ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЦЕНТРАЛЬНОЙ И ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ СОСУДИСТОГО, ТРАВМАТИЧЕСКОГО, ТОКСИЧЕСКОГО, ГИПОКСИЧЕСКОГО И АУТОИММУННОГО ГЕНЕЗА Российский патент 2012 года по МПК A61K35/30 A61P25/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, фармацевтической промышленности, ветеринарии, и представляет собой фармацевтическую композицию, обладающую репаративно-регенеративным действием на нервную ткань, предназначенную для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, и состоящую из биологически активного белково-полипептидного комплекса, включающего органоспецифические факторы роста и дифференцировки нервной ткани, а также сигнальные молекулы в терапевтически эффективных соотношениях и концентрациях, и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Фармкомпозиция представляет собой биологически активный белково-полипептидный комплекс с молекулярной массой входящих в него белково-полипептидных компонентов в пределах от 5 до 200 кДа, с содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 10 до 120 кДа не менее 80%, с общей концентрацией белка 0,8-4,2 мг/мл с максимумом поглощения ультрафиолетовый спектр раствора при длине волны 280±5 нм, наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений pI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель включающий буферный раствор и вспомогательные вещества - высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы в достаточных концентрациях. Субстанция получена путем ионообменной хроматографии фильтрата гомогената ткани, в присутствии буферного раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза из мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности.

Известен целый ряд препаратов белково-пептидной природы из сырья животного происхождения, обладающих ноотропной и нейрометаболической активностью, которые используются для лечения заболеваний нервной системы. К наиболее близким по достигаемому эффекту относятся: Церебролизин - средство для лечения геморрагического или ишемического инсультов, фирмы «Ebewe» (Австрия) [1], который является продуктом обработки мозга интактных свиней; Цереброкурин - лечебное средство при заболеваниях, сопровождаюшихся нарушением функций центральной нервной системы, фирмы ООО «НИР» (Украина) [2], который является продуктом обработки мозга эмбрионов животных;

Кортексин - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней, фирмы ООО «Герофарм» (Россия) [3], обладающий ноотропным, церебропротекторным, противосудорожным и антиоксидантным действием; Церебролизат - препарат, повышающий устойчивость ткани головного мозга к интоксикации, гипоксии, гипогликемии, механической травме, фирмы «Микроген» НПО ФГУП (Иммунопрепарат) [4], обладающий ноотропным действием, представляющий собой гидролизат коры головного мозга крупного рогатого скота.

В состав "Церебролизина" входят аминокислоты (-85%), низкомолекулярные пептиды (-15%), микроэлементы, сырьем для получения которых служит мозг свиней. Нейропротективное и трофическое действие препарата осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот, молекулярной массы не выше 10000 дальтон, из которых доминирующими и определяющими свойства препарата являются аланин, лейцин и лизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Недостатком известного препарата является значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и крайне низким регенеративным, в том числе и репаративным потенциалом для нервной ткани.

В состав «Цереброкурина» входят водорастворимые пренатальные нейропептиды и продукты расщепления неактивных высокомолекулярных предшественников из гомогенизата мозга эмбрионов животных, который после разбавления физиологическим раствором подвергают взаимодействию с иммобилизованным протеолитическим ферментом, причем режим взаимодействия устанавливают исходя из контрольной пробы получаемого средства, и полученный раствор выдерживают в течение 30 суток при температуре не выше 10°С. С помощью данной технологии достигается более высокая (по сравнению с Церебролизином) активность получаемого средства и значительно расширяется спектр его действия, за счет более высокой массы содержащихся пептидов и низкомолекулярных белков, оставшихся после протеолиза. Однако несмотря на длительное формирование раствора до окончания процессов агрегации и протеолиза данная технология не позволяет получить фракцию необходимой степени очистки для применении препарата внутривенно, что значительно затрудняет его биодоступность. Водная экстракция без буферизации раствора, детергентов, ингибиторов протеолиза и солюбилизаторов на этапах получения Цереброкурина, а также неопределенные сроки гестации эмбрионального мозга животных не позволяют обеспечить необходимую степень стандартизации, что допускает значительный разброс по составу полученных эволюционно закрепленных белково-пептидных концентрационных соотношений, снижая его тканеспецифическую нейрорегенеративную активность и стабильность фармакологического действия, ограничиваясь биологическим действием по типу обратной связи за счет сигнальной функции продуктов протеолиза ткани.

В состав «Кортексина» входит комплекс водорастворимых биологически активных щелочных, кислых и нейтральных полипептидов с мол. м. от 500 до 15000 Да и изоэлектрической точкой 3,5-9,5, получаемых из измельченной замороженной ткани головного мозга скота путем экстракции раствором уксусной кислоты, содержащей хлористый цинк, отделения осадка, обработки надосадочной жидкости ацетоном, промывки образовавшегося осадка ацетоном, высушивании с последующей очисткой, стерилизации и лиофилизации целевого продукта.

Препарат предназначен для внутримышечного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных низкомолекулярных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время. Несмотря на то, что препарат участвует в регуляции соотношений тормозных и возбуждающих аминокислот, концентрации серотонина и дофамина, оказывая ГАМК-позитивное влияние, снижает токсические эффекты нейротропных веществ, улучшает процессы обучения и памяти, ускоряет восстановление функций головного мозга после стрессорных воздействий, Кортексин имеет невысокую активность и специфичность в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и низким регенеративным, в том числе незначительным репаративным, потенциалом для нервной ткани, что требует значительной продолжительности курсового лечения.

В состав «Церебролизата» также входят водорастворимые полипептиды как результат гидролиза коры головного мозга крупного рогатого скота, обладающие слабой ферментативной активностью, с молекулярной массой не более 15000 Да. Обозначенная в патенте вариация аминокислотного состава препарата допускает значительный разброс по составу полученных пептидных концентрационных соотношений, определяя низкую тканеспецифическую активность и стабильность фармакологического действия - со слабым нейрометаболическим и невыраженным ноотропным эффектом.

Неуклонный рост сосудистых заболеваний центральной нервной системы, а также увеличение количества случаев травматического, токсического и гипоксического поражения головного и спинного мозга (ДТП, техногенные катастрофы, природные катаклизмы…) побуждает фармакологов к поиску новых, более эффективных препаратов для успешного лечения больных неврологического и нейрохирургического профиля, реабилитации этих пациентов и снижения уровня инвалидизации населения.

Целью данного изобретения явилось создание фармацевтической композиции, обладающей выраженным репаративно-регенеративным действием на нервную ткань, для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза.

Поставленная цель достигается тем, что фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, выполнена в виде раствора для парентерального, интраназального и субъконьюктивального введения и содержит в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, получаемый из быстроразмороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой, до середины последней трети беременности, гомогенизацией его в буферном растворе, содержащем ЭДТА (этилендиамино-тетрауксусную кислоту), отделением гомогената от балластных веществ фильтрованием, центрифугированием, отделением белков и пептидов хроматографией на колонке хроматографической с анионообменным носителем, уравновешенной буферным раствором, со ступенчатым градиентом буферного раствора, ультрафильтрацией, обессоливанием и стерилизующей фильтрацией, и включающий отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений рI от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.

При этом фармацевтическая композиция в качестве разбавителя предпочтительно, может содержать фармакопейный буферный раствор и вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.

Итак, поставленная цель достигается описываемой фармкомпозицией, содержащей в качестве активного инградиента биологически активный белково-полипептидный комплекс, состоящий из отрицательно заряженных слабокислых, нейтральных белков и полипептидов с молекулярной массой от 5 до 200 кДа, полученных из эмбриональной ткани мозга копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети, до середины последней трети беременности, включающий органоспецифические факторы роста и дифференцировки нервной ткани, а также сигнальные молекулы в терапевтически эффективных соотношениях и концентрациях, фармацевтически приемлемый разбавитель, состоящий из буферного раствора, например фосфатный буфер, и вспомогательных веществ - высокомолекулярные соединения, например кармелоза; стабилизаторы, например маннитол, консерванты, например нипагин, и солюбилизаторы, например полисорбат-80.

Заявляемая фармакологическая композиция, представляющая собой белково-полипептидный комплекс и фармацевтически приемлемый разбавитель, отличается от заявленных ранее субстанций и композиций, выделенных из головного мозга животных, по источнику сырья, взятого на определенных сроках гестации, молекулярным массам входящих в него белково-полипептидных фракций (до 200 кДа), их качественному составу, по эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношениям белков роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул, по способу применения (парентерально, интратекально, интраназально, субъконбюктивально), по безопасности применения (отсутствие токсических, мутагенных, канцерогенных и аллергизирующих свойств), по биологической и фармакологической активности и ее специфичности (ткане- и органоспецифичная, репаративно-регенеративная). Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ получения биологически активного комплекса.

Получение белковой фракции из эмбрионального мозга свиней. 250 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов свиней сроком гестации 14 недель размораживают и гомогенизируют в 1200 мл 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,1% мальтозы, в течение 7 минут при 8°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 18000 g и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 8°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0,05 М ТРИС-глициново-фосфатного буфера рН 7,0, содержащего 0,1 мМ ЭДТА и 0,1 мМ NaCl, хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650М. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом, повышая концентрацию соли с шагом 10%, собирая целевые фракции. Хроматографический процесс производят при температуре 8°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 0,05 М раствором глицин-NaOH рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белковой фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 250 до 350 нм; максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют следующими методами: гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 200 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем 82% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значении рI 4,2 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле, и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Аминокислотный анализ, %: Asp - 10,82±2,8; Thr - 5,4±1,6; Ser - 5,2±1,8; Glu - 16,2±3,4; Pro - 7,045±2,5; Gly - 5,2±2,4; Ala - 5,4±1,8; Val - 7,08±2,9; Met - 2,65±1,4; He - 4,45±1,8; Leu - 9,4±2,6; Tyr - 4,02±1,2; Phe - 4,8±1,9; Orn - 0,48±0,2; Lys - 8,48±2,4; His - 2,8±0,9; Arg - 6,52±2,2.

Пример 2. Способ получения биологически активного комплекса.

Получение белковой фракции из эмбрионального мозга поросят. 200 г быстрозамороженного головного мозга эмбрионов поросят сроком гестации от 20 до 22-х недель размораживают и гомогенизируют в 800 мл 50 мМ Трис-малеатного буферного раствора рН 5,8,содержащего 1 мМ (ЭДТА) и 0,1% маннит, в течение 5 минут при 25°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при 30000 g в течение 30 минут и фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм при 25°С. Фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,1 мМ ЭДТА, хроматографическую колонку объемом 250 мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом малеатного буферного раствора рН 5,8, содержащего 0,04 М NaCl, повышая концентрацию соли с шагом 0,02 М, начиная сбор целевых фракции с концентрации соли 0,06 М. Хроматографический процесс производят при температуре 2-4°С. Целевую фракцию поэтапно подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см² через материалы с задерживающей способностью 5 кДа и 200 кДа, обессоливают, разводят 50 мМ раствором аспартата-NaOH рН 7,4 до концентрации белка 1,0 мг/мл, добавляя моноолеат полиоксиэтиленсорбита (Твин-80) до общей концентрации 0,01 мг/мл. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм. Для характеристики полученной белково-полипептидной фракции использовали методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 250 до 350 нм; максимум поглощения отмечается при длине волны 280±5 нм. Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, ределяют следующими методами: гель-хроматографии на Superdex 75 («GE Healthcare») и методом денатурирующего «SDS-Page» электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков. Для калибровки колонки используют белковые стандарты с диапазоном молекулярных масс от 13 кДа до 250 кДа. Перечисленными выше методами установлено, что в состав препарата входят отрицательно заряженные слабокислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем 82% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений рI 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.

Аминокислотный анализ полученного комплекса, %: Asp - 10,82±1,3; Thr - 5,4±0,9; Ser - 5,2±1,1; Glu - 16,2 db 1,9; Pro - 7,045±1,7; Gly - 5,2±0,8; Ala - 5,4±1,1; Val - 7,08±2,3; Met - 2,65±0,6; He - 4,45±0,8; Leu - 9,4±2,5; Tyr - 4,02±0,6; Phe - 4,8±1,1; Orn - 0,48±0,1; Lys - 8,48±2,3; His - 2,8±0,7; Arg - 6,52±2,1.

Пример 3. Способ получения фармкомпозиции.

Полученный по примеру 1 раствор биологически активного комплекса из эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ глициново-фосфатным буферным раствором, с общим содержащим, 0,5% маннитола, 0,1% кармелозы, 0,0005% полисорбата 80 и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН 8,0, с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9-1,2 мг/мл. То есть композиция может содержать биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,9 мг/мл, 1 мг/мл, 1,2 мг/мл.

Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.

Свойства полученной фармкомпозиции были изучены с помощью общепринятых методик по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ [5].

Пример 4. Способ получения фармкомпозиции.

Полученный по примеру 2 раствор биологически активного комплекса из эмбрионального мозга свиней разбавляют 50 мМ малеатным буферным раствором рН 5,8, с общим содержащим 0,3% молочной кислоты, 0,5% маннита, 0,1% кармелозы, до 0,0005% полисорбата 80 с расчетом конечной концентрации общего белка в полученном растворе в пределах 0,9-1,2 мг/мл, т.е. фармкомпозиция может содержать биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,9 мг/мл, 1 мг/мл, 1,2 мг/мл.

Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.

Пример 5. Исследование токсичности

Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной фармкомпозиции. Лекарственная форма: стерильный интраназальный дозированный спрей в стеклянном или полимерном флаконе емкостью 10 и 30 мл (0,1 мг/мл); раствор для инъекций: 5 ампул по 1 мл (0,1 мг/мл), 5 ампул по 2 мл (0,1 мг/мл), 1 ампула по 2 мл (0,2 мг/мл). Максимальная рекомендуемая суточная доза 0,4 мг при эндолюмбальном введении и 0,1 мг при внутривенном введении.

Условия проведения эксперимента и методы исследований

Целью исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз оригинальной фармкомпозиции. Исследование проводили на мышах обоего пола линии BALB/C массой 18-20 г при внутрижелудочном и внутрибрюшинном способах введения. Срок наблюдения составил 14 дней. Животные получены из питомника, паспортизированы.

Животных содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 10 особей, количество в группе - 10. Для кормления использовали комбинированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. Максимально возможная для введения мышам доза готовой лекарственной формы 0,2 мл и составила 10 мг/кг, что превысило суточную терапевтическую дозу в 600 раз. Из эксперимента животных выводили эфирным наркозом, подвергали вскрытию и анализу состояния внутренних органов.

Результаты исследования острой токсичности

Мыши. Масса животных составила от 18 до 20 г. Вводимая доза 0,2 мл, что составило 10 мг/кг. Количество животных в группе 10 голов. Всего две группы: внутрижелудочное и внутрибрюшинное введение. Срок наблюдения 14 суток.

Внешний вид. К концу эксперимента все животные выглядели здоровыми. Шерстяной покров густой, белого цвета. По внешнему виду животные между группами не отличались.

Поведение. Не отличалось между группами и от нормы.

Смертность. Во всех трех группах летальных исходов зафиксировано не было.

Масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено шесть контрольных взвешиваний. Резкой потери или увеличения не выявлено.

Внутренние органы. По состоянию внутренних органов группы не отличались между собой. Изменения или увеличения внутренних органов не наблюдалось.

Исследование подострой (субхронической) токсичности

Условия проведения эксперимента и методы исследований

Исследования токсичности оригинальной фармкомпозиции в субхроническом эксперименте проводили на самцах и самках крыс линии Вистар массой от 200 до 250 г. Животные получены из питомника. Крыс содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 5 особей. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. До начала эксперимента животных выдерживали в карантине в течение 10 дней. В группе 10 животных (5 самцов и 5 самок). Группы разделены следующим образом:

1 группа (контроль) интактные животные

2 группа - оригинальная фармкомпозиция т.д. подкожное введение (п/к)

3 группа - оригинальная фармкомпозиция × 10 п/к

4 группа - оригинальная фармкомпозиция внутривенное введение (в/в) т.д.;

5 группа - оригинальная фармкомпозиция в/в × 10.

Срок наблюдения: 1 месяц введения, 1 месяц наблюдение резорбтивного действия.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения:

по выживаемости и общему виду (шерстяной покров, глаза, уши, конечности, зубы);

состоянию и поведению животных (активность, походка, темперамент, питание);

изменению массы тела (взвешивание крыс проводили до начала и в конце эксперимента);

физиологическим функциям (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет).

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали кровь:

морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина); биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатинина, глюкозы), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Забор крови для гематологических исследований производили из хвостовой вены. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия. После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза для патоморфологических исследований органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме. Для патоморфологических исследований образцы ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия). Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными данными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования.

Макроскопические исследования

Выживаемость: все подопытные животные перенесли все способы введения. Гибели не наблюдалось ни в экспериментальных, ни в контрольных группах животных.

Поведение: Каких-либо существенных отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии подопытных животных по сравнению с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью.

Внешний вид: все животные были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета, без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.

Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное, обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы.

Клинические исследования

Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная. Достоверных различий между опытными и контрольными животными нет.

Гематологические показатели: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.

Биохимические исследования: пептидный комплекс в испытуемой дозе не влиял на уровень содержания общего белка сыворотки крови подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия изучаемого препарата на белокобразующую функцию печени. Для выявления возможного повреждающего воздействия на печень в сыворотке крови животных во время хронического эксперимента определяли активность щелочной фосфатазы, аспартат и аланинаминотрансферазы.

Анализ полученных данных показал отсутствие достоверных изменений активности указанных ферментов сыворотки крови.

Патоморфологические данные: Макроскопическое исследование.

У животных во всех группах при вскрытии кожа чистая, подкожно-жировой слой развит умеренно. Расположение внутренних органов правильное, свободной жидкости ни в плевральной и ни в брюшной полостях нет. Просвет трахеи и бронхов свободен, слизистая их чистая, влажная блестящая. Ткань легких опытных групп более интенсивно окрашена, чем у животных интактного контроля, однако без признаков отека. Миокард на разрезе без патологических изменений.

Язык чистый. Слизистая полости рта и пищевода без дефектов. Желудок и кишечник без следов раздражения. Печень не увеличена.

Капсула почек отделяется легко, мозговое и корковое вещество на разрезе хорошо различимы.

Селезенка с гладкой капсулой, на разрезе серовато-бурого цвета, пульпа без соскоба.

Семенники и яичники без особенностей.

Тимус сероватого цвета, без кровоизлияний.

Щитовидная железа плотная с симметричными долями.

Оболочки головного мозга умеренного кровенаполнения, влажные, блестящие. Мозговое вещество имеет симметричный рисунок на разрезе.

Весовые индексы органов испытуемых животных не имели достоверных отличий от контрольных групп.

Микроскопическое исследование

во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла, патоморфологических изменений не выявлено.

Исследование субхронической токсичности при интраназальном введении.

На половозрелых животных.

Исследования проводили на половозрелых кроликах самках породы Шиншилла весом 2500 г. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 1 месяц.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл.

Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия.

После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.

Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.

Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия).

Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования

1. Визуальные наблюдения:

Выживаемость: все подопытные животные перенесли введение фармкомпозиции в исследуемых дозах. Гибели не наблюдалось.

Поведение: повышенной или пониженной активности у подопытных животных сравнительно с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус у подопытных животных и контрольных не отличался повышенной возбудимостью. Замечено, что введение препарата не вызывает у животных чувство дискомфорта.

Внешний вид: все животные независимо от применяемой дозы были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета, без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.

Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы; экскрет по цвету и оформленности не отличался от контроля.

2. Клинические исследования:

Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная, и достоверно не отличалась от интактного контроля.

Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.

Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах нормы. Концентрация белка у кроликов, получавших фармкомпозицию 1 и 2 раза в день статистически не различалась.

3. Патоморфологические данные:

Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла, патоморфологических изменений не выявлено.

Таким образом, проведены исследования субхронической токсичности назальной формы фармкомпозиции. При субхроническом исследовании спрея не было выявлено значимых изменений внутренних органов испытуемых животных, не обнаружено местнораздражающего действия. При изучении субхронической токсичности использовали клинические методы исследования, общепринятые методы исследования гематологических, биохимических показателей крови, а также гистологических исследований внутренних органов и слизистых носа.

Исследование субхронической токсичности на неполовозрелых кроликах при интраназальном введении на неполовозрелых животных

Исследования проводили на 3-недельных крольчатах породы Шиншилла весом от 300 до 500 г. Нанесение препарата производили ежедневно 1 и 2 раза в день по 1 впрыску в течение 2 недель. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха 18-20°С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,2 мл, вводимая ежедневно 2 раз в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 2 недели.

Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям слизистых оболочек носа.

Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия.

После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патологоанатомической схеме.

Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.

Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия).

Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.

Результаты исследования

Оценка раздражающего действия на слизистую оболочку носа

Прижизненные биомикроскопические исследования

На протяжении всего срока наблюдения у животных сохранялось нормальное поведение, выделений из носовых ходов и образования корок не замечено. При использовании капель у кроликов возникал рефлекс чихания, который прекращался через 1-2 минуты. При закапывании капель как в терапевтической группе, так и в группе превышенной дозы у крольчат отмечалось механическое раздражающее действие, выразившееся в рефлексе чихания, подергивания носом, животные терли лапами нос.

Контрольная интактная группа. Слизистая оболочка бледно-розового цвета, без отеков и выделений. Во время наблюдение с отоларингологическим зеркалом изъянов на эпителии не обнаруживались. Слизистое отделяемое носа прозрачного водянистого вида. Рефлексы соответствовали физиологической норме.

При конфокальной микроскопии: эпителиальный слой имеет плотно упакованную структуру четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами.

В группе терапевтической дозы слизистые носа оставались чистыми на протяжении всего срока наблюдения: слабо-розового цвета без выделений, отеков не наблюдалось. Сосуды слизистой оболочки не изменены. Состояние эпителия исследовали на щелевом освещение. Ни в одном случае патологических изменений не выявлено.

В группе ×10. Ни в одном случае патологических изменений слизистой не выявлено.

Клинические и биохимические исследования

Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы. Показатели, полученные в опытных группах, достоверно не отличались от контрольных групп интактных животных и препарата сравнения.

Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах номы.

Заключение. Проведены исследования токсичности в субхроническом эксперименте на неполовозрелых животных оригинальной фармкомпозиции.

Введение препарата интраназально как в терапевтической дозе, так и в десятикратно превышающих в течение 2 недель не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови. Не оказывало местнораздражающего действия.

Пример 6. Мутагенность фармкомпозиции

Для оценки мутагенных свойств заявляемого белково-полипептидной фармкомпозиции применили набор следующих тестов:

- учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella/микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium

ТА 97, ТА 98 и ТА 100;

- учет микроядер в клетках костного мозга мышей. Испытан образец белково-полипептидной фармкомпозиции, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 0,1 мг/мл.

Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции в тесте Эймса

Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и (или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований, - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.

Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). Если тестируемое соединение и (или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидинзависимых штаммов Salmonella typhimurium.

Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100). Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика. Регламент работы с бактериальными культурами, проверка генотипов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для проведения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.

Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Wistar, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.

Белково-полипептидная фармкомпозиция в виде стерильного раствора с содержанием белка 0,1 мг/мл, исследовали 1,0 и 0,3 мл исходного раствора на чашку и три 10-кратных разведения в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 300; 100; 10; 1 и 0,1 мкг на чашку.

Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у соответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в количестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0,1 мл на чашку).

Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 100°С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой 45-46°С.

Сначала в пробирки с агаром вносили 0,1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при 37°С. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.

Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.

Исследованная белково-полипептидная фармкомпозиция во всех тестируемых концентрациях не показала мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без- и в присутствии системы метаболической активации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.

Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной композиции микроядерным методом в клетках млекопитающих

Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках. Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии аннателофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.

Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.

Эксперименты проводили на самцах и самках мышей-гибридов F1 (CBA×C57BI6/J) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза испытана на самцах и самках при пятикратном введении.

Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения белковополипептидной фармкомпозиции в клинике - внутривенный или эндолюмбальный, в данном исследовании использовали внутрибрюшинное введение субстанции мышам. Дозу белково-полипептидного комплекса для оценки мутагенной активности рассчитывали исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано внутривенное введение белково-полипептидной фармкомпозиции в количестве 2 мл при концентрации 0,1 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка, может составить 0,05 мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,42 мг/кг).

В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу 10 мг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 0,1 мг/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0,1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 1,7 мг/кг.

Было сформировано 7 групп животных: четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0,1 мг/кг вводили пятикратно с интервалом 24 часа самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 часов после последнего введения белково-полипептидного комплекса.

В двух других опытных группах белково-полипептидный комплекс вводили однократно самцам в дозах 0,2 мг/кг и 0,5 мг/кг.

В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили внутрибрюшинно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве позитивного контроля использовали циклофосфамид в дозе 20 мг/кг, растворенный ex tempore в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 часа до забоя.

Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом». Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 часов после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку (НПП ПанЭ-КО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 минут, супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспендировали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 минуты. Окрашивали по методу Романовского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты расшифровывали по окончании анализа.

Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.

Статистическую обработку результатов по учету микроядер проводили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию Х2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.

Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей: во всех вариантах опыта белково-полипептидная фармкомпозиция не вызывала увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих контрольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при внутрибрюшинном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62,1% против 3,16% в контроле, Р<0,001). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия композиции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (циклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005).

Таким образом, мутагенная активность белково-полипептидной фармкомпозиции не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам внутрибрюшинно в дозе 0,42 мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной терапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения белково-полипептидной фармкомпозиции самцам в максимально возможной дозе - 10 мг/кг. Белково-полипептидный комплекс не проявил токсического действия по показателю «доля полихроматофильных эритроцитов».

Заключение по оценки мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции

Белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса Salmonella/микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.

Пример 7. Влияние фармкомпозиции на выживаемость крыс в условиях ишемического поражения мозга при перевязке обеих сонных артерий (неполная глобальная ишемия мозга)

Исследование проводили на крысах-самцах линии Вистар массой 180-250 г в условиях необратимой двусторонней окклюзии общих сонных артерий [3-5]. Полученных из питомника лабораторных животных подвергали карантину в течение 5 дней. Все ветеринарные манипуляции проводились в асептических условиях, позволяющие сохранить статус экспериментальных животных. Для содержания экспериментальных животных использовали стандартные условия [6]. У крыс под эфирным наркозом (эфир диэтиловый х/ч, ОАО «Медхимпром») в области шеи по средней линии делали небольшой разрез кожи длиной 8-10 мм, для обеспечения доступа к сонным артериям. Выделяли обе сонные артерии, отделяя блуждающий и симпатический нервы, проходящие вместе с артериями. Под сосуды подводили шелковые лигатуры (Silk blk 17×45 CM/M3/USP2/ Non needled/ «Ethicon Johnson & Johnson», кат. № W203) и вместе с ассистентом производили одномоментную перевязку обеих сонных артерий тройным хирургическим узлом. Кожный разрез зашивали хирургическим шелком (Silk blk 100 см/M5/Sgle armed KP-3USP2/Non needled/«Ethicon Johnson & Johnson», кат. № W794), накладывая один или два хирургических кожных шва, с последующей обработкой раны 5% раствором настойки йода. Физиологический раствор или фармкомпозицию вводили внутрибрюшинно. Продолжительность всех манипуляций составляет 8-10 минут, затем животных помещают в клетку. Для исследования использовали три группы животных:

- группа 1 - контрольные животные после перевязки сонных артерий, получавшие физиологический раствор стерильным одноразовым инсулиновым шприцем 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов после перевязки сонных артерий;

- группа 2 - ложнооперированные животные, у которых проводились те же манипуляции, что и у контрольных, только без перевязки сонных артерий, которым вводили физиологический раствор 0,5 мл на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов;

- группа 3 - животные после перевязки сонных артерий, которым вводили фармкомпозицию в дозе 0,5 мл 0,1% раствора (0,2 мг/кг) на крысу через 1 час и 0,5 мл на крысу через 5 часов.

Выживаемость животных отслеживали сразу после проведения процедуры перевязки и в течение первых суток, т.е. конечную выживаемость фиксировали через 24 часа. Биологическая активность препарата в виде защиты головного мозга в условиях неполной глобальной ишемии при одномоментной перевязке сонных артерий оценивалась следующим образом:

- выраженная - при выживании более 80% крыс;

- средневыраженная - при выживании 70-80% крыс;

- невыраженная - при выживании менее 70% крыс.

Статистическую обработку данных проводили с использованием точного критерия Фишера с учетом множественности сравнений.

Проведенные опыты показали, что в контрольных опытах после перевязки обеих сонных артерий в первый час погибает наибольшее количество животных, т.е. 11 из 24, а через сутки еще 4 животных, всего погибло 15 крыс из 24 (63%, табл.1). Среди ложнооперированных животных погибло 2 крысы сразу после операции (17%). Фармкомпозиция при введении крысам через 1 час и 5 часов по 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) внутрибрюшинно вызывала гибель только двух животных, а 34 из 36 крыс выжило. Увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем составляет 95%. Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1 Влияние фармкомпозиции на выживаемость крыс в условиях перевязки обеих сонных артерий. Группы животных Выраженная биоактивность выжившие умершие 1 группа Контроль - 24 крысы 9 из 24 (37%) 15 из 24 63% 2 группа Ложно оперированные - 12 крыс 10 из 12* (83%) 2 из 12 (17)% 3 группа Фармкомпозиция 0,2 мг/кг - 36 крыс 34 из 36* (95%) 2 из 36 (5%) * - Р<0,01 по сравнению с контролем.

Таким образом, фармкомпозиция оказывает статистически значимое увеличение выживаемости животных по сравнению с контролем в условиях неполной глобальной ишемии мозга, вызываемой одномоментной перевязки обеих сонных артерий.

В результате проведенных исследований установлено, что заявленная фармкомпозиция обладает выраженным нейропротекторным и нейрометаболическим действием, стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию нервной ткани, превосходит по биологической активности препарат сравнения - церебролизин.

Заявленная фармкомпозиция может найти применение при создании новых лекарственных препаратов для лечения для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза.

Пример 8. Изучение влияния фармакологической композиции на локальный мозговой кровоток в коре головного мозга наркотизированных крыс в условиях глобальной преходящей ишемии

Опыты проводили на наркотизированных крысах-самцах линии Вистар массой 220-250 г при естественном дыхании. Крыс наркотизировали уретаном (фирма Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germany) в дозе 1400 мг/кг внутрибрюшинно.

Методика. Состояние мозгового кровообращения у животных оценивали по регистрации локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс с помощью метода лазерной допплеровской флоуметрии. Для регистрации локального мозгового кровотока в теменной области коры головного мозга крыс использовали флоуметр ALF-21 фирмы "Transonic System Inc." (США). Для этой цели игольчатый датчик флоуметра диаметром 0,8 мм устанавливали на теменной области коры большого мозга крысы с помощью микроманипулятора и коромысла. Одновременно регистрировали изменения артериального давления через предварительно введенный в бедренную артерию полиэтиленовый катетер. Запись показателей кровотока и артериального давления производили на полиграфе фирмы «BIOPAK» США и персональном компьютере. Фармакологическую композицию вводили в дозе 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) через полиэтиленовый катетер в бедренную вену животных.

Модель глобальной преходящей ишемии широко используется для изучения, как нарушений мозгового кровотока, так и изменений различных биохимических показателей функции мозга, происходящих после ишемического поражения. Глобальную преходящую ишемию у крыс вызывали 10-минутной окклюзией обеих общих сонных артерий с помощью специальных зажимов с одновременным снижением артериального давления до 40-50 мм рт.ст. путем забора артериальной крови из предварительно вставленного полиэтиленового катетера в бедренную артерию. Через 10 минут зажимы с сонных артерий снимают, а забранную ранее кровь вводят обратно животному [3-5].

Результаты исследования обрабатывали методом вариационной статистики с помощью дисперсионного анализа для повторных измерений и критерия множественных сравнений по Даннету с использованием программы Biostat.

Результаты исследования

Проведенные опыты показали, что в результате глобальной преходящей ишемии в коре головного мозга крыс наблюдается резкое снижение локального мозгового кровотока, которое в среднем составляет 6,1±1,0 усл. ед. или 82±2,2% от исходного уровня. После снятия зажимов с сонных артерий и последующей реинфузии крови наблюдается резкое увеличение локального кровотока, которое постепенно снижается и через 30 минут после реперфузии составляет в среднем 25±2,8 усл. ед. или 23±2,4% от исходного уровня (р<0,05).

Фармакологическая композиция, введенная через 30 минут после реперфузии внутривенно в дозе 0,2 мг/кг (0,5 мл 0,1% раствора) уже через 10 минут после введения в большинстве опытов вызывал увеличение локального мозгового кровотока в коре головного мозга крыс в среднем на 12±3,3% (в 7 из 10 опытов). Статистически значимое увеличение локального мозгового кровотока начинало проявляться на 50 минуте, которое составляло в среднем 39±9,2%, и продолжалось до 90 минуты наблюдения (табл.2). 3десь следует отметить, что в контрольных опытах с введением физиологического раствора уровень локального мозгового кровотока практически не изменяется.

Параллельно изменениям мозгового кровотока проводили регистрацию артериального давления. Опыты показали, что через 10 минут после введения фармакологической субстанции крысам наблюдалось постепенное снижение уровня артериального давления, которое через 50 минут снижалось в среднем на 15±3,4% и оставалось пониженным до конца эксперимента (табл.).

Следует отметить, что в контрольных опытах с введением физиологического раствора также наблюдается небольшое снижение уровня артериального давления в среднем на 18%, поэтому можно сказать, что фармакологическая субстанция не оказывает существенного влияния на уровень артериального давления.

Заключение

Таким образом, в результате проведенного исследования показано, что фармакологическая субстанция увеличивает выживаемость экспериментальных животных в условиях полной перевязки сонных артерий. Вместе с тем, фармакологическая субстанция увеличивает локальный мозговой кровоток в коре головного мозга крыс, сниженный после глобальной преходящей ишемии головного мозга, который к концу эксперимента по величине превосходит контрольный уровень, наблюдаемый до ишемии. Можно полагать, что повышение выживаемости животных при перевязке сонных артерий под влиянием фармакологической субстанции может быть обусловлено его способностью усиливать кровоснабжение коры головного мозга экспериментальных животных.

Пример 9. Нейропротекторные свойства фармкомпозиции при глутаматной токсичности in vitro

Исследование нейропротекторных свойств фармкомпозиции из биологически активного белково-полипептидного комплекса при глутаматной токсичности in vitro выполнено на 7-дневных культурах клеток-зерен мозжечка, полученных из мозга 7-суточных крыс линии Вистар методом ферментно-механической диссоциации. Диссоциацию ткани мозга проводили следующим образом: выделенные мозжечки переносили в пластиковую чашку Петри, заполненную фосфатным буфером, промывали этим же раствором несколько раз и измельчали. Фрагменты ткани инкубировали 15 мин при 37°С в смеси ферментов, приготовленной на фосфатном буфере и содержащей 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА. После инкубации ткань промывали в двух сменах фосфатного буфера и 1 раз средой культивирования, далее подвергали механической диссоциации в среде культивирования. Питательная среда содержала: 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глутамина и 10 мМ буфера HEPES, рН 7,2-7,4. Суспензию клеток центрифугировали 1 минуту при 1000 об/мин, супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в питательной среде, где концентрация K⁺ была доведена до 25 мМ, что оказывает трофическое действие на клетки-зерна мозжечка. Культивирование производили в 96-луночных пластиковых камерах. В каждую ячейку добавляли 0,1 мл суспензии клеток. Культуры развивались в СО₂-инкубаторе при температуре 35,5°С и относительной влажности 98%.

К 7 дню культивирования, при созревании глутаматных рецепторов, проводили токсическую обработку глутаматом (25, 37, 50 мкМ, 15 мин) в сбалансированном солевом растворе следующего состава (в мМ): 154 NaCl, 25 KCl, 2,3 CaCl₂, 1 MgCl₂ 3,6 NaHCO₃, 0,35 Na₂HPO₄, 10 HEPES (рН 7,6), в течение 15 минут, затем промывали дважды, в третью смену раствора вносили фармкомпозицию (0,05 и 0,1 мг/мл), в качестве контроля в том же объеме - Н₂О, глициновый буфер и бычий сывороточный альбумин (0,15 мг/мл), оставляли на 4 часа в CO₂-инкубаторе для развития нейродегенерации. Затем фиксировали 20 минут смесью формалин-спирт-уксусной кислоты (ФУС) в пропорции 2:7:1, окрашивали трипановым синим и заливали глицерином, съемку проводили цифровой камерой.

Оценку жизнеспособности нейронов проводили с помощью подсчета нейронов с нормальной морфологией на фиксированных препаратах, окрашенных трипановым синим и заключенных в глицерин. На каждую точку было использовано по 3 сестринских культуры, клетки считали в 5 полях зрения с культуры при объективе ×40. Выживаемость вычисляли как процент от контроля.

Защитный эффект нагляднее видно, если вычислить коэффициент эффективности защиты (КЭЗ) по формуле:

KЭЗ=(N_o-N_в)/N_o×100%,

где N_o - средний процент гибели нейронов от повреждающего воздействия (в данном случае - глутамата) в культурах с добавлением Н₂О, N_в - средний процент гибели нейронов в культурах с добавлением фармкомпозиции. Этот параметр позволяет сравнивать эффективность действия различных веществ на разных моделях ишемии.

Результаты исследования

1 серия. Диссоциированные культуры мозжечка состоят из нейронов и глиальных. Нейрональная популяция представлена клетками-зернами, поскольку остальные типы нейронов мозжечка более крупные и к моменту диссоциации уже дифференцированы, следовательно, не переживают эту процедуру. Клетки-зерна - самый многочисленный класс нейронов головного мозга, они морфологически и нейрохимически однородны. К 7 дню культивирования происходит созревание глутаматных рецепторов.

3-4-часовое пребывание в сбалансированном солевом растворе с добавлением глицинового буфера (GB) и бычьего сывороточного альбумина (BSA), а также 0,05 и 0,1 мг/мл фармкомпозици не приводило к изменению количества живых нейронов по сравнению с контролем.

Глутамат в концентрации 25, 37, 50 мкМ (15 мин) вызывал дозозависимую гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс.

Для выявления защитных эффектов различных веществ необходимо, чтобы глутаматиндуцированная гибель не превышала 70%. Следовательно, для экспериментов по определению нейропротекторных свойств была использована концентрация глутамата 25 мкМ. Как 0,1, так и 0,05 мг/мл фармкомпозиции оказывают защитный эффект, повышая выживаемость зернистых нейронов мозжечка с 54,97+6,5% до 72,76+9,7% соответственно. Однако он был более выражен при более низкой концентрации.

В данном случае для 0,05 мг/мл фармкомпозиции КЭЗ=(45,03-27,24)/45,03×100%=39,51%; для дозы 0,1 мг/мл КЭЗ=(45,03-37,85)/45,03×100%=15,94%.

Глициновый буфер и бычий сывороточный альбумин, добавленные в по-стглутаматном периоде, не изменяли токсичности глутамата. Всего в первой серии экспериментов было просчитано около 2 тысяч клеток из 60 сестринских культур.

2 серия. Вторая серия выполнена по тем же методикам и схеме эксперимента, что и 1 серия, лишь фармкомпозиция была взята в 2 концентрациях: 0,05 и 0,01 мг/мл, и в качестве препарата сравнения был использован церебролизин в таких же концентрациях. Из полученных данных обсчета контролей видно, что 3-4-х-часовое пребывание в сбалансированном солевом растворе с добавлением глицинового буфера, фармкомпозиции и церебролизина в концентрациях 0,05 и 0,01 мг/мл не приводило к изменению количества живых нейронов по сравнению с контролем.

Глутамат в концентрации 25, 37, 50 мкМ (15 мин) вызывал дозозависимую гибель культивированных клеток-зерен мозжечка крыс. Для выявления защитных эффектов различных веществ необходимо, чтобы глутаматиндуцированная гибель нейронов не превышала 70% от контроля. Следовательно, для экспериментов по определению нейропротекторных свойств была использована концентрация глутамата 25 мкМ. Наблюдаемое одинаковое дозозависимое снижение количества выживших нейронов в зависимости от концентрации глутамата при 35 и 50 мкМ свидетельствовало о насыщении рецепторов. Фармкомпозиция оказывала достоверный защитный эффект, повышая выживаемость зернистых нейронов мозжечка. Этот эффект носит дозозависимый характер, с максимальной защитой при максимальной концентрации биологически активного белково-полипептидного комплекса в фармкомпозиции (0,05 мг/мл). В данном случае КЭЗ=(45-20)/45×100%=55,6%.

Для 0,01 мг/мл КЭЗ=(45-36)/45×100%=20%

Церебролизин в исследованных дозах не оказывал достоверного защитного эффекта (КЭЗ=(45-38)/45×100%=15,6%, для дозы 0,05 мг/мл и КЭЗ=(45-42)/45×100%=6,7%, для 0,01 мг/мл).

Глициновый буфер, добавленный в постглутаматном периоде, даже несколько (не достоверно) усилил токсичность глутамата.

Суммарно защитный эффект фармкомпозици по сериям экспериментов

Из приведенных выше результатов отдельных экспериментов видно, что защитный эффект фармкомпозици после токсического воздействия глутамата носит стабильный характер, воспроизводясь из опыта в опыт. Сам препарат не оказывал токсического влияния ни в одном опыте. Процент гибели нейронов и коэффициенты защиты: спустя 3 ч после воздействия 25 мкМ глутамата погибает 41,49+4% нейронов, если же после глутаматного воздействия в сбалансированном солевом растворе присутствовала фармкомпозиция в концентрации 0,5 и 0,1 мг/мл, то процент гибели культивированных нейронов мозжечка снижался до 30,88+4,3, и 21,98+4,37 соответственно. Причем это уменьшение токсичности глутамата при введении фармкомпозици в концентрации 0,05 и 0,01 мг/мл после повреждения было достоверно (n=45, Р<0,05, Anova tow-way тест с посттестом Benferroni), а в концентрации 0,1 мг/мл носил характер выраженной тенденции.

Коэффициенты эффективности защиты (КЭЗ) при действии фармкомпозици в различных концентрациях были:

КЭЗ (0,1 мг/мл)=(41,49-30,88)/41,49×100%-25,57%;

КЭЗ (0,05 мг/мл)=(41,49-21,23)/41,49×100%=48,83%;

КЭЗ (0,01 мг/мл)=(41,49-21,98)/41,49×100%=47,02%.

Следует отметить, что результаты опытов, где токсичность глутамата превышала 80% или не достигала 30%, в расчет не брались.

Церебролизин в исследованных дозах не оказывал достоверного защитного эффекта (КЭЗ=(45-38)/45×100%=15,6%, для дозы 0,05 мг/мл и КЭЗ=(45-42)/45×100%=6,7%, для 0,01 мг/мл).

Глициновый буфер, добавленный в постглутаматном периоде, даже несколько (не достоверно) усилил токсичность глутамата.

Пример 10. Исследование механизмов фармакологического действия фармкомпозиции. Проводилось исследование специфической активности фармкомпозиции на динамику концентраций возбуждающих и тормозных нейротрансмиттеров in vitro в межклеточной жидкости 7-дневных культур зернистых нейронов мозжечка при цитотоксическом воздействии глутамата. Известно, что препараты, влияющие на высвобождение глутамата (любелизил, BW619C89), являются эффективными нейропротекторами.

Методика. Производился забор 50 мкл среды культивирования клеток-зерен мозжечка до и после токсической обработки глутаматом и внесения фармкомпозиции, глициново-фосфатного буфера или физиологического раствора. Полученные образцы сред замораживались при t - 20°C, кодировались и направлялись в лабораторию для последующего измерения концентрации нейротрансмиттеров методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД). Использовали электрохимический детектор LC-4B (BAS, США) при ^ потенциале +850 мВ на стеклоуглеродном электроде против электрода сравнения Ag/AgCl. Подвижной фазой служил 0.05 М натрийфосфатный буфер с 0.025 мМ ЭД-ТА и 5% ацетонитрила. К 25 мкл перфузата добавляли 25 мкл 0.01 мг/мл внутреннего стандарта L-гомосерина в 0.2 н. NaOH и 10 мкл #-фтальальдегидсульфитного реактива в 0.1 М боратном буфере (рН 9.5) для дериватизации аминокислот. В качестве стандарта использовали раствор, содержащий смесь аминокислот в концентрации 0,01 ммоль/л в 0,1 н. HClO₄ глутамат в концентрации 0.2 мг/мл в 0.1 н. HClO₄. После 15 мин инкубации при температуре 37°С 25 мкл смеси наносили на колонку Agilent Hypersil ODS 5 мкм, 4.6×250 (объем петли 5 мкл) хроматографа Agilent 1100 (США). Концентрацию аминокислот вычисляли при помощи программного обеспечения "Chemstation Agilent" (США); конечный результат выражали в нМ/мг ткани за 2 мин.

Статистический анализ полученных результатов проводили с помощью компьютерной программы Biostat с использованием непараметрических критериев (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Подвижную фазу в составе: КН₂РO₄ безводный («Fluka») - 0,069 М, лимонной кислоты моногидрата («Fluka») - 0,27 М, натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты («Sigma») - 0,27 mM и октилсульфонат натрия (ионпарный реагент) («Диафарм») - 1,9 mM готовили следующим образом - навеску разбавляли в 920 мл деионизированной воды, доводили рН до 3,15 (рН-метр рН-340, «ЗИП»), затем добавляли 80 мл, то есть 1,528 М ацетонитрила («Merck»). Раствор фильтровали под вакуумом (микрофильтр 0,2 мкм) при Р=20-40 мм Hg столба. Перед началом биохимических экспериментов подвижную фазу дегазировали под вакуумом с одновременной обработкой на ультразвуковой бане («Серьга», Россия) в течение 40-50 секунд.

Результаты: фармкомпозиция в концентрациях 0,05 мг и 0,1 мг достоверно и дозозависимо повышала экстрацеллюлярное высвобождение глутамата, глицина, гамма-аминомаслянной кислоты и таурина и аспартата (см. табл.2).

Таблица 2 Серии опытов Исследуемые нейротрансмиттеры (mkmoll/1) Asp Glu Gly GABA Tau Контроль 0,0008 0,00014 0,011 0,00023 0,038 + + + + +0,0091 0,00015 0,00067 0,0048 0,00013   фармкомпозиция 0,05 мг 0,0011 0,0003 0,56 0,00047 0,0635 + + +0,224 + +0,029 0,00052 0,000083   0,0003   фармкомпозиция 0,1 мг 0,0011 0,00034 0,702 0,0004 0,075 +0,0005 + +0,39 + +0,034   0,00012   0,00022   Контроль с глутаматной токсичностью 25 мкМ 0,0009 0,00021 0,0516 0,00021 0,0457 +0,0004 + + + +   0,00013 0,0417 0,00012 0,02023 фармкомпозиция 0,05 мг с глутаматной токсичностью 25 мкМ 0,00075 0,00027 0,43341 0,00037 0,0651 + + + + + 0,000067 0,00006 0,22624 0,00016 0,01613 фармкомпозиция 0,1 мг с глутаматной токсичностью 25 мкМ 0,0007
0,00026
0,7398 +
+
+ 0,00002
0,000153
0,24536 0,00056 0,07977 + + 0,00033 0,017958

При концентрации фармкомпозиции 0,05 мг уровень высвобождения нейротрансмиттеров был выше на 20% (р<0.05), при концентрации 0,1 мг повышение было также достоверным и составляло 28%. После глутаматной токсичности 25 мкМ, при применении фармкомпозиции в концентрациях 0,05 мг и 0,1 мг, отмечалось дозозависимое повышение уровня ГАМК как тормозного нейротрансмиттера и составило 90% и 160% соответственно, по отношению к контрольному (р<0.01); концентрации таурина и глицина при глутаматной токсичности дозозависимо повышались до того же уровня, что и без таковой; уровни возбуждающей нейромедиации - аспартата и глутамата при глутаматной токсичности при применении фармкомпозиции снижались к контрольному уровню в случае аспартата (р<0.05) и оставались неизменными в случае глутамата, достоверно не отличаясь от контроля его воздействия без глутаматной токсичности.

Таким образом, физиологическое действие фармкомпозиции проявлялось повышением экстрацеллюлярной концентрации глицина, глутамата, таурина и ГАМК. Выраженность этого эффекта зависела от концентрации фармкомпозиции, он был достоверно выше при концентрации 0,1 мг, чем 0,05 мг.

Действие фармкомпозиции на фоне модели глутаматной токсичности по сравнению с физиологическим действием без таковой проявлялось в:

- снижении экстрацеллюлярного уровня аспартата;

- значительном, дозозависимым повышением уровня ГАМК;

- стабилизации концентраций глицина и таурина;

- тенденции к снижению уровня глутамата.

Фармакологический эффект фармкомпозиции (повышение выживаемости зернистых нейронов в культуре клеток мозжечка при цитотоксическом воздействии глутамата) связан с регуляторным воздействием препарата на уровни возбуждающей и тормозной медиации, что обеспечивает необходимую защиту нейронов от повреждения. Наиболее интересным эффектом влияния фармкомпозиции на изменение экстрацеллюлярного пула аминокислот, помимо повышения концентрации ГАМК, является увеличение уровня таурина. Эта аминокислота, являясь донатором SH-групп, усиливает действие глутатионпероксидазной системы и тем самым повышает антиоксидантную защиту клеточных мембран нейронов. Использованная модель глутаматной токсичности позволяет оценить влияние фармкомпозиции на динамику не только экстрацеллюлярного уровня нейротрансмиттеров, включающий метаболический пул аминокислот, но и синаптического пула (косвенно). Иными словами, нейропротективный эффект фармкомпозиции объясняется стабилизацией уровня глутамата с тенденцией к снижению не только за счет активации тормозного звена нейротрансмиссии, но и за счет уменьшения спиловера возбуждающих нейромедиаторов.

Источники информации

1. Энциклопедия лекарств. 2006, с.970 г.

2. Патент РФ №2128511 (1999).

3. Патент РФ №2104702 (1999).

4. Патент РФ №2049472 (1999).

5. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У.Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО Издательство «Медицина». - 2005, с.131-170.

6. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО Издательство «Медицина». - 2005, с.100-122.

7. Методические указания по оценке канцерогенности свойств фармакологических средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У.Хабриева.- 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО Издательство «Медицина». - 2005, с.131-170.

8. И.В.Силкина, Т.С.Ганьшина, С.Б.Серединин, Р.С.Мирзоян. Усиление кровоснабжения ишемизированного мозга под влиянием афобазола. Ж. Эксперимен. и клин. фармакологии, 2004, т.67, №5, с.9-13.

9. Smith M.L., Bendek G., Dahlgen N. at all, Models for studing, long-term recovery following forebrain ischemia in the rat. A 2-vessell occlusion model. // Neurol. Scan., 1984, v.69, p.385-400.

10. Ф Y.Wang-Fisher. Manual of Stroke Models in rats. CRC press, 2008, p.3-4.

11. Программа по уходу и содержанию лабораторных животных НПП «Питомник лабораторных животных». ФИБХ РАН от ноября 2005 г.

Изобретение относится к области фармацевтики. Композиция содержит в качестве активного ингредиента биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, получаемый из быстроразмороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой до середины последней трети беременности. Мозг гомогенизируют в буферном растворе, содержащем ЭДТА (этилендиаминотетрауксусную кислоту), отделяют гомогенат от балластных веществ фильтрованием, центрифугированием. Затем отделяют белки и пептидов хроматографией на колонке хроматографической с анионообменным носителем, уравновешенной буферным раствором, со ступенчатым градиентом буферного раствора, ультрафильтрацией, обессоливанием и стерилизующей фильтрацией. Полученный белково-полипептидный комплекс включает отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа. При этом не менее 80% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа. Белково-полипептидный комплекс характеризуется наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений р1 от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле. Композиция включает фармацевтически приемлемый разбавитель. Композиция обладает выраженным репаративно-регенеративным действием на нервную ткань. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 10 пр.

1. Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза, выполненная в виде раствора для парентерального, интраназального и субконъюктивального введения, содержащая в качестве активного ингредиента биологически активный белково-полипептидный комплекс в концентрации 0,01-2,0 мг/мл, обладающий тканеспецифическим репаративным действием на нервную ткань, получаемый из быстроразмороженного эмбрионального мозга сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой до середины последней трети беременности гомогенизацией его в буферном растворе, содержащем ЭДТА (этилендиаминотетрауксусную кислоту), отделением гомогената от балластных веществ фильтрованием, центрифугированием, отделением белков и пептидов хроматографией на колонке хроматографической с анионообменным носителем, уравновешенной буферным раствором, со ступенчатым градиентом буферного раствора, ультрафильтрацией, обессоливанием и стерилизующей фильтрацией и включающий отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 80% от общей массы белка имеют молекулярную массу в диапазоне от 10 до 120 кДа, характеризующийся наличием пика при длине волны 274-284 нм в УФ-видимой области спектра и наличием полос в интервале значений р1 от 4,2 до 8,4 при изоэлектрофокусировке в 5%-ном полиакриламидном геле и фармацевтически приемлемый разбавитель.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, которая в качестве разбавителя содержит фармакопейный буферный раствор и вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.