СРЕДСТВО ДЛЯ ЗАЩИТЫ КЛЕТОК МОЗГА Российский патент 2010 года по МПК A61K35/50 G01N33/68 

Изобретение относится к области фармакологии и представляет собой средство для защиты клеток мозга от ишемических и иных повреждений и способ его получения из ткани плаценты. Заявленное средство может использоваться в медицине как средство, нормализующее функции нервной системы.

Ишемический инсульт является одной из наиболее частых проявлений сосудистой патологии человека, одной из основных причин смерти или стойкой инвалидности у лиц в возрасте от 55 лет. При этом частота летальных исходов достигает 20-30%, а в 30-40% случаев исходом ишемического инсульта бывает глубокая инвалидность, возникающая вследствие апоптотической гибели больших популяций нейронов головного мозга, сопровождающейся резко выраженными нарушениями психических и/или моторных функций (Е.И.Гусев и др., 1998-2000).

Отсутствие заметного прогресса в лечении ишемического инсульта, несмотря на достаточную ясность его основных патофизиологических механизмов, свидетельствует о недостаточной эффективности существующих сегодня средств и методов профилактики и лечения этой патологии и стимулирует экспериментальные поиски новых более эффективных препаратов.

Известны способы получения биологически активных веществ и лекарственных средств из животного сырья (патент РФ №944191, 1994; а.с. SU №1112606, 1996; а.с. SU №1218521, 1994; а.с. SU №1227198, 1986; патент РФ №1448443, 1994; патент РФ №1522486, 1993; патент РФ №2075944, 1997; патент РФ №2161501, 2001; патент US 4341765, патент GB 1161896, 1969; патент FR 2583982, 1987).

Известен способ получения препарата, обладающего восстанавливающей активностью при нарушении функции головного мозга (патент РФ №1298979, 1993), который позволяет выделить из коры головного мозга убойных животных биологически активные пептиды, оказывающие позитивное влияние на нервные функции. Этот препарат получают путем обработки исходного сырья (серое вещество полушарий головного мозга) ацетоном при t=-10°С…-4°С и соотношении ткани мозга и ацетона 1:5 в течение 18…30 часов, гомогенизации, экстрагирования гомогената 2…4% раствором уксусной кислоты в течение 48…72 часов при рН 3,5…4,5 в присутствии хлористого цинка в концентрации 0,6…2 г/л и при соотношении гомогената и раствора уксусной кислоты 1:(8…4), центрифугирования, осаждения биологически активных веществ ацетоном при t=-3°С…-5°С и соотношении супернатанта и ацетона 1:(7…5), и ионообменной хроматографии полученного осадка на катионите "Биокарб". В результате ионообменной хроматографии получают фракцию, содержащую преимущественно щелочные полипептиды с молекулярной массой от 2000 до 6000 Да.

Необходимо отметить, что способ, описанный в патенте РФ №1298979, не позволяет извлечь из коры головного мозга кислые и нейтральные полипептиды, а также очистить получаемый продукт от примесей, а полученный конечный продукт обладает относительно невысокой терапевтической эффективностью.

В практике лечения ишемического инсульта в настоящее время широко применяется препарат «Церебролизин» ("EBEWE", Австрия), представляющий собой гетерогенную смесь пептидов и аминокислот, получаемых из мозга свиней путем стандартизованной ферментативной обработки (Церебролизин: фармакологические эффекты и место в клинической практике. Сб. докладов 6-го Международного симпозиума, Москва, 2002). Установлено, что данный препарат биологического происхождения обладает определенным уровнем нейротрофической активности и тормозит апоптоз нейронов, подвергаемых разного рода неблагоприятным воздействиям. В то же время сам факт нерешенности проблемы профилактики и лечения ишемического инсульта свидетельствует о недостаточной эффективности церебролизина (равно как и любых других применяемых сегодня ноотропов и нейропротекторов биологического происхождения или синтезированных химическим путем) и определяет необходимость разработки и внедрения новых более действенных препаратов.

Эффективность препарата «церебролизин» проявляется при его использовании в дозах 4-10 мг/кг при ежедневных парентеральных введениях в течение 7-10 и более дней после перенесенного инсульта. При таком применении препарата наблюдается тенденция к снижению частоты летальных исходов и некоторое снижение частоты случаев тяжелой инвалидизации по сравнению с пациентами, получавшими плацебо (В.И.Скворцова. Церебролизин в лечении острого ишемического инсульта. Церебролизин: фармакологические эффекты и место в клинической практике. Сб. докладов 6-го Международного симпозиума, Москва, 2002, 28-35).

Понимание биологических основ патологического процесса указывает на то, что прогресс в его лечении может быть достигнут на путях поиска и внедрения более активных нейротрофических и нейропротекторных препаратов. Известно, что источником большого количества трофических факторов является плацента, обеспечивающая и поддерживающая быстрый рост и ускоренное развитие нервной ткани и других органов и тканей формирующегося плода.

Из публикации заявки на патент РФ №2007 118245 известен пептидный экстракт плаценты, содержащий 5.0-35.0 мг/мл белка, 2.0-5.0 мг/мл гликопротеинов и 0,5-1.0 мг/мл тритона Х100, и способ его получения, основанный на экстракции биологического материала - плаценты, которую измельчают, заливают фосфатным буфером с добавлением тритона, после чего из нее посредством центрифугирования выделяют экстракт с последующей очисткой от примесей.

Также из публикации заявки на патент РФ №2004130760 А от 10.04.2006 известно средство, обладающее нейропротекторной и ноотропной активностью, содержащее белки, полученные путем экстракции плаценты слабощелочным буфером. В этой публикации описан способ получения этого средства путем измельчения плаценты человека, экстрагирования слабощелочным буфером, центрифугирования, хроматографирования центрифугата с анионообменным носителем с уравновешиванием тем же буфером, отмывания хроматографической колонки от несвязавшегося материала с последующим элюированием белков раствором хлорида натрия и стерилизацией с помощью фильтрации через антимикробные фильтры.

Данный способ, позволяющий в принципе в лабораторных условиях получить как таковой целевой продукт, на практике в производственных масштабах не позволял выделить готовый продукт требуемой чистоты, лишенный балластных примесей белковой природы.

Задачей предлагаемого технического решения является получение эффективного средства, нормализующего функции нервной системы, высокой чистоты приемлемым в промышленном масштабе способом.

Решением поставленной задачи служит средство для защиты клеток мозга от ишемических и иных повреждений, содержащее доминирующий белковый экстракт из ткани плаценты с получением за счет хроматографического разделения белковой фракции из 8-10 компонентов с общей молекулярной массой от 15 до 200 кДа, причем 70-80% фракции приходится на белок с молекулярной массой около 70 кДа, а 20-30% фракции приходятся на белки с молекулярной массой от 15 до 60 кДа и от 100 до 200 кДа.

Для получения средства в соответствии с поставленной задачей этап гель-фильтрации был заменен на дополнительный (завершающий) этап комбинированной ионообменной хроматографии. А именно первичный элюат, содержащий препарат NP-3, 3-кратно разбавляли дистиллированной водой для снижения концентрации NaCl, доводили рН раствора до 6,0, после чего полученный раствор пропускали через две последовательно соединенные колонки с анионообменным и катионообменным носителями. Объем носителей брали из расчета 1 мл геля на 50 мг суммарного белка раствора. Раствор, прошедший через обе ионообменных колонки без связывания с носителями, содержал очищенный препарат NP-3, тогда как примесные балластные продукты связывались с анионообменным либо с катионообменным носителями.

Таким образом, способ получения средства заключается в том, что измельченную плаценту экстрагируют слабощелочым буфером в присутствии ингибиторов протеолитического расщепления белков, центрифугируют, центрифугат пропускают через хроматографическую колонну с анионообменным носителем, уравновешенную тем же буфером, отмывают колонну от несвязавшегося материала, элюируют белки раствором нейтральной соли, собранный материал разбавляют водой с доведением рН до слабокислого значения и пропускают разбавленный субстрат последовательно через колонну с анионообменным носителем и колонну с катионообменным носителем, уравновешенными буферными растворами с низкой концентрацией солей и рН около 6.0, после стерилизации получают готовый продукт. Раствор, прошедший через обе ионообменных колонки без связывания с носителями, содержал очищенный препарат (NP-3), тогда как примесные балластные продукты связывались с анионообменным либо с катионообменным носителями. Готовый препарат (NP-3) представлял собой белковую фракцию, состоящую из 8-10 компонентов с общей молекулярной массой от 15 до 200 кДа, причем 70-80% фракции приходится на белок с молекулярной массой около 70 кДа, и обладал способностью эффективно защищать клетки мозга от ишемических и иных повреждений.

Пример1

Получение препарата NP-3

Свежий препарат плаценты экстрагируют слабощелочным буфером (например, 0.01 М трис-HCl, рН 8 в присутствии общеупотребляемых ингибиторов протеолитического расщепления белков), центрифугируют и пропускают через хроматографическую колонку с анионообменным носителем (например, ДЕАЕ-целлюлоза), уравновешенную тем же буфером.

Отмывают колонку от несвязанного материала 0,05 М раствором нейтральной соли, например, 0,05 М раствора NaCl на исходном буфере без ингибиторов протеолиза.

Элюируют фракцию целевого продукта пропусканием через колонку 0,15 М раствора NaCl. Собирают белковый пик.

Полученный материал 3-кратно разбавляют дистиллированной водой, доводят рН раствора до 6,0 и пропускают через две последовательно соединенные колонки с анионообменным и катионообменным носителями (например, ДЕАЕ-целлюлоза и КМ-целлюлоза), уравновешенными 0.01 М буферными растворами с рН 6.0. Объем носителей брали из расчета 1 мл геля на 50 мг суммарного белка раствора. Раствор, прошедший через обе ионообменных колонки без связывания с носителями, содержал очищенный препарат NP-3, тогда как примесные балластные продукты связывались с анионообменным либо с катионообменным носителями, которые могли быть регенерированы по стандартным протоколам и использоваться многократно.

Собранный материал стерилизуют (например, фильтрацией через безмикробные фильтры), измеряют концентрацию белка (например, по методу Лоури), фасуют и хранят до использования при -40°С.

Полученный продукт имеет следующие характеристики:

A) По данным электрофореза в 10% полиакриламидном геле (в присутствии додецилсульфата натрия и дитиотреитола): белковая фракция, состоящая из 8-10 родственных компонентов с общей молекулярной массой от 15 до 200 кДа, причем 70-80% фракции приходится на белок с молекулярной массой около 70 кДа.

Б) Главный белковый компонент фракции, на долю которого приходится 70-80% суммарного белка, иммунохимически (с помощью твердофазного иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга) был идентифицирован как альфа-фетопротеин.

(Альфа-фетопротеин (АФП) описан, в частности, в автореферате диссертации С.Ю.Родионова (Пермь - 2003). АФП - это гликопротеин с молекулярной массой 69000 дальтон, состоящий из одной полипептидной цепи, включающей около 600 аминокислот и содержащий около 4% углеводов. Он входит в состав генетического семейства альбуминоидов, расположенного у человека в 4-й хромосоме. В работе исследована эффективность использования АФП в практике терапии следующих внутренних болезней:

- пневмокониозов;

- бронхиальной астмы;

- инфильтративного туберкулеза легких;

- аутоиммунного тиреоидита;

- хронического гепатита и цирроза печени).

B) Выход активного вещества (препарат NP-3), выделенного из тканей плаценты), составляет не менее 100 мг на 1 кг исходного сырья.

Г) Очищенный, стерильно фильтрованный и расфасованный препарат, отправляемый на хранение, представляет собой розоватый прозрачный раствор с концентрацией суммарного белка 1 мг/мл.

Экспериментальная проверка показала, что предлагаемое техническое решение обеспечивает максимальную биологическую стабильность и терапевтическую эффективность препарата, нормализующего функции клеток головного мозга, что подтверждено результатами экспериментов, приводимыми в примерах, иллюстрирующих изобретение.

В экспериментах на лабораторных животных было выявлено следующее.

Пример 2.

Изучение возможной пирогенности препарата

Исследование проводилось на взрослых беспородных кроликах-самцах весом 2,5-3 кг общепринятым методом (ГФ XI, вып.2, с.183) при тест-дозе препарата 0,25 мг на 1 кг массы животного в 1,0 мл изотонического 0,9% раствора натрия хлорида для инъекций.

Показано, что введения препарата не сопровождались подъемом температуры тела, т.е. препарат не обладает пирогенными свойствами.

Пример 3.

Изучение возможной токсичности препарата

A) Общетоксическое действие препарата исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении препарата.

Б) Исследование по изучению острой токсичности было проведено на белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-24 г. Животные были рандомизированно разделены на группы по 5 мышей. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 25 мг/кг, 50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор NaCl.

B) Исследование по изучению подострой токсичности было проведено на белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-200 г, рандомизированно разделенных на группы по 5 животных. Препарат вводили внутримышечно ежедневно в течение 90 дней в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор NaCl. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав периферической крови. Статистически достоверных различий между изучаемыми параметрами в контрольной и опытных группах выявлено не было (р>0.1).

Г) Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев на белых беспородных крысах-самцах с массой тела 150-200 г рандомизированно разделенных на группы по 5 животных. Животные опытных групп получали ежедневно препарат внутримышечно в течение 6 мес. в дозах 1 мг/кг, 10 мг/кг, 100 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl. Животным контрольной группы вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор NaCl в том же объеме. До введения препарата, на 90 сутки и на 180 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав периферической крови, скорость оседания эритроцитов (СОЭ) и содержание общего белка в сыворотке крови по методу Лоури. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, щитовидной железы, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почек, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса и селезенки. Статистически достоверных различий между изучаемыми параметрами в контрольной и опытных группах выявлено не было (р>0.07).

Таким образом, было показано, что введения препарата во всех использованных дозах не сопровождались токсическими реакциями, что свидетельствует о большой терапевтической широте дозировок препарата.

Пример 4. Экспериментальное использование препарата (описание методик см. (Poletaev А.В., Arapov N.A. Pharmacologyonline, 2006, 3, 73-79. (http://www.unisa.it/download/196614518051168815.Poletaev.pdf)

1. Лабораторных взрослых крыс обучали лабиринтному поведению с положительным пищевым подкреплением в водном лабиринте Морриса по стандартным методикам.

2. Лабораторных взрослых крыс обучали поведению пассивного избегания затемненного отсека с электроболевым подкреплением по стандартным методикам.

3. Лабораторных взрослых крыс тестировали на поведение в «открытом поле» по стандартным методикам.

4. Производили двустороннее 30-минутное лигирование обоих сонных артерий на уровне верхних шейных отделов по стандартным методикам.

5. Спустя 3 часа после модельной ишемизации головного мозга животным внутрибрюшинно однократно вводили препарат NP-3 в дозе 0,2 мг/кг веса или церебролизин в дозе 10 мг/кг (активный контроль).

6. Спустя 7 дней оценивали уровень общей двигательной и ориентировочно-исследовательской активности животных и уровень воспроизведения у них ранее выработанных навыков (группы сравнения: 1. крысы после острой ишемии мозга, получавшие церебролизин, 2. крысы после острой ишемии мозга, получавшие препарат NP-3, 3. крысы пассивного контроля, не подвергавшиеся ишемизации).

Влияние препарата NP-3 на выживаемость и функции нервной системы у крыс, подвергавшихся ишемизации головного мозга (Poletaev А.В., Arapov N.A. Pharmacologyonline, 2006, 3, 73-79. (http://www.unisa.it/download/196614518051168815.Poletaev.pdf)

Таблица

  Смертность после острой ишемии мозга Средний уровень локомоторной активности в группах (баллы) Воспроизведение лабиринтных навыков (Средний уровень в группах) Воспроизведение навыков пассивного избегания (Средний уровень по группам животных) 1. Крысы группы активного контроля (n=20) 18% 21 24% 44% 2. Крысы, получавшие NP-3 (n=20) 10%^∗ 48^∗ 77%^∗∗ 85%^∗ 3. Крысы, не подвергавшиеся ишемии мозга (n=12) 0% 52 92% 97% Уровни достоверности отличий:^* - р<0.05, ^** - р<0.01

Предусматривается введение препарата в организм человека в виде назальных капельных вливаний (по 1 капле в каждую ноздрю), ежедневно, на протяжении 12-14 дней, хотя возможно и внутривенное или интралюмбарное введение препарата с соответствующим перерасчетом дозировок.

Изобретение относится к области фармакологии. Средство для защиты клеток мозга содержит доминирующий белковый экстракт из ткани плаценты, полученный посредством хроматографического разделения белковой фракции из 8-10 компонентов с общей молекулярной массой от 15 до 200 кДа, причем 70-80% фракции приходится на белок с молекулярной массой около 70 кДа. Для получения вышеуказанного средства измельченную плаценту экстрагируют слабощелочным буфером в присутствии ингибиторов протеолитического расщепления белков и центрифугируют. Центрифугат пропускают через хроматографическую колонну с анионообменным носителем, уравновешенную тем же буфером, отмывают колонну от несвязавшегося материала, элюируют белки раствором нейтральной соли. Собранный материал разбавляют водой с доведением рН до слабокислого значения и пропускают разбавленный субстрат последовательно через колонну с анионообменным носителем и колонну с катионообменным носителем, уравновешенными буферными растворами до рН около 6.0. После стерилизации получают готовый продукт. Использование способа позволяет получить эффективное средство, нормализующее функции нервной систем, высокой чистоты. 2 н.п. и 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Средство для защиты клеток мозга, содержащее доминирующий белковый экстракт из ткани плаценты, полученный с помощью хроматографического разделения белковой фракции из 8-10 компонентов с общей молекулярной массой от 15 до 200 кДа, причем 70-80% фракции приходится на белок с молекулярной массой около 70 кДа.

2. Средство по п.1, отличающееся тем, что 20-30% фракции приходится на белки с молекулярной массой от 15 до 60 кДа и от 100 до 200 кДа.

3. Способ получения средства для защиты клеток мозга по п.1, заключающийся в том, что измельченную плаценту экстрагируют слабощелочным буфером в присутствии ингибиторов протеолитического расщепления белков, центрифугируют, центрифугат пропускают через хроматографическую колонну с анионообменным носителем, уравновешенную тем же буфером, отмывают колонну от несвязавшегося материала, элюируют белки раствором нейтральной соли, собранный материал разбавляют водой с доведением рН до слабокислого значения и пропускают разбавленный субстрат последовательно через колонну с анионообменным носителем и колонну с катионообменным носителем, уравновешенными буферными растворами до рН около 6.0, после стерилизации получают готовый продукт.