СРЕДСТВО ДЛЯ РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЫ Российский патент 2010 года по МПК A61K38/19 A61K47/48 A61P1/16 A61P7/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и клеточным технологиям, и может быть использовано в регенеративной медицине.

Существуют препараты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), обладающие гемостимулирующим, мобилизующим стволовые клетки [1, 2], гепатопротекторным [3] и церебропротекторным [4] эффектами.

Известен препарат пегилированного (иммобилизированного/конъюгированного химическим путем с полиэтиленгликолем) Г-КСФ - пегфилграстим [5]. Данное средство является наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату и выбрано в качестве прототипа.

Недостатком препаратов Г-КСФ, в том числе пегфилграстма, является их иммуногенность, определяемая белковой природой соединения и единственно возможным - парентеральным путем введения данного средства [2, 5]. В частности, их применение может сопровождаться выраженными системными и местными аллергическими реакции различной интенсивности (вплоть до анафилактического шока) [6, 7]. Кроме того, терапия дегенеративных заболеваний с помощью имеющихся препаратов Г-КСФ является недостаточно эффективной.

Задачей, решаемой данным изобретением, является создание средства для регенеративной медицины, не имеющего иммуногенности, высокоэффективного как при парентеральном, так и при пероральном введении.

Поставленная задача достигается иммобилизацией гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на носителях с помощью ионизирующего излучения. В качестве носителя используются биологически индифферентные вещества - водорастворимые полимеры с молекулярной массой 400-4000 Да.

Наиболее предпочтительным способом иммобилизации является воздействие на полимерный носитель и биологически активное соединение направленным потоком ускоренных электронов с энергией 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 до 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час.

В качестве водорастворимого полимера используют полиэтиленгликоль, гидроксиэтилкрахмал, поливинилпирролидон и др.

Новым в предлагаемом изобретении является создание средства для регенеративной медицины, представляющего собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, иммобилизированный на полимерном носителе с молекулярной массой 400-4000 Да с помощью ионизирующего излучения, обладающего геммо-стимулирующим, мобилизующим стволовые клетки, гепатопротекторным и церебропротекторным эффектами. Техническим результатом предлагаемого изобретения является отсутствие иммуногенности, и высокая эффективность средства как при парентеральном, так и при пероральном введении.

Используемое нами оригинальное средство гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, иммобилизированного с помощью ионизирующего излучения на низкомолекулярном носителе, было разработано и получено совместно ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск) и НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск).

Известно, что снижение степени иммуногенности веществ может быть достигнуто путем их перорального приема. Однако средства белкового происхождения, каким является и Г-КСФ, в желудочно-кишечном тракте подвергаются расщеплению под влиянием протеолитических ферментов, что делает данный путь их введения в организм неэффективным. В связи с этим важное значение приобретает проблема создания средства для регенеративной медицины, обладающего широким спектром терапевтического действия, низким риском развития побочных эффектов и осложнений, в том числе за счет его использования перорально.

Существуют данные о повышении физической стабильности, растворимости, а также снижении иммуногенности и чувствительности к протеолитическим ферментам белков при их покрытии биологически индифферентными полимерами, конъюгации с определенными носителями (в том числе иммобилизации с помощью радиационных воздействий) [8, 9]. Тем не менее, сведений о возможности создания соединений белка, в том числе Г-КСФ, лишенных аллергизирующих (иммуногенных) свойств, а также способа создания препаратов на их основе, обладающих высокой специфической активностью, характерной для нативных белковых веществ, и одинаково эффективных при использовании парентерально и внутрь, на сегодняшний день не существуете. При этом известно, что процесс манипуляции разнородными субстанциями на молекулярном уровне, в том числе с использованием физических факторов, обладающих высокой энергией, может сопровождаться существенными изменениями стереохимической структуры исходных веществ, и в конечном итоге приводить к модификации их свойств, характер которой, однако, является непредсказуемым [10, 11]. Вместе с тем в настоящее время не существует данных о фармакологических преимуществах препаратов, полученных в результате иммобилизации биологически активных веществ с помощью ионизирующего излучения, перед соединениями, образующимися при конъюгировании тех же исходных субстанций, но химическим путем. То есть не известно существование качественных различий конечного продукта, связанных со способом его получения: технологии химического синтеза (с помощью которой получают пегфилграстим [2, 5]) и электроно-лучевой технологией иммобилизации (с помощью которой осуществляется получение предлагаемого средства). Кроме того, в мировой литературе, в принципе, нет сведений о возможности повышения биологической (фармакологической) активности белковых регуляторных молекул путем иммобилизации действующего вещества на носителях, не связанной с изменением исключительно их фармакокинетики (именно за счет изменения фармакокинетических параметров объясняется модификация свойств Г-КСФ при синтезе пегфилграстима).

Факт иммобилизации гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на носителе с помощью ионизирующего излучения с достижением нового технического результата: создание средства, обладающего гемостимулирующим, мобилизующим стволовые клетки, гепатопротекторным и церебропротекторным действием, с низкой иммуногенностью, высокоэффективным при парентеральном и пероральном (энтеральном) приеме, для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на 259 беспородных крысах обоего пола, массой 200-250 г, мышах-самцах линии CBA/CaLac в количестве 367 штук, массой 18-20 г, 54 морских свинках обоего пола массой 200-250 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

В 10% водный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400 Да вносили Г-КСФ (ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент», г.Новосибирск) до конечной концентрации 10 мг Г-КСФ в 1 мл 10% полиэтиленгликоля. Смесь перемешивали и облучали потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад. Обработку проводили тормозным излучением, генерируемым ускорителем ИЛУ-6 с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час. Получали конечный иммобилизиованный препарат в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 98,2%.

Пример 2

5% водный раствор гидроксиэтил-крахмала с молекулярной массой 1,5 кДа облучали потоком ускоренных электронов в дозе 1,5 Мрад. Обработку проводили тормозным излучением, генерируемым ускорителем ИЛУ-10 с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час. В облученный раствор вносили Г-КСФ (ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент», г. Новосибирск) до конечной концентрации 10 мг Г-КСФ в 1 мл 5% гидроксиэтил-крахмале.

Смесь перемешивали 10 минут и получали конечный иммобилизиованный препарат в виде слегка опалесцирующего раствора. Выход готового продукта составляет 99,1%.

Пример 3

В 10,0% водный раствор поливинилпирролидона с молекулярной массой 4 кДа вносили Г-КСФ (ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент», г.Новосибирск) до конечной концентрации 1 мг Г-КСФ в 1 мл. Затем смесь перемешивали 30 минут и облучали гамма-излучением в дозе 1,0 Мрад. Обработку проводили тормозным излучением, генерируемым ускорителем ИЛУ-10 с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза 5 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час.

Препарат иммобилизованного Г-КСФ получали в виде прозрачного раствора. Выход готового продукта составляет 98%.

Пример 4

Проводили сравнительное изучение аллергизирующих (иммуногенных) свойств препаратов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, иммобилизированного на полиэтиленгликоле с помощью ионизирующей радиации (имГ-КСФ) (получен по примеру 1), и пегфилграстима («NEULASTIM», Щвейцария, Hoffmann-La Roche).

Препараты исследовались в одинаковых дозах (определяемых по содержанию Г-КСФ), которая была определена как оптимальная в отношении нормализации показателей крови у мышей с цитостатической миелосупрессией, и в 10 раз ее превышающей (содержание Г-КСФ 100 и 1000 мкг/кг соответственно). Оценка аллергизирующих свойств препарата проводилась с использованием следующих тестов: реакции общей анафилаксии, реакции специфической агломерации лейкоцитов, при внутрикожном и конъюнктивальном тестировании на морских свинках, реакции гиперчувствительности замедленного типа на мышах [12]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Для сенсибилизации морских свинок препараты вводили: сначала 1 раз подкожно, затем в той же дозе 2 раза внутримышечно, через день, в область бедра. Анафилактогенные свойства препаратов Г-КСФ выявляли путем его внутрисердечного введения на 21-е сутки после последней сенсибилизирующей инъекции. Разрешающее тестирующее внутрисердечное введение препарата проводилось в дозе, равной суммарной сенсибилизирующей, т.е. 300 мкг/кг. Контролем служили несенсибилизированные морские свинки, которым препарат вводили внутрисердечно.

Учет интенсивности анафилактической реакции проводили с использованием формулы

,

где АИ - анафилактический индекс;

n - число животных, анафилактическая реакция которых заканчивалась смертельным исходом;

n₁ - число животных со значительными проявлениями анафилактической реакции;

n₂ - число животных со средними проявлениями реакции;

n₃ - число животных со слабыми проявлениями реакции;

N - общее число животных в группе.

Для оценки кожно-сенсибилизирующих свойств препарата через 20 дней после окончания сенсибилизирующих инъекций на боковой поверхности тела морских свинок выстригали шерсть, и каждому животному внутрикожно вводили препарат имГ-КСФ, либо пегфилграстим в дозах 10 мкг/животное (50 мкг/кг) в 0,02 мл физиологического раствора (доза, не вызывающая визуальных изменений кожи у интактных морских свинок).

Реакцию кожи на введение препарата оценивали в баллах с учетом выраженности гиперемии и размеров гиперемированной области (средняя величина диаметра в миллиметрах). Были определены четыре степени гиперемии, которым соответствовали числовые индексы: сильная (+++) - 1,0; средняя (++) - 0,66; слабая (+) - 0,33; сомнительная (+/-) - 0,17. Умножение величины диаметра гиперемированной области на индекс соответствующей степени гиперемии позволило в едином показателе (баллы) выразить обе характеристики реакции.

На 20-й день после завершения цикла сенсибилизирующих инъекций проводилось конъюнктивальное тестирование. Тест заключался в закапывании в левый глаз каждого животного 0,02 мл физиологического раствора, содержащего 10 мкг препарата, в правый глаз - физиологического раствора в том же объеме. Оценка состояния конъюнктивы глаза проводилась через 4 и 24 часа после воздействия.

С целью подтверждения результатов, полученных вышеперечисленными тестами, использовалась реакция аллергодиагностики in vitro РСАЛ (реакция специфической агломерации лейкоцитов). Рабочая доза препаратов Г-КСФ для этой реакции составляла 2,5 мкг на 0,05 мл крови животного (50 мкг/мл).

На мышах сенсибилизацию проводили с использованием полного адьюванта Фрейнда (ПАФ). Препараты Г-КСФ вводили однократно подкожно в основание хвоста в 0,06 мл ПАФ, который был взят в соотношении 1:1 к объему раствора препарата. Доза препарата составляла 1000 мкг/кг. Контрольным животным вводили ПАФ в том же объеме.

Через 5 суток после инъекции опытным и контрольным мышам в подушечку одной из задних лап вводили препараты Г-КСФ в дозе 20 мкг/животное в 0,04 мл физиологического раствора (1000 мкг/кг), в другую лапу - физиологический раствор. Через 24 часа после второй инъекции с помощью инженерного микрометра типа МК измеряли толщину обеих лап. Величину реакции определяли как разницу в толщине опытной и контрольной лап, в миллиметрах.

В ходе эксперимента было установлено, что реакция морских свинок на внутрикожное введение препарата имГ-КСФ по таким визуальным показателям, как покраснение или отек, не отличалась от соответствующих показателей у животных, которым вводили дистиллированную воду, в то время как при введении пегфилграстима кожная реакция была достоверно более выражена. Конъюнкти-вальный тест и реакция аллергодиагностики in vitro не выявили признаков аллер-гизирующего действия ни у одного из препаратов Г-КСФ. В то же время при тестирующем внутрисердечном введении препаратов имГ-КСФ и пегфилграстима имело место статистически значимое увеличение анафилактического индекса в группе животных, получавших пегфилграстим, в то время как при введении имГ-КСФ АИ не отличался от такового в контрольной группе (табл.1).

Кроме того, изучение аллергизирующих (иммуногенных) свойств показало, что внутрикожные тестирующие инъекции имГ-КСФ и пегфилграстима не приводили к изменению величины реакции ГЗТ по сравнению с контрольным уровнем показателя через 4 и 24 часа после воздействия (табл.2).

Аналогичные результаты были получены при изучении имГ-КСФ, полученного при иммобилизации Г-КСФ на гидроксиэтил-крахмале и декстране.

Таблица 1 Оценка анафилактогенных свойств имГ-КСФ и пегфилграстима в эксперименте на морских свинках Группа животных Показатели Реакция кожи, баллы Конъюнктив, тест, баллы Коэффициент РСАЛ АИ Контроль 0,78±0,02 0 1,5±0,2 0,26 Пегфилграстим 0,89±0,03∗ 0 1,5±0,2 0,31 имГ-КСФ 0,79±0,05 0 1,5±0,2 0,87 * - отмечена достоверность различия показателя от его значения в контроле при p<0,05

Таблица 2 Оценка сенсибилизирующих свойств препарата имГ-КСФ в эксперименте на мышах, (Х±m) Условия эксперимента Реакция ГЗТ, мм Группа животных Сенсибилизирующая доза, мкг/кг Разрешающая доза, мкг/кг 4 часа 24 часа Контроль - 1000 0,073±0,03 0,08±0,01 Пегфилграстим 1000 1000 0,087±0,02 0,09±0,01 имГ-КСФ 1000 1000 0,090±0,030 0,79±0,01

Таким образом, препарат иммобилизированного с помощью ионизирующего излучения Г-КСФ не оказывает иммуногенного эффекта, проявляющегося аллергизацией организма, в то время как пегфилграстим обладает слабо выраженными аллергизирующими свойствами

Пример 5

Проведено экспериментальное изучение иммунотоксических свойств Г-КСФ, иммобилизированного на полиэтиленгликоле с помощью ионизирующего излучения (получен по примеру 2) [12]. В качестве препарата сравнения использовался пегфилграстим («NEULASTIM», Швейцария, Hoffmann-La Roche).

Препараты исследовались на мышах при подкожном введении в дозе 100 мкг/кг, которая была определена как терапевтическая (1 ТД) и в дозе на порядок ее выше - 1000 мкг/кг (10 ТД). Экспериментальная оценка иммунотоксических свойств препаратов Г-КСФ проводилась с использованием следующих тестов: предварительная оценка иммунотоксичности при однократном введении; изучение влияния препарата на массу и клеточность центральных и периферических органов иммунитета; оценка влияния препарата на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов; изучение влияния препарата на число антителообразующих клеток (АОК) после иммунизации эритроцитами барана (ЭБ); исследование влияния препарата на спонтанную и индуцированную митогенами пролиферацию спленоцитов.

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Курсовое введение имГ-КСФ в используемых дозах не оказывало влияния на массу и клеточность центральных и периферических органов иммунитета экспериментальных мышей, на уровень антителообразующих клеток после иммунизации животных эритроцитами барана, на пролиферативный ответ лимфоцитов. В то время как пегфилграстим приводил к снижению спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов (на 5,8% от фона) при его добавлении в культуру в дозе 5 нг/мл.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что иммобилизированный с помощью ионизирующего излучения Г-КСФ не обладает иммунотоксическими свойствами.

Пример 6

Были проведены эксперименты по изучению гемопоэзстимулирующей активности имГ-КСФ (полученного по примеру 1). В качестве сравнения служил препарат пегфилграстима («NEULASTIM», Щвейцария, Hoffmann-La Roche).

Исследования гемостимулирующих свойств проводили на мышах линии СВА на модели миелосупрессии. Для этого всем животным вводили циклофосфан (ЦФ) в дозе 170 мг/кг. Затем мыши 1-й группы получали подкожно пегфилграстим, мыши 2-й группы - пегфилграстим перорально, животным 3-й группы подкожно вводили имГ-КСФ, а 4-й - имГ-КСФ перорально. Все препараты вводили в дозе 100 мкг/кг 2 раза: на 1 день после введения цитостатика и через 5 дней. Контрольным животным вводили физиологический раствор в соответствующих режимах. На 7, 10 дни опыта с помощью стандартных и культуральных гематологических методов определяли показатели периферической крови и костного мозга, а также число КОЕ-ГМ в костном мозге [13]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Проведенные эксперименты позволили установить, что пероральное введение пегфилграстима не приводило к изменениям исследуемых показателей, свидетельствующее о неэффективности использования per os препарата Г-КСФ, иммобилизированного на носителе химическим способом. В остальных случаях в периферической крови возрастало содержание палочко- и сегментоядерных нейтрофилов, а также количество КОЕ-ГМ, незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани. При этом наиболее выраженными были изменения в группе животных, получавших имГ-КСФ подкожно (табл.3). В то же время достаточно существенным оказался подъем данных показателей и у животных, получавших иммобилизованный Г-КСФ перорально.

Таблица 3 Показатели грануломоноцитарного ростка кроветворения при введении циклофосфана (1), подкожном (2) и пероральном введении пегфилграстима (3), подкожном (4) и пероральном (5) введении имГ-КСФ на фоне моделирования миелосупрессии, (X±m) Сроки / сутки Палочкоядерные нейтрофилы в периферической крови, Г/л Сегментоядерные нейтрофилы в периферической крови, Г/л Незрелые нейтрофильные гранулоциты в костном мозге, ×10⁶/бедро Зрелые нейтрофильные гранулоциты в костном мозге, ×10⁶/бедро КОЕ-ГМ в костном мозге, на 10⁶ миелокариоцитов фон 0,3±0,02 2,44±0,23 1,12±0,04 3,64±0,21 5,11±0,21 5-е 1 0,0∗ 0,9±0,09∗ 0,56±0,03∗ 1,02±0,08∗ 12,68±0,8∗ 2 0,03±0,01∗ 1,3±0,01∗ 0,99±0,03 1,69±0,02∗ 17,9±0,9∗ # # # # # 3 0,0∗ 0,94±0,04∗ 0,58±0,02∗ 1,07±0,1∗ 11,8±1,0∗ 4 0,06±0,01∗ 1,98±0,02∗ 1,34±0,01∗ 1,72±0,07∗ 29,7±1,2∗ #& #& #& # #& 5 0,07±0,01∗ 1,56±0,03∗ 1,06±0,02 1,56±0,03∗ 26,4±1,01∗ #& # # # #& 10-е 1 0,43±0,09 3,01±0,9 0,98±0,02 3,4±0,67 4,01+1,4 2 0,9±0,01∗ 3,76±0,07∗ 2,35±0,07∗ 5,9±0,1∗ 14,1±1,3∗ # # # # # 3 0,37±0,1 2,96±0,7 1,1±0,03 3,57±0,44 5,2±0,7 4 1,5±0,06∗ 4,59±0,1∗ 3,14±0,1∗ 6,98±0,1∗ 18,6±2,1∗ #& #& #& #& # 5 1,3±0,04∗ 3,3±0,1∗ 2,97±0,1∗ 6,57±0,5∗ 16,3±1,07∗ #& # # # # * - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05. # - отмечена достоверность различия показателя от его контрольного значения при р≤0,05. & - отмечена достоверность различия показателя у мышей, получавших имГ-КСФ от его контрольного значения у животных, получавших пегфилграстим подкожно при p≤0,05.

Пример 7

Изучение мобилизующих стволовые клетки свойств имГ-КСФ были проведены на интактных мышах линии СВА. Для исследований использовали препарат имГ-КСФ, полученный по примеру 2. В качестве препарата сравнения служил пегфилграстим («NEULASTIM», Щвейцария, Hoffmann-La Roche). Режим введения препаратов был отобран в предварительных экспериментах как наиболее эффективный. Мыши 1-й группы получали подкожно пегфилграстим, мыши 2-й группы - пегфилграстим перорально, животным 3-й группы подкожно вводили имГ-КСФ, а 4-й - имГ-КСФ перорально. Все препараты вводили в дозе 100 мкг/кг 1 раз в день в течение 5-и дней. На 5, 7-е сут определяли количество мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и грануломоноцито-эритро-мегакариоцитарных (КОЕ-ГЭММ) клеток-предшественников в периферической крови [1, 13, 14].

В ходе эксперимента было установлено, что парентеральное применение (но не пероральное) пегфилграстима, а также парентеральное и пероральное введение имГ-КСФ приводили к значительному увеличению содержания стволовых клеток в периферической крови. Причем максимальных значений увеличение показателей отмечалось при парентеральном введении имГ-КСФ, а изменение числа МСК и КОЕ-ГЭММ при пероральном использовании им Г-КСФ было на уровне такового при подкожном введении пегфилграстима (табл.4).

Таблица 4 Содержание стволовых клеток в периферической крови мышей при подкожном (1) и пероральном введении пегфилграстима (2), подкожном (3) и пероральном (4) введении имГ-КСФ, (X±m) Сроки / сутки КОЕ-ГЭММ, на 10⁵ мононуклеаров МСК в костном мозге, на 10⁶ мононуклеаров фон 4,7±0,2 19,0±2,0 5-е 1 9,8±1,1∗ 29,0±3,1∗ 2 4,3±0,39 18,4±2,2   17,4±2,0∗ 39,0±3,4∗   & & 4 10,3±0,92∗ 36,0±3,7∗     & 7-е 1 14,3±0,9∗ 31,0±2,4∗ 2 5,2±0,75 15,0±3,1 Л 19,7±1,7∗ 39,0±3,3∗   & & 4 13,4±1,0∗ 37,2±2,4∗   &   * - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при р≤0,05. & - отмечена достоверность различия показателя у мышей, получавших имГ-КСФ от его контрольного значения у животных, получавших пегфилграстим подкожно при p≤0,05.

Пример 8

Были исследованы изменения морфофункционального состояния печени под действием иммГ-КСФ и пегфилграстима («NEULASTIM», Щвейцария, Hoffmann-La Roche) при моделировании хронического токсического гепатита.

Эксперименты были проведены на беспородных крысах массой 250-300 г. У крыс гепатит вызывали внутрижелудочным введением 50% раствора ССЦ (гепатотропный яд) на оливковом масле в дозе 2 мл/кг в течение 3-х недель 2 раза в неделю (6 раз).

По окончании моделирования хронического токсического поражения печени животные были поделены на 3 равные группы. Крысам 1-й группы в течение 5 дней подкожно вводили 100 мкг/кг пегфилграстима, растворенного в 0,5 мл растворителя. Первое введение осуществляли на следующий день после последнего введения тетрахлоруглерода. Животным 2-й группы подкожно вводили иммГ-КСФ в дозе 100 мкг/кг в течение 5 дней. Крысам 3-й группы внутрижелудочно вводили иммГ-КСФ в дозе 100 мкг/кг в течение 5 дней. Животным контрольной группы по той же схеме в эквивалентном объеме вводили физиологический раствор. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Для изучения состояния печени оценивали гибель крыс, проводили биохимические исследования содержания в сыворотке крови аспартат- и аланинаминотрансфераз (АсАТ, АлАТ) на 40-е сутки, а также морфологическое исследование печени на 40-е сутки опыта. Активность ферментов сыворотки крови определяли общепринятыми методами, используя полуавтоматический биохимический анализатор фирмы Cormay и стандартные наборы к нему. Кровь для исследования получали из бедренной артерии через катетер. На гистологических препаратах печени, окрашенных гематоксилином и эозином, определяли количество клеток инфильтрата с помощью окулярной сетки Автандилова, содержащей 25 тест-точек. В 20 полях зрения подсчитывали количество клеток, попадающих на тест-точки сетки. Относительную площадь инфильтрации высчитывали как отношение точек сетки, приходящихся на клетки инфильтрата, ко всем точкам сетки в 20 полях зрения. Площадь соединительной ткани определяли с помощью средств компьютерной обработки графических данных. Для этого на стандартной площади среза печени (последовательные микрофотографии 10 полей зрения, выполненные микровидеокамерой “Digital micro”, с программой передачи изображения на компьютер фирмы «Элекард», Томск) измеряли площадь структур, окрашенных пикрофуксином, и вычисляли процентное отношение к выбранной стандартной площади.

Проведенные эксперименты показали, что гибель крыс в группах животных, получавших препараты Г-КСФ, была значительно ниже, чем в контроле (35,6%). При этом при подкожном введении имГ-КСФ гибели крыс не отмечалось. Биохимические исследования сыворотки крови выявили повышение активности АлАТ, и АсАТ и ЩФ на 40-е сутки опыта после начала введения CCl₄ в контрольной группе (табл.5). В то же время пегфилграстим практически не влиял на содержание ферментов в сыворотки крови. Вместе с тем как парентеральное, так и пероральное использование имГ-КСФ сопровождалось существенным падение их активности.

Таблица 5 Влияние препаратов на биохимические показатели крыс-самцов с хроническим CCl₄-гепатитом (1) при подкожном введении пегфилграстима (2), подкожном (3) и пероральном (4) введении имГ-КСФ, на 40 сутки эксперимента, X±m Группы АлАТ АсАТ ЩФ (мккат/л) (мккат/л) (Е/л) фон 0,22±0,01 0,24±0,03 231,0±23,4 1 0,69±0,03∗ 0,70±0,04∗ 415,9±43,6∗ 2 0,48±0,1∗ 0,66±0,03∗ 349,5±36,7∗ # 3 0,24±0,02 0,28±0,02 227,5±34,3 #& #& #& 4 0,21±0,02 0,34±0,06 239,3±41,2 #& #& #& * - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05. # - отмечена достоверность различия показателя от его контрольного значения при p≤0,05. & - отмечена достоверность различия показателя у мышей, получавших имГ-КСФ от его контрольного значения у животных, получавших пегфилграстим подкожно при p≤0,05.

При исследовании гистологических препаратов печени в контрольной группе крыс отмечалось выраженное нарушение долькового строения органа. На препаратах были видны поля грануляционной ткани, замещающей погибшие гепатоциты, в которых происходило новообразование сосудов и печеночных протоков. В сохранившихся гепатоцитах наблюдалась выраженная крупнокапельная жировая дистрофия. В то же время имела место значительная регенерационная гипертрофия печеночных клеток. Введение пегфилграстима, либо иммГ-КСФ при моделировании CCl₄-гепатита сохраняло дольковое строение печени, а жировая дистрофия гепатоцитов была преимущественно мелкокапельная. У опытных животных отмечалась менее выраженная инфильтрация портальных трактов.

В целом относительная площадь инфильтрации была достоверно ниже, чем в контрольной группе. Кроме того, препараты Г-КСФ существенно уменьшали и площадь соединительной ткани (табл.6). При этом наиболее выраженный гепа-топротекторный эффект имел место при подкожном введении заявляемого имГ-КСФ. Вместе с тем значительной терапевтической активностью данный препарат обладал и при пероральном введении, причем таковая была сопоставима с парентеральным примением пегфилграстима.

Таблица 6 Влияние препаратов на биохимические показатели крыс-самцов с хроническим CCl₄-гепатитом при подкожном введении пегфилграстима, подкожном и пероральном введении имГ-КСФ, на 21 и 40 сутки эксперимента, X±m Группы Относительная площадь инфильтрата (%) Относительная площадь соед. ткани (%) фон 2,34±0,2 3,78±0,3 H₂O (контроль) 27,48±4,67∗ 16,5±0,42∗ Пегфилграстим 10,0±1,16∗# 7,44±0,17∗# Им Г-КСФ подкожно 3,7±0,97∗#& 3,56±0,4#& Им Г-КСФ перорально 9,4±0,67∗#& 6,12±0,09∗#& * - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05. # - отмечена достоверность различия показателя от его контрольного значения при p≤0,05. & - отмечена достоверность различия показателя у мышей, получавших имГ-КСФ от его контрольного значения у животных, получавших пегфилграстим подкожно при p≤0,05.

Таким образом, иммобилизированный с помощью ионизирующей радиации Г-КСФ обладает выраженными гепатопротекторными свойствами как при парентеральном, так и при пероральном введении. При этом механизмом его действия, очевидно, являются стимуляция и мобилизация стволовых клеток костного мозга с их дальнейшим детерминированным хомингом в печеночную ткань и диффе-ренцировкой в тканеспецифичные элементы [1, 3].

Пример 9

В эксперименте на мышах проводили исследование церебропротекторных эффектов имГ-КСФ на модели гипоксической энцефалопатии. Оценку состояния центральной нервной системы животных производили по регистрации показателей психоневрологического статуса: условно-рефлекторной деятельности и ориентировочно-исследовательскому поведению животных в открытом поле.

Энцефалопатия моделировалось с помощью термокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в термокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до атонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из термокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в термокамеру также до наступления атонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания). Мыши 1-й группы получали подкожно пегфилграстим («NEULASTIM», Щвейцария, Hoffmann-La Roche), мыши 2-й группы - перорально пегфилграстим («NEULASTIM», Щвейцария, Hoffmann-La Roche), животным 3-й группы подкожно вводили имГ-КСФ, а 4-й - имГ-КСФ перорально. Все препараты вводили в дозе 100 мкг/кг 1 раз в день в течение 5-и дней, начиная сразу после воздействия. Контрольным животным вводили физиологический раствор в соответствующих режимах. Через 1 сутки после моделирования энцефалопатии у животных вырабатывался условный рефлекс пассивного избегания, проверка сохранности рефлекса и ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле осуществлялась на 14, 21-е сут опыта. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

В ходе эксперимента гипоксическое воздействие приводило к формированию энцефалопатии. Так, наблюдалось статистически значимое увеличение общей двигательной активности мышей в открытом поле, числа горизонтальных перемещений и повышение коэффициента асимметрии движений. В то же время отмечалось резкое падение уровня воспроизведения условного рефлекса пассивного избегания и спонтанная смертность животных на протяжении всего периода наблюдения, достигающая на 21-е сут 35,7%.

Терапевтический эффект пегфилграстима проявлялся только при его подкожном введении, в то время как препарат имГ-КСФ оказывал лечебное действие при парентеральном и пероральном назначении. Причем в обоих случаях (введения имГ-КСФ) церебропротекторный эффект был выше, чем у пегфилграстима при его подкожном применении. Более того, подкожное введение имГ-КСФ полностью отменяло появление признаков энцефалопатии (табл.7, 8).

Таблица 7 Условно-рефлекторная деятельность и смертность мышей линии CBA\CaLac при энцефалопатии, вызванной гипоксией гермообъема (1), при подкожном введении пегфилграстима (2), пероральном введении пегфилграстима (3), при подкожном (4) и пероральном (5) введении им Г-КСФ после пребывания животных в термокамере, в усл. ед., (X±m) Сроки исследования, сутки Доля погибших животных, % Уровень воспроизведения рефлекса¹ 14-е ИК 0 0,9+0,07 1 22,73∗ 0,41±0,12∗ 2 12,3∗# 0,7±0,08# 3 23,1∗ 0,4±0,1∗ 4 7,4∗ 0,87±0,04#& 5 14,1∗ 0,69±0,97# 21-е ИК 0 0,8±0,13 1 35,7∗ 0,1±0,1∗ 2 14,1∗ 0,6±0,02# J 34,6∗ 0,12±0,12∗ 4 8,1∗ 0,86±0,05#& 5 14,1∗ 0,65±0,07# ¹ - доля животных с сохраненным рефлексом ИК - соответствующие показатели у интактных животных * - отмечена достоверность различия показателя от его значения у интактных животных при p≤0,05. # - отмечена достоверность различия показателя от его контрольного значения при р≤0,05. & - отмечена достоверность различия показателя у мышей, получавших имГ-КСФ от его контрольного значения у животных, получавших пегфилграстим подкожно при р≤0,05.

Таблица 8 Динамика показателей ориентировочно-исследовательского поведения мышей линии CBA\CaLac в открытом поле при энцефалопатии, вызванной гипоксией гермообъема (1), при подкожном введении пегфилграстима (2), пероральном введении пегфилграстима (3), при подкожном (4) и пероральном (5) введении им Г-КСФ после пребывания животных в термокамере, в усл. ед., (Х±m) Сроки исследования, сутки Коэффициент асимметрии Суммарная двигательная активность Горизонтальная двигательная активность 14-е ИК 0,49±0,06 15,4±2,45 8,0±1,74 1 0,75±0,05∗ 36,86±8,1∗ 26,43±4,97∗ 2 0,58±0,06# 19,2±1,06# 9,4±1,9#   0,76±0,03∗ 34,84±2,72 28,71±2,11 4 0,37±0,04#& 14,7±1,6#& 12,4±1,5# 5 0,41±0,05# 17,3±0,97# 13,2±1,7# 21-е ИК 0,56±0,07 20,7±3,31 12,6±2,21 1 0,75±0,03∗ 32,57±3,34∗ 23,86±4,38∗ 2 0,62±0,04 26,59±2,3 17,2±1,3 3 0,74±0,02∗ 34,3±2,9∗ 22,4±2,7∗ 4 0,54±0,02#& 19,7±1,7#& 11,7±2,4#& 5 0,61±0,12# 21,8±3,87# 15,62±2,19# * - отмечена достоверность различия показателя от его значения у интактных животных при p≤0,05. # - отмечена достоверность различия показателя от его контрольного значения при p≤0,05. & - отмечена достоверность различия показателя у мышей, получавших имГ-КСФ от его контрольного значения у животных, получавших пегфилграстим подкожно при p≤0,05.

Кроме того, с помощью культуральных методов на 7-е сут опыта определялось содержание нейральных предшественников в паравентрикулярной области головного мозга [4]. В ходе исследований было обнаружено значительное увеличение их числа у животных, получавших подкожно пегфилграстим, подкожно и перорально имГ-КСФ. При этом наибольших величин достигало изменение данного параметра именно в группах животных, которым вводили имГ-КСФ (табл.9).

Таблица 9 Содержание нейральных предшественников в паравентрикулярной области головного мозга мышей при энцефалопатии (1), при подкожном (2) и пероральном (3) введении пегфилграстима, при подкожном (4) и пероральном (5) введении им Г-КСФ после пребывания животных в термокамере, (X±m) Сроки исследования, сутки Нейральные клетки-предшественники, на 10⁵ нуклеаров 7-е фон 4,2±0,07 1 4,7±0,1 2 7,8±0,2∗# 3 4,12±0,08 4 12,6±1,1∗#& 5 9,78±1,3∗# * - отмечена достоверность различия показателя от его фонового значения при p≤0,05. # - отмечена достоверность различия показателя от его контрольного значения при p≤0,05. & - отмечена достоверность различия показателя у мышей, получавших имГ-КСФ от его контрольного значения у животных, получавших пегфилграстим подкожно при p≤0,05.

Таким образом, препарат им Г-КСФ обладал выраженным лечебным действием в отношении постгипоксической энцефалопатии, причем его терапевтический эффект значительно превосходил эффект терапии с помощью препарата аналога - пегфилграстима. При этом действие имГ-КСФ было связано со стимуляцией механизмов регенерации «глубокого» резерва, определяемых функциональной активностью эндогенных стволовых клеток организма.

Пример 10

В двух вариантах изучали действие препаратов Г-КСФ на гранулоцитарные прекурсоры (основные клетки-мишени Г-КСФ [13]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

При первом варианте неприлипающие клетки костного мозга (в концентрации 10⁵ миелокариоцитов/мл) помещали в полувязкую 1%-метилцеллюлозную культуральную среду следующего состава: 50% среды RPMI, 20% инактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина. Затем в одном случае добавляли 5 нг/мл пегфилграстима, а в другом 5 нг/мл имГ-КСФ, и инкубировали в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100%) влажности воздуха в течение 7 сут. В контроле добавляли соответствующий объем 10%) р-ра полиэтиленгликоля. После чего производили подсчет гранулоцитарных колоний (КОЕ-Г), отражающих содержание основных клеток-мишеней Г-КСФ[13].

При этом значительно более выраженный рост КОЕ-Г отмечался при добавлении имГ-КСФ (табл.10, А). Вместе с тем при длительном культивировании клеточного материала ответ КОЕ-Г мог быть связан с более выраженной физической устойчивостью иммобилизированного с помощью ионизирующего излучения Г-КСФ в модели биологической среды. Для изучения степени выраженности прямого действия препаратов Г-КСФ на прогениторные клетки, связанного исключительно с уровнем (степенью) активации под их влиянием специфических рецепторов, были проведены эксперименты другого дизайна.

Для этого неприлипающие клетки костного мозга (в концентрации 10⁵ миелокариоцитов/мл) помещали в культуральную среду следующего состава: 90% среды RPMI, 10%» инактивированной эмбриональной телячей сыворотки, 6 г/л глюкозы, 280 мг/л L-глутамина, 50 мг/л гентамицина. Затем в первом случае добавляли 30 нг/мл пегфилграстима, а в другом 30 нг/мл имГ-КСФ, и инкубировали в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100%) влажности воздуха в течение 1 сут. В контроле добавляли соответствующий объем 10% р-ра полиэтиленгликоля.

При этом количество Г-КСФ и время инкубации были отобраны в предварительно проведенных исследованиях, на основании которых было сделано заключение о том, что используемая концентрация Г-КСФ и срок преинкубации клеток с препаратами позволяют оценивать именно уровень активации рецептора к Г-КСФ, т.к. дальнейшее увеличение содержания препаратов цитокина в культуральной среде уже не способно повышать степень ответа кроветворных прекурсоров (происходит полное насыщение - задействован весь рецепторный аппарат клетки), а срок максимальной биологической активности данных веществ в заданных условиях превышает 1 сут.

Затем клетки отмывали центрифугированием, помещали их в полувязкую метилцеллюлозную среду и инкубировали в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 7 сут. После чего подсчитывали количество гранулоцитарных колоний.

В ходе исследования, как и в предыдущем случае, была показана значительно более высокая стимулирующая активность имГ-КСФ в отношении прогениторных клеток (табл.10, Б).

Таким образом, Г-КСФ, иммобилизированный на носителе с помощью ионизирующего излучения, обладает значительно более высокой специфической активность, чем пегфилграстим, в том числе не связанной с физической стойкостью препарата в биологической среде.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что более выраженная эффективность действия имГ-КСФ in vivo связана с повышением степени реализации потенциала рецептор-опосредованной активации функций прогениторных клеток.

В целом, исходя из полученных данных следует, что средство, представляющее собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, иммобилизированный на водорастворимом носителе с помощью ионизирующего излучения, обладает выраженной гемостимулирующей, мобилизующей стволовые клетки, гепатопротекторной и церебропротекторной активностями - регенеративной активностью. При этом эффективность данного средства значительно превышает таковую у Г-КСФ, конъюгированного (иммобилизированного) с носителем химическим путем (пегфилграстим). Более того, технология получения данного средства позволяют эффективно его использовать в гематологии и регенеративной медицине не только парентерально, но и внутрь.

Литература

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др. Фармакологические аспекты регенеративной медицины. // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - Приложение 2. - С.14-21.

2. Tricot G., Barlogie В., Zangari М., van Rhee F. e.a. Mobilization of peripheral blood stem cells in myeloma with either pegfilgrastim or filgrastim following chemotherapy. Haematologica. 2008 Nov; 93(11): 1739-42. Epub 2008 Aug 25.

3. Патент (RU) на изобретение №2295971 «Способ терапии экспериментального хронического токсического гепатита», 2007 г. (опубл. 27.03.2007 г., Бюл. №9). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др.

4. Патент (RU) на изобретение №2284060 «Способ экспериментальной терапии энцефалопатии», 2006 г.(опубл. 20.09.2006 г., Бюл. №26). Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Суслов Н.И.

5. Piedmonte D.M., Treuheit M.J. Formulation of Neulasta (pegfilgrastim). Adv Drug Deliv Rev. - 2008. Jan 3; 60(1):50-8.

6. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - vol.268. - p.2845-2857.

7. De Swarte R.D., Drug allergy. In: Patterson R. e.a. Allergic Diseases Diagnosis and Management, 4th ed. Philadelphia, Pa^ J.B. Lippincott. - 1993 - p.396-551.

8. Veronese F.M., Mero A. The impact of PEGylation on biological therapies. BioDrugs. 2008; 22(5):315-29.

9. Vereschagin E.I., Khan Do-Hung, et al. Radiation Technology in the Preparation of Polyethylene Oxide Hydrophilic Gels and Immobilization of Proteases for Use in Medical Practice. // Arch. Pharm. Res. - 2001. - V.24. - N3. - P.229-233.

10. Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии. // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - №1. - С.61-69.

11. Евдокимов Ю.М. Пространственно упорядоченные формы ДНК и ее комплексов - основа создания наноконструкций для медицины и биохетнологий. // Российские нанотехнологии. - 2006. - №1-2. - С.256-264.

12. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. / Под ред Р.У.Хабриева. - 2 изд. - М.: ОАО «Изд-во Медицина, 2005. - С.54-69.

13. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

14. In't Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. e.a. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogenous multilineage differentiation potential // Haematologica. - 2003. - Vol.88. - P.845-852.

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и клеточным технологиям. Средство, обладающее регенеративной активностью, представляет собой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, иммобилизированный на водорастворимых полимерах с молекулярной массой 400-4000 Да. При этом гранулоцитарный колониестимулирующий фактор иммобилизирован на полимерах с помощью ионизирующего излучения - потока ускоренных электронов с энергией 2,5 МэВ, поглощенной дозой от 2 до 10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/час. Средство заявленного изобретения не имеет иммуногенности, является высокоэффективным как при парентеральном, так и при пероральном введении. 10 табл.

Средство, обладающее регенеративной активностью и представляющее собой иммобилизированный на водорастворимых полимерах с молекулярной массой 400-4000 Да гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, отличающееся тем, что гранулоцитарный колониестимулирующий фактор иммобилизирован на полимерах с помощью ионизирующего излучения - потока ускоренных электронов с энергией 2,5 МэВ, поглощенной дозой от 2 до 10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/ч.