-0,4 и 0,4-0,8, фасоли сухой - 0,01-0,05 и 13-16 соответственно. Оценка объективности необходимой степени разбавления может осуществляться на основании измерения скорости оседания эритроцитов, при этом в качестве рабочей концентрации принимается та, которая вызывает выявленное при анализе "выраженное" изменение скорости оседания (по сравнению с контрольными смесями, т.е. без добавления раствора экстракта пищевого продукта). Измерение скорости оседания эритроцитов может проводиться, например, с помощью устройства для автоматической регистрации осаждения крови по патенту RU 2128945 С1, 1999 или аналогичного.

После приготовления рабочего раствора его смешивают с подготовленной исходной кровью, при этом к подготовленной исходной крови добавляют подготовленный рабочий раствор экстракта пищевого продукта в количестве 4-12 об.%. Указанные пределы обусловлены тем, что при меньшем количестве экстракта тест-система не будет реагировать на него, а при большем количестве кровь будет так сильно реагировать на внесение большой массы чужеродного вещества, что результаты последующего анализа будут искажены. Смешивание может осуществляться, например, следующим образом. Рабочий раствор экстракта пищевого продукта и контрольный образец в виде 0,2%-го раствора фенола в физиологическом растворе раскапывают в разные лунки многогнездной U-образной иммунологической плашки (при этом номер каждой лунки соответствует конкретному пищевому продукту). Пробирку с кровью, после указанного выше отстаивания и перемешивания крови, вскрывают и производят дозированное раскапывание крови в эти лунки. Объем раскапываемой крови может дозироваться посредством микропипетки и составляет 99-101 мкл. Далее плашки помещают, например, в иммунологический термостатированный шейкер и проводят инкубацию в течение 3-10 минут при постоянном помешивании при температуре 25°С и скорости колебаний платформы шейкера 800-900 в минуту. Таким образом, в плашках оказываются приготовлены пробы крови с экстрактами пищевых продуктов, используемые в дальнейшем для необходимых анализов.

Описанные условия и режимы обеспечивают наибольшую информативность проб за счет повышения степени стандартизации экстрактов по конечному содержанию пищевых белков в получаемых пробах.

Реализация описанного способа дает такой конкретный результат повышения информативности проб, как расширение списка не рекомендуемых к употреблению пищевых продуктов, что стало возможным благодаря использованию для тестирования белка, при этом оказывается, что для некоторых тестируемых продуктов рабочая концентрация белка достигается при значительных разведениях маточного раствора и эти продукты по-иному влияют на скорость оседания эритроцитов и попадают из разрешенных в неразрешенные к употреблению.

Повышенная информативность приготавливаемых проб крови с экстрактами пищевых продуктов заявляемым способом подтверждена в практической деятельности Клиники доктора Волкова (000 «Эколабмедтест») на широкой группе пациентов (более 100 человек) с различными типами заболеваний.

Пример.

Пациент А., 35 лет. Диагноз - хронический холицестит. Жалобы - диспептические явления, головная боль, хроническая усталость, кожный зуд, бессонница.

Пациент в течение года наблюдался в Клинике доктора Волкова, находился на диете, рекомендуемой в соответствии со способом-прототипом. Исчезли головная боль, бессонница, наблюдалась положительная динамика оздоровления. Однако пациент продолжал жаловаться на кожный зуд. Была проведена диагностика к 130 пищевым продуктам на основе заявляемого способа приготовления проб крови с экстрактами этих пищевых продуктов. В результате был расширен список не рекомендуемых к употреблению пищевых продуктов и через 17 дней пациенту стало значительно лучше, кожный зуд практически не беспокоил, диспептические расстройства окончательно исчезли.

Сравнение результатов диагностики можно проиллюстрировать, например, на чесноке. При приготовлении проб в соответствии с заявляемым способом скорость оседания эритроцитов в капилляре с тестовой смесью составила А=12 мм/час, Р=А-К=0,4 мм/час, где К - скорость оседания эритроцитов в капилляре с контрольной смесью, концентрация белка в используемом экстракте составила 1,07 мг/мл, разведение равнялось 16, результат теста оказался положителен (реакция есть). При приготовлении проб в соответствии со способом-прототипом разведение равнялось 2, Р<0,2 мм/час, результат теста отрицателен (реакции нет). Аналогичные результаты были получены для щавеля, редьки, репы, редиса. Исключение этих пищевых продуктов из списка рекомендованных привело к улучшению самочувствия пациента.

Пробы крови с экстрактами пищевых продуктов, приготовленные в соответствии с предложенным способом, обладают более высокой информативностью по сравнению с пробами, приготовленными аналогичными способами. Это обеспечивает при их анализе наиболее достоверные и точные результаты и позволяет, например, создать оптимальную индивидуальную диету, получить обоснованный запрет на употребление в пищу конкретных пищевых продуктов для данного пациента и т.д. Способ несложен и нетрудоемок.

Изобретение относится к медицине. Проводят подготовку исходной крови и раствора экстракта пищевого продукта и их смешивание. При смешивании добавляют раствор экстракта пищевого продукта в количестве 4-12 об.% и инкубируют смесь при постоянном перемешивании. В качестве исходного пищевого продукта используют гомогенат натурального пищевого продукта, не подвергшегося термообработке. При его подготовке вначале приготавливают маточный раствор и определяют концентрацию белка в нем, например, методом Бредфорд. Затем путем его разведения до рабочей концентрации раствором антиоксиданта, например, фенола, в физиологическом растворе приготавливают рабочий раствор. В качестве критерия разведения выбирают такое содержание белка, концентрация которого соответствует содержанию основного действующего белка в исходном пищевом продукте. Изобретение позволяет повысить информативность проб, что обеспечивает высокую достоверность и точность результатов последующего анализа. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ приготовления проб крови с экстрактами пищевых продуктов, состоящий из подготовки исходной крови, включающей отбор цельной крови у пациента, добавление к ней антикоагулянта, выдержку в течение 1-3 ч и ее перемешивание, подготовки раствора экстракта пищевого продукта, включающей предварительную обработку исходного пищевого продукта и последующую вытяжку физиологическим раствором с добавлением антиоксиданта, и смешивания подготовленных исходной крови и раствора экстракта пищевого продукта, включающего добавление к подготовленной исходной крови подготовленного раствора экстракта пищевого продукта в количестве 4-12 об.% с последующим их инкубированием при одновременном перемешивании, отличающийся тем, что в качестве исходного пищевого продукта используют гомогенат натурального пищевого продукта, не подвергшегося термообработке, при подготовке раствора экстракта пищевого продукта вначале приготавливают маточный раствор и определяют концентрацию белка в нем, а затем приготавливают на основе маточного раствора рабочий раствор путем разведения маточного раствора до рабочей концентрации раствором антиоксиданта в физиологическом растворе, при этом в качестве критерия степени разведения выбирают такое содержания белка, концентрация которого соответствует содержанию основного действующего белка в исходном пищевом продукте.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антиоксиданта при приготовлении маточного и рабочего растворов используют фенол в количестве 0,2 об.% раствора по отношению к физиологическому раствору.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию белка в маточном и рабочем растворе определяют методом Бредфорд.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что отбор цельной крови у пациента с последующей выдержкой осуществляют в одноразовые вакутейнеры.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что перемешивание цельной крови после выдержки в вакутейнерах осуществляют путем их медленного переворачивания или медленного взбалтывания, а затем после переливания всего объема цельной крови из вакутейнеров в герметичную одноразовую пробирку, также путем ее медленного переворачивания или взбалтывания.