СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ РАДИОТОКСИНОВ В ОБЛУЧЕННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/02 

Изобретение относится к радиационной биологии, в частности к оценке экологической (радиационной) безопасности продуктов животноводства и растениеводства.

Согласно рекомендациям МАГАТЭ для продления сроков хранения пищевых продуктов растительного и животного происхождения (картофель, зернофураж, лук, ягоды, фрукты, соки, мясо и мясопродукты, рыба и продукты моря) последние как в нашей стране, так и за рубежом (Канада, США, Израиль) подвергаются радиационной обработке (облучению) в высоких дозах (от 10000 до 600000 Р) ионизирующих излучений. Хотя по данным ряда авторов облученные продукты считаются безопасными, однако, по данным других, такие продукты обладают мутагенным эффектом из-за содержания в них продуктов радиолиза воды, белков, углеводов, жиров, аминокислот, которые представляют собой естественные радиотоксины. Поэтому встает вопрос о допуске таких продуктов в пищу человека и корм животных, наличии или отсутствии в них радиотоксинов, определении их концентрации, сроков появления и распада в зависимости от сроков после облучения.

Однако до настоящего времени не разработан эффективный способ обнаружения радиотоксинов в облученных продуктах животного и растительного происхождения.

Известен полярографический способ определения (обнаружения) радиотоксинов в облученных растительных объектах путем исследования супернатантов водных гомогенатов в присутствии 0,15 М фосфатного буфера и вытеснения О₂ из исследуемых проб путем пропускания очищенного азота и снятия полярограмм на полярографе с ртутным электродом с последующим расчетом содержания радиотоксина графическим методом по высоте полярографической волны (см. статью A.M.Кузина и Н.Норбаева "Количественные закономерности образования хинонов в гамма-облученной растительной ткани. // Докл. АН СССР. - 1965. - Т.164. - Вып.6. - С.1409-1412).

Недостатком способа, наиболее близкого к предлагаемому, является неспецифичность метода, поскольку в параллельных пробах на полярограммах из облученных и необлученных объектов обнаруживаются совершенно идентичные полярографические волны, которые по высоте волн не имеют достоверных отличий. Во-вторых, низкая разрешающая способность способа не позволяет выявлять малые количества радиотоксина и по этим данным не представляется возможным судить о степени безопасности облученных продуктов. В-третьих, необходимость ртутных электродов для полярографов создает определенные технические трудности для выполнения известного способа. Кроме того, необходимость исследования больших количеств проб в экстренных случаях резко ограничивает возможности проведения этого способа.

Вместе с тем из области радиационной иммунологии известно, что радиотоксины образуются в клетках облученных микроорганизмов и растений (кукуруза, рожь, овес, пшеница, горох, чечевица, лук, чеснок, грибы, фрукты, картофель и т.д.) и что биохимический состав растительных антигенов - радиотоксинов не зависит от вида перечисленных объектов, поэтому растительный антиген - радиотоксин является специфичным для всех перечисленных объектов, а антисыворотки, полученные путем гипериммунизации животных одним из этих антигенов, будут реагировать с радиотоксинами, образующимися в перечисленных облученных растительных объектах. Поэтому обнаружение радиотоксинов в пищевых и кормовых продуктах (овес, кукуруза, пшеница, рожь, соя, горох, лук, чеснок, грибы, фрукты) требует разработки специфичного диагностикума и адекватных методов подготовки проб к исследованию путем перевода твердой фазы в жидкую и исследования супернатантов или осадков на наличие искомого агента с использованием высокочувствительных тест-систем.

При создании изобретения ставилась задача разработать эффективный, высокочувствительный и точный способ обнаружения радиотоксина в подвергнутых лучевой обработке пищевых и кормовых продуктах.

Это достигается тем, что в способе обнаружения радиотоксинов в облученных пищевых продуктах, включающем гомогенизацию проб в присутствии экстрагента и определение концентрации радиотоксинов в экстрактах, в качестве исследуемого материала используют концентрированные методом выпаривания на вакуумном испарителе осадки этаноловых экстрактов, которые после разведения физиологическим раствором подвергают серологическому анализу в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с антирадиотоксическим и антительным эритроцитарным диагностикумом (АТЭД), в котором в качестве носителя специфических антител используют сенсибилизированные антирадиотоксической сывороткой формалинизированные и танизированные эритроциты барана, для сенсибилизации эритроцитов используют гипериммунные сыворотки кроликов, а в качестве иммунизирующего агента - антигена используют растительный радиотоксин, полученный путем этанолового экстрагирования пророщенного и облученного зерна (например, кукурузы), и по феномену гемагглютинации сенсибилизированных эритроцитов (АТЭД) в РНГА судят о наличии радиотоксинов, а по титру антигена (максимальное разведение осадков этаноловых экстрактов) определяют концентрацию радиотоксина и устанавливают степень экологической (радиационной) безопасности облученных продуктов.

В качестве исследуемого материала используют концентрированные осадки этаноловых экстрактов, полученные путем гомогенизации зерна (овощей, фруктов и т.д.) в присутствии 96%-ного этанола, взятого в соотношении 1:3, и экстрагирования в течение 50-60 мин при постоянном перемешивании и удалении экстрагента на вакуумном испарителе при температуре 28-33°С, и полученный после упаривания осадок (концентрированный радиотоксинсодержащий экстракт) подвергают серологическому анализу в РНГА.

В качестве иммунизирующего антигена для гипериммунизации животных при получении специфической антирадиотоксической сыворотки используют извлеченный путем этанолового экстрагирования из пророщенного зерна (кукурузы, пшеницы, ржи, сои, гороха) белково-хиноидный радиотоксин, содержащий 45-50 мг/мл растительного белка; для увеличения выхода иммунизирующей субстанции - белково-радиотоксинного комплекса из технологического сырья - зерна, последний перед облучением подвергают проращиванию в течение 6,5-7,5 сут с последующим облучением в дозе 300-310 Гр, затем выдерживают при температуре 18-22°С в течение 23-29 часов и продукт подвергают гомогенизации в присутствии 96%-ного этанола в соотношении 1:3, экстрагируют в течение 50-60 мин при температуре 0°С, смесь центрифугируют при 8000 об/мин, экстрагент удаляют на вакуумном испарителе и полученный продукт стандартизируют по белку 4,5-5,5 мг/мл и используют в качестве иммунизирующего антигена при получении антирадиотоксической гипериммунной сыворотки; гипериммунную антирадиотоксическую сыворотку получают путем 4-кратного с интервалом в 14 дней внутримышечного в дозе 1,0-2 см³ введения кроликам радиотоксина, извлеченного из пророщенного и облученного зерна (например, кукурузы).

Сенсибилизацию эритроцитов осуществляют путем смешивания равных объемов разведенной физиологическим раствором (1:10) антирадиотоксической сыворотки и 3%-ной взвеси эритроцитов с последующим термостатированием смеси в течение 2,5-3 ч при температуре 36-38°С и центрифугированием эритроцитов при 1000-1500 g в течение 10-15 мин, осадок после декантирования супернатанта заливают фосфатно-буферным раствором (ФБР) с рН 7,2 с содержанием 0,5% нормальной лошадиной сыворотки, повторяют эту операцию трижды и полученный продукт (антительный эритроцитарный диагностикум - АТЭД) консервируют 0,3%-ным фенолом и используют в качестве основного индикаторного компонента в РНГА - тест-системе для индикации радиотоксинов в облученных пищевых продуктах.

Использование метода этанолового экстрагирования и выпаривания экстрагента позволяет существенно концентрировать радиотоксин в исследуемых пробах, а применение иммунохимической тест-системы (РНГА) для индикации радиотоксина в облученных объектах ветеринарного и медицинского надзора позволяет значительно повысить чувствительность способа, обеспечивая обнаружение весьма малых концентраций радиотоксина (0,001 г ˜ на 1 г пробы), что в 10 и более раз выше, чем при использовании известного способа.

Способ индикации радиотоксина в объектах ветеринарного надзора осуществляется следующим образом.

Начальным этапом исследования является изготовление индикаторного компонента - антительного эритроцитарного диагностикума - АТЭД на основе гипериммунной антирадиотоксической сыворотки, которая служит источником специфических антирадиотоксических антител (сенситином) для сенсибилизации (нагружения) формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, служащих биологическим иммуносорбентом (носителем) специфических антирадиотоксических антител.

Антирадиотоксическую сыворотку получают путем гипериммунизации кроликов антигеном - специфическим радиомиметиком - радиотоксином, в качестве которого используют этаноловый экстракт пророщенной и облученной растительной ткани. Для получения радиотоксина используют зерно (кукурузу, овес, рожь, пшеницу, горох, сою), которое смачивают в течение 24 ч и проращивают в течение 7 сут. Семидневные проростки зерна (например, кукурузы сорта "Стерлинг") облучают гамма-лучами в дозе 300-310 Гр и выдерживают их при температуре 18-22°С в течение 24 часов. Через 24 часа после облучения берут по 50-60 г проращенного и облученного зерна, растирают с 140-150 мл 96%-ного этанола и центрифугируют при 8000 об/мин; из полученного супернатанта экстрагент (этанол) удаляют на вакуумном испарителе при 28-33°С, полученный после упаривания этанола осадок представляет собой концентрированный радиотоксин, содержащий антигенный материал. Все процедуры по изолированию радиотоксина проводят при температуре 0°С.

В полученном этаноловом экстракте определяют белок по Лоури, содержание которого составляет, в зависимости от сорта зерна, 5,7-7,8 мг/мл. Полученный этаноловый экстракт, содержащий белково-хиноидный радиотоксический комплекс (лучевые растительные антигены), стандартизируют путем разведения стерильным физиологическим раствором рН 7,2-7,4 до концентрации 5 мг/мл для гипериммунизации лабораторных животных (например, кроликов).

Гипериммунизацию кроликов живой массой 2,0-2,5 кг проводят по следующей схеме. Приготовленный по вышеописанной методике антиген - радиотоксин вводят кроликам 4-кратно внутримышечно в область внутренней поверхности бедра с интервалом в 14 дней между введениями по 1,0-2,0 мм³ на каждое введение. На восьмой день после последней инъекции антигена у кроликов берут кровь из ушной вены для определения антирадиотоксических антител, которое проводят в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) по К.Мальборгу (Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987, с.211-218). В качестве положительного антигена в реакции используют этаноловый экстракт облученного зерна, в качестве отрицательного - экстракт необлученного зерна.

Кролики, в сыворотке которых обнаруживают антитела в титрах не ниже 1:300, обескровливают. Полученные иммунные сыворотки в дальнейшем используют в качестве сенситина - источника специфических антител для сенсибилизации (нагружения) эритроцитов барана с целью изготовления антирадиотоксического антительного эритроцитарного диагностикума (АТЭД).

Для приготовления АТЭД в качестве иммуносорбента используют танизированные и формалинизированные по Фили и Чизмесу (см. ж-л "Лабораторное дело", 1968, №11, с.604) эритроциты барана, на которых адсорбируют (нагружают) сенситин (антирадиотоксическую гипериммунную сыворотку кролика).

Сенсибилизацию (нагружение специфическими антителами) эритроцитов осуществляют следующим образом: гипериммунную сыворотку разводят физраствором 1:10 и к ней добавляют фосфатный буфер из расчета 5 см³ на 1 см³ разведенной сыворотки. Затем смешивают равные объемы 3% взвеси формалинизированных и танизированных эритроцитов и антирадиотоксической сыворотки. Полученную взвесь термостатируют при 37°С в течение 2,5-3 часов при постоянном перемешивании. По истечении указанной экспозиции эритроциты осаждают центрифугированием при 1000-1500 g в течение 10 мин. Центрифугат (осадок эритроцитов) заливают фосфатно-буферным раствором (ФБР) с рН 7,2 с содержанием 0,5% лошадиной сыворотки. Такую операцию повторяют 3 раза. Затем из осадка готовят 3%-ную взвесь эритроцитов на этом же фосфатно-буферном растворе с содержанием 0,5% нормальной лошадиной сыворотки.

Полученный таким способом антирадиотоксический антительный эритроцитарный диагностикум (АТЭД) консервируют 0,3%-ным фенолом и хранят в холодильнике при температуре (2-6)°С и используют в качестве специфических антител в высокочувствительной иммунохимической тест-системе - реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для обнаружения радиотоксинов в исследуемых пробах из пищевых продуктов и кормов.

Обнаружение (индикация) радиотоксина в пищевых и кормовых продуктах осуществляют следующим образом. Пробы зерна (кукурузы, сои, гороха, пшеницы, ржи, чечевицы, ячменя и т.д.) смачивают в течение 24 ч при температуре 18-23°С, затем растирают с 35-45 мл 96%-ного этанола и центрифугируют при 8000 об/мин. Все процедуры по гомогенизации и экстракции проводят при температуре 0°С. Концентрирование радиотоксина в полученном супернатанте и удаление экстрагента осуществляют на вакуумном испарителе при 22-33°С и полученный при этом осадок подвергают серологическому исследованию в РНГА на предмет индикации (обнаружения) радиотоксинов. Пробы овощей (картофеля, свеклы, моркови, фруктов и т.д.) не смачивают, а размельчают, растирают и обрабатывают как изложено выше.

Серологический анализ полученных экстрактов проводят путем постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с антирадиотоксическим (антительным) эритроцитарным диагностикумом (АТЭД), изготовленным согласно вышеописанной технологии. Для этого из этаноловых экстрактов (осадков) готовят последовательные двукратные (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.) разведения антигена на физиологическом растворе и добавляют к каждому разведению по 1 капле (330 мкл) 2,5-3%-ной суспензии формалинизированных, танизированных и сенсибилизированных антирадиотоксическими сыворотками эритроцитов барана (АТЭД). Смесь испытуемых антигенов и диагностикума тщательно перемешивают до гомогенной взвеси и оставляют на 2-2,5 часа при комнатной температуре или в термостате при 37°С.

Результаты реакции непрямой гемагглютинации оценивают визуально в крестах по следующей схеме:

- реакция считается положительной, когда на дне лунок иммунологических планшетов в рядах с положительным и испытуемыми антигенами образуется "зонтик" агглютинировавшихся эритроцитов интенсивностью в 4 креста (4+), эритроциты занимают 1/2-1/3 поверхности дна лунок - 3+ при отсутствии таковых в лунках с отрицательными антигенами;

- реакция считается сомнительной, когда на дне лунки образуется "зонтик" агглютинированных эритроцитов, занимающих 1/4 дна лунок с оценкой в 2+;

- реакция считается отрицательной, когда агглютинация осевших эритроцитов занимает 1/5 дна лунок или когда эритроциты осели на дно лунок в виде плотной пуговицы (кольца).

Реакцию сопровождают соответствующими контролями. В качестве положительного антигена в РНГА используют этаноловый экстракт от облученных объектов (зерна), а в качестве отрицательного контроля - аналогичные экстракты от необлученных объектов.

Количественную оценку реакции выражают в титрах (1:2, 1:4, 1:8 и т.д.) или в логарифмах и основаниях 2 (1:2=2log₂; 1:4=2log₂ и т.д.).

Оседание сенсибилизированных эритроцитов (АТЭД) на дно лунок иммунологических планшет в виде "зонтика" с оценкой в 3+ и 4+ в ряду с испытуемыми пробами и положительным антигеном и отсутствие такового в лунках с отрицательными антигенами в РНГА свидетельствуют о наличии в исследуемых пробах искомых антигенов (радиотоксинов).

Обнаружение в исследуемых пробах из объектов ветеринарно-медицинского надзора антигенов с титрами 1:8 и ниже свидетельствует o том, что исследуемый объект подвергался воздействию ионизирующих излучений в относительно невысоких дозах. Поэтому эти облученные объекты радиационной опасности не представляют.

Превышение диагностических титров в 2-3 раза свидетельствует об облучении объектов в высоких дозах ионизирующих излучений и время, прошедшее после облучения, недостаточно, чтобы радиоиндуцированные токсические продукты успели деградировать, поэтому исследуемые объекты, прежде чем их допускать в пищу, должны быть выдержаны по срокам полной деградации радиотоксинов или подвергаться термической обработке (проварке).

Реализация способа индикации радиотоксина в объектах ветеринарно-медицинского надзора иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение антигена - радиотоксина.

Радиотоксический антиген (РТ-антиген) получали путем облучения объектов (например, кукурузы) без подращивания и с подращиванием проб в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 сут и облучения в дозах 50-310 Гр, выдерживали при температуре 15-30°С в течение 12-30 часов после облучения и готовили из них водные и спиртовые экстракты, выделяли радиотоксин при температурах 0-18°С. Установлено, что наибольший выход белково-хиноидного радиотоксина (50 мг/мл) с максимальной биологической активностью (ускорение 50%-ного гемолиза эритроцитов в 2 раза по сравнению с 0,39-0,95 раза при других вариантах опытов) достигается при облучении подращенного зерна в дозах 300-310 Гр и выдерживании при температуре 18-22°С в течение 23-25 часов. Сокращение (22 часа) или увеличение (26 часов) времени экспозиции после облучения объекта, уменьшение (290 Гр) или увеличение (320 Гр) дозы облучения, отсутствие подращивания или уменьшение времени подращивания (1-6 часов) не обеспечивают оптимального выхода радиотоксического антигена, концентрация радиотоксинсодержащего белка при этих режимах не превышает 1,5-23 мг/см³.

Пример 2. Гипериммунную антирадиотоксическую сыворотку получали путем многократного введения радиотоксина с использованием различных доз и схем введения антигена. При этом использовали 1-, 2-, 3-, 4-, 5- и 6-кратное введение антигенного материала, различные дозы (0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; 1,6; 1,8; 2,0; 2,2; 2,4; 2,6; 2,8; 3,0 см³), интервалы между введениями (через 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 дней), а также область введения антигенного материала (подкожно, внутривенно, внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшинно). Активность антисывороток определили в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с антигенным вариантом эритроцитарного диагностикума (АТЭД).

Результаты опытов показали, что наибольший титр антирадиотоксических антител (1:462-1:816) получали от кроликов, иммунизированных по схеме, предполагающей 4-кратное введение антигена с интервалом в 14 дней внутримышечно в дозе по 1-2 см³ на каждое введение.

Изменение схемы иммунизации (1-, 2-, 3-, 5- и 6-кратное введение антигена), уменьшение (0,2; 0,4; 0,6, 40,8 см³) или увеличение (2,2; 2,4; 2,6; 2,8 и 3,0 см³) дозы антигена, интервала (3, 6, 8, 10, 12, 16, 18 и 20 сут) между введениями и места введения (внутрикожное, подкожное, внутривенное и внутрибрюшинное) антигена не обеспечивали получение антисывороток с достаточной серологической активностью, ибо титр антирадиотоксических антител в сыворотках при указанных схемах гипериммунизации не превышал 1:50-1:112 в РНГА.

Пример 3. Определение оптимальных условий сенсибилизации эритроцитов.

Для определения оптимальных параметров сенсибилизации эритроцитов использовали различные соотношения компонентов (сенситина и эритроцитов), температуры инкубирования и экспозиции адсорбирования. При этом использовали различные разведения сенситина (антирадиотоксическое в физрастворе 1:2; 1:4; 1:8 и 1:10), различные соотношения сенситина и взвеси эритроцитов (1:2; 1:4; 1:8 и 1:10), температуры (20, 25, 30, 35 и 40°С) и экспозиции адсорбирования (1; 2; 2,5; 3; 3,5 и 4 часа). Установили, что оптимальным для сенсибилизации эритроцитов является разведение сыворотки 1:10, соотношение сыворотки и 3%-ной взвеси эритроцитов 1:1, температура термостатирования 37°С и экспозиции сенсибилизации - 2,5-3 часа. Изменения указанных параметров как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения не обеспечивали достаточной степени сенсибилизации, ибо увеличение их ведет к самоагглютинации эритроцитов, а уменьшение - к отсутствию гемагглютинации при контакте со специфическим антигеном - радиотоксином.

Пример 4. Проверку эффективности предлагаемого способа обнаружения радиотоксина в пищевых и кормовых продуктах проводили на облученных в дозах 100, 150, 200, 300, 400 Гр клубнях картофеля с использованием известного (полярографического) и предлагаемого (серологического) методов.

Согласно известному методу облученные клубни картофеля охлаждали до 1-3°С, растирали с равным объемом дистиллированной воды, супернатант отделяли центрифугированием. К холодному супернатанту добавляли 0,15 М фосфатный буфер с рН 6,8 и вытесняли О₂ путем пропускания очищенного азота. Полярограмму снимали в атмосфере с использованием ртутного электрода на полярографе. Измерение высоты (в мм) полярографической волны проводили графическим методом при E_1/2=-0,35. Параллельно готовили пробы согласно предлагаемому способу путем этанолового экстрагирования, центрифугирования и удаления экстрагента на вакуумном испарителе.

Пробы из облученных в вышеуказанных дозах и из необлученных объектов, приготовленные известным и предлагаемым методами, подвергали полярографическому (известный) и серологическому (РИГА) анализам.

В результате проведенных исследований установлено, что по данным полярографического анализа дифференцировать облученные в дозах 100, 150 Гр клубни картофеля не представляется возможным, поскольку высота полярограмм этих объектов имеет недостоверные отличия - оптическая плотность водных экстрактов облученных тканей составляла 0,43 против 0,41 у необлученных объектов. Только при облучении объектов при дозе 400 Гр через 24 ч после облучения можно было наблюдать определенные различия между облученными (0,84) и необлученными (Е=0,71).

В отдаленные сроки исследования (через 3, 5, 7, 10, 15, 20 сут) различий полярограмм облученных и необлученных объектов не обнаружено. Параллельное серологическое исследование проб в РНГА, приготовленных по известному способу, также дало недостоверные результаты - титры антигенов контрольных (необлученных) и облученных проб имели недостоверные отличия.

В пробах, подготовленных по предлагаемому способу, в РНГА, начиная с 1-х по 21 сут, независимо от дозы облучения, были обнаружены радиотоксины в титрах от 1:8 до 1:256 с интенсивностью в 3+, 4+. В контрольных (необлученных) пробах искомый антиген не выявлен, титры антигена при этом не превышали 1:2-1:4 с оценкой не более 2+.

Пример 5. Определение зависимости концентрации радиотоксинов от дозы облучения объекта.

Учитывая имеющиеся рекомендации по радиационной обработке конкретных объектов, например картофеля, последний может быть подвергнут облучению в дозах 100, 150, 200, 300, 400 Гр, поскольку не исключено, что в ряде случаев рекомендованная технология облучения объектов не соблюдается и, в целях обеспечения большей сохранности продуктов, они могут быть подвергнуты облучению и в указанных дозах. С учетом этого картофель подвергали внешнему гамма-облучению в перечисленных дозах и через 5 сут после облучения (срок максимального накопления радиотоксинов) готовили пробы к исследованию с использованием известного (водно-солевого экстрагирования) и предлагаемого (остаток после упаривания этанолового экстракта) методов.

Установлено, что искомый агент - радиотоксин в РНГА обнаруживается во всех пробах, однако его количественное содержание имеет прямую зависимость от дозы облучения объекта. Так, титры радиотоксинов в пробах из облученного картофеля в дозах 100, 150 Гр составляли 1:32, в дозе 200 Гр - 1:64, в дозе 300 Гр - 1:128 и в дозе 400 Гр - 1:256. Следовательно, по титру радиотоксина в РНГА можно судить о дозе облучения исследуемого объекта (например, картофеля) и о степени его радиационной опасности, поскольку наличие в объектах ветнадзора радиотоксина таит в себе опасность индукции мутагенного эффекта при его употреблении в пищу.

Пример 6. Оценка экологической безопасности подвергнутых радиационной обработке пищевых продуктов.

Исследования проводили на 60 белых мышах, разделенных на 12 групп по 5 животных на каждый вариант опыта (5 различных доз облучения и 6 экспозиций, 1 контроль). Животным соответствующих групп в течение 30 сут скармливали пробы картофеля, облученного в дозах 100, 150, 200, 300 и 400 Гр, и по истечении 5, 10, 15, 20 и 30 сут после облучения. В качестве критерия оценки экологической безопасности облученных объектов использовали частоту хромосомных аберраций (ЧХА) соматических клеток периферической крови подопытных животных и зависимость этого показателя от титров антигенов - радиотоксинов в облученных вышеуказанных дозах ионизирующих излучений и времени отбора проб после облучения объектов.

Установлено, что искомый антиген - радиотоксин в пробах из облученного в дозах 100-400 Гр продукта обнаруживается в течение 20-30 дней после облучения в вышеперечисленных дозах в титрах от 1:512 до 1:8 в РНГА-тесте, а титры радиотоксина зависели от дозы облучения и срока, прошедшего после облучения. Наибольшие титры радиотоксина, независимо от дозы облучения, были обнаружены на 5 сут после радиационного воздействия, составляя по дозам 1:512 (400 Гр), 1:256 (300 Гр), 1:128 (200 Гр), 1:64 (150 Гр) и 1:32 (100 Гр). Титры радиотоксина сохранялись на этом уровне до 15-20 сут после облучения и только к 28-30 суткам снизились до индикаторных (неопасных) концентраций (1:4-1:8).

Результаты изучения мутагенного эффекта облученных продуктов на лабораторных животных показали, что скармливание животным облученных продуктов в течение 30 сут вызывало существенное увеличение частоты хромосомных аберраций соматических клеток периферической крови белых мышей и величина этого показателя (ЧХА) имела прямую корреляционную зависимость от дозы лучевого воздействия, сроков после облучения и величины титров радиотоксина, обнаруженных в РНГА-тесте. Установлено, что у животных, получавших необлученный (контрольный) пищевой продукт, частота хромосомных аберраций составляла 0,34±0,05. У животных, получавших облученный пищевой продукт, через 5 сут после облучения, титры которого составляли от 1:512 до 1:32, частота хромосомных аберраций (ЧХА) соматических клеток костного мозга колебалась в пределах 1,29-1,02, что превышало контрольные значения в 3,0-3,8 раза (Р<0,01). Эти значения цитогенетических показателей сохранялись на таком высоком уровне у мышей, которые получали пробы, взятые на 5-16 дни после облучения. Частота хромосомных аберраций костномозговых клеток приближалась к контрольным значениям только к 28-30 суткам, когда титры радиотоксина в исследуемых объектах составляли 1:4-1:8.

Следовательно, обнаружение в облученных пищевых продуктах радиотоксина в титрах 1:4-1:8 свидетельствует о низкой мутагенной активности облученных продуктов и их экологической безопасности, а превышение титров радиотоксина в исследуемых пробах в 2,5-3,8 раза - о высокой мутагенной активности облученных продуктов, т.е. об их экологической опасности, и эти продукты, прежде чем их допускать в пищу, должны быть выдержаны по срокам полной деградации радиотоксинов (30 и более суток) или использованы в пищу людям или корм животным только после тщательной проварки. Это положение распространяется и на другие продукты (морковь, лук, свекла, все зернопродукты и т.д.).

Сравнительная характеристика способов индикации радиотоксинов представлена в таблице. Как видно из ее данных, предлагаемый способ позволяет повысить как чувствительность, так и специфичность метода индикации радиотоксина в исследуемых объектах в динамике, а также оценить степень радиационной безопасности продукта.

ТаблицаСравнительная характеристика способов индикации радиотоксинов в объектах ветеринарного надзораОтличительные особенности способов индикации радиотоксиновИзвестныйПредлагаемыйСпособ подготовки проб к исследов.Тест-система для индикацииКритерии оценки содержания радиотоксиновСпособ подготовки проб к исследов.Тест-система для индикацииКритерии оценки содержания радиотоксиновГомогенизация проб в присутствии дист. воды, центрифугирование, вытеснение O₂ очищеннымПолярографический метод с использованием ртутного электрода.Высота полярографической волны, оптическая плотность на спектрофотометре и расчет содержания радиотоксинаЭтаноловое экстрагирование гомогенатов, кон-центрирование радиотоксина путем удаления экстрагента на вакуумном испарителеРеакция непрямой гемагглютинации (РНГА) со специфическим антирадиотоксическим эритроцитарным диагностикумом.Титры РНГА в разведении 1:8 и выше свидетельствуют о том, что продукт подвергался облучению 1-30 дней назад. Превышение титров РНГА в 2-3 раза свидетельствуют о том, что продукт был подвергнут облучению 1-5азотом из экстракта и исследование супернатанта на наличие радиотоксина. графическим методом. При этом достоверной разницы между облученным и необлученным объектами не выявляется.и исследование осадка на содержание радиотоксина. дней назад в дозах, превышающих регламентированные соответствующими рекомендациями нормы. Превышение титров радиотоксина в 2-3 и более раз свидетельствуют о радиационной опасности исследуемых продуктов.

Изобретение относится к радиационной биологии, в частности к оценке радиационной безопасности продуктов животноводства и растениеводства. Способ предусматривает проведение серологического анализа этаноловых экстрактов из исследуемых объектов путем постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА), которую проводят с использованием антирадиотоксического антительного эритроцитарного диагностикума (АТЭД). Этаноловые экстракты предварительно концентрируют методом выпаривания на вакуумном испарителе с получением осадка, который после разведения физиологическим раствором подвергают серологическому анализу. В качестве носителя специфических антител используют сенсибилизированные антирадиотоксической сывороткой формалинизированные и танизированные эритроциты барана. По феномену гемагглютинации сенсибилизированных эритроцитов судят о наличии радиотоксина в исследуемых пробах. Определяют концентрацию радиотоксинов по максимальному разведению исследуемого материала, при котором наблюдают феномен гемагглютинации, при этом максимальное разведение 1:8 и ниже свидетельствует об экологической безопасности пищевого продукта. Для сенсибилизации эритроцитов используют гипериммунные сыворотки кроликов. При этом в качестве иммунизирующего агента - антигена используют растительный радиотоксин, полученный путем этанолового экстрагирования пророщенного и облученного зерна. Способ эффективен и высокочувствителен и позволяет провести количественную оценку экологической безопасности пищевого продукта. 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ обнаружения радиотоксинов в облученных пищевых продуктах для оценки их экологической безопасности, включающий приготовление исследуемого материала гомогенизацией пробы в присутствии экстрагента и определение концентрации радиотоксинов в экстрактах, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют концентрированный методом выпаривания на вакуумном испарителе осадок этанолового экстракта, который после разведения физиологическим раствором подвергают серологическому анализу в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с антирадиотоксическим антительным эритроцитарным диагностикумом (АТЭД), в качестве носителя специфических антител используют сенсибилизированные антирадиотоксической сывороткой формалинизированные и танизированные эритроциты барана, для сенсибилизации эритроцитов используют гипериммунные сыворотки кроликов, а в качестве иммунизирующего агента - антигена используют растительный радиотоксин, полученный путем этанолового экстрагирования пророщенного и облученного зерна и по феномену гемагглютинации сенсибилизированных эритроцитов в РНГА судят о наличии радиотоксинов в исследуемой пробе, а концентрацию радиотоксинов определяют по максимальному разведению исследуемого материала, при котором наблюдают феномен гемагглютинации, при этом максимальное разведение 1:8 и ниже свидетельствует об экологической безопасности пищевого продукта.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют концентрированные осадки этаноловых экстрактов, полученные путем гомогенизации пробы в присутствии 96%-ного этанола, взятого в соотношении 1:3 и экстрагирования в течение 50-60 мин при постоянном перемешивании и удалении экстрагента на вакуумном испарителе при температуре 28-33°С.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве иммунизирующего антигена используют белково-хиноидный радиотоксин, содержащий 45-50 мг/мл растительного белка, полученный из пророщенного в течение 6-7 суток и облученного в дозе 300-310 Гр зерна, которое выдерживают 23-29 ч при температуре 18-22°С, гомогенизируют в присутствии 96%-ного раствора этанола в соотношении 1:3, экстрагируют 50-60 мин при температуре 0°С, центрифугируют при 8000 об/мин, затем экстрагент удаляют на вакуумном испарителе и полученный продукт стандартизируют по белку до 4,5-5,5 мг/мл.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что гипериммунную антирадиотоксическую сыворотку получают путем 4-кратного с интервалом в 14 дней внутримышечного в дозе 1,0-2 см³ введения кроликам радиотоксина.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что сенсибилизацию эритроцитов осуществляют путем смешивания равных объемов разведенной физиологическим раствором (1:10) антирадиотоксической сыворотки и 3%-ной взвеси эритроцитов с последующим термостатированием смеси в течение 2,5-3 ч при температуре 36-38°С и центрифугировании эритроцитов при 1000-1500 g в течение 10-15 мин, осадок после декантирования супернатанта заливают фосфатно-буферным раствором (ФБР) с рН 7,2, перемешивают и подвергают повторному центрифугированию в вышеуказанных режимах, супернатант декантируют, а осадок снова заливают ФБР с рН 7,2, затем снова перемешивают, центрифугируют в вышеуказанных режимах и из трехкратно отмытого осадка эритроцитов готовят 3%-ную взвесь путем заливки осадка ФБР с рН 7,2 и содержащим 0,5% нормальной лошадиной сыворотки и полученный антительный эритроцитарный диагностикум - АТЭД консервируют 0,3%-ным фенолом.