ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ ГЕМОПОЭЗА Российский патент 2011 года по МПК A61K38/43 A61K41/00 A61K47/48 A61P7/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.

Высокая частота встречаемости заболеваний системы крови и гематологических осложнений, в том числе ятрогенного характера, резистентных к современной медикаментозной терапии [1, 2], является основанием для разработки новых гемостимуляторов.

Известно большое количество гемостимулирующих средств [1, 2].

Наиболее близким по природе происхождения к предлагаемому средству является препарат нативной гиалуронидазы, конъюгированной с полиоксидонием путем химического синтеза [3].

Существует иммобилизированная с помощью ионизирующего излучения (нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидаза, введение которой приводит к увеличению содержания прогениторных клеток в организме [4].

Авторами изобретения впервые выявлена выраженная гемостимулирующая активность иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату прототипом является способ стимуляции миелопоэза с помощью препарата нативной гиалуронидазы, который вводят парентерально в дозе 1000 ЕД/кг 1 раз в сутки, в течение 2 дней [5].

Недостатком данного способа является его эффективность только в случае применения препарата гиалуронидазы в указанной высокой/токсичной дозе [5]. При этом использование данного средства даже в терапевтическом режиме зачастую приводит к развитию целого ряда побочных эффектов и осложнений [6, 7], связанных, в первую очередь, с его иммуногенностью.

Данный способ является наиболее близким к заявляемому по механизму действия и техническому результату и выбран в качестве прототипа.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение показаний к применению иммобилизированной гиалуронидазы и повышение безопасности и эффективности способа.

Поставленная задача достигается применением иммобилизированной с помощью технологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы в качестве гемостимулирующего средства. Препарат назначают парентерально либо перорально в дозе 10-1000 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 1-5 дней.

Новым в предлагаемом изобретении является применение иммобилизированной гиалуронидазы в качестве гемостимулирующего средства.

Используемое нами оригинальное средство иммобилизированной с помощью ионизирующего излучения гиалуронидазы [4] было разработано и получено НИИ фармакологии СО РАМН (г.Томск) совместно с ООО «Саентифик Фьючер Менеджмент» (г.Новосибирск). Иммобилизация гиалуронидазы осуществлялась на низкомолекулярном полиэтиленгликоле (400 до 4000 Да) направленным потоком ускоренных электронов с энергией электронов 2,5 МэВ, поглощенная доза от 2 до 10 кГр, скорость набора дозы 1,65 кГр/час.

На сегодняшний день показана возможность стимуляции миелопоэза с помощью высоких доз препарата нативной гиалуронидазы [5]. Кроме того, известно, что иммобилизизация гиалуронидазы с помощью ионизирующего излучения на низкомолекулярном носителе сопровождается появлением новых физико-химических свойств у данного фермента, что делает эффективным его применение в качестве средства, увеличивающего популяцию родоначальных клеток различных классов (в том числе гемопоэтических предшественников) в костном мозге, в низких дозах [4]. При этом согласно литературным сведениям пегилированные (конъюгированные с полиэтиленгликолем) белковые средства являются более безопасными, чем их неконъюгированные аналоги [8].

Тем не менее способность кроветворных стволовых клеток к реализации своего ростового потенциала, проявляющегося увеличением образования зрелых клеток крови за счет стимуляции процессов их дифференцировки под влиянием модифицированной (иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза) гиалуронидазы, остается неизученной. В то же время известно, что процесс манипуляции разнородными субстанциями на молекулярном уровне [8, 9], в том числе с использованием физических факторов, обладающих высокой энергией, может сопровождаться непредсказуемыми изменениями не только стереохимической структуры исходных веществ, но и их функциональными характеристиками.

Факт применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции гемопоэза на фоне снижения риска развития осложнений и побочных эффектов за счет уменьшения лекарственной нагрузки на организм, для специалиста является неочевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Лабораторному животному 1 раз в сутки в течение 1-5 дней парентерально либо перорально вводят иммобилизированную гиалуронидазу в дозе 10-1000 ЕД/кг.

Эксперименты были проведены на мышах-самцах линии CBA/CaLac в количестве 543 штук, массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Эффективность стимуляции гемопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [10] с помощью стандартных и культуральных гематологических методов [11].

Пример 1

Моделирование цитостатической миелосупрессии осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора. Опытным животным на фоне моделирования миелосупрессии вводили внутрибрюшинно (парентерально) 1 раз в сутки в течение 2-х дней препарат нативной гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ) в дозах 1000 и 50 ЕД/кг (способ прототип) и препарат иммобилизированной гиалуронидазы внутрибрюшинно (парентарально) в дозе 50 ЕД/кг (1 раз в сутки в течение 2-х дней) и перорально в дозах 50 и 10 ЕД/кг (1 раз в сутки в течение 1 и 5 дней соответственно). При этом доза «Лидазы» в 1000 ЕД/кг в предварительных экспериментах была определена как максимально эффективная у препарата нативной гиалуронидазы.

Введение препарата нативной гиалуронидазы на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии сопровождалось стимуляцией процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения, но только при использовании дозы 1000 ЕД/кг. В данном случае отмечалось существенное увеличение содержания кроветворных прекурсоров (КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) и морфологически распознаваемых клеточных элементов эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения в гемопоэтической ткани (табл.1, 2). При этом указанные изменения сопровождались закономерным увеличением количества зрелых клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда в периферической крови (табл.3).

Вместе с тем эффективность применения иммобилизированной гиалуронидазы (имГД) наблюдалась при ее использовании во всех режимах и способах введения (табл.1, 2, 3). При этом парентеральное введение 50 ЕД/кг имГД приводило к значительно более выраженному увеличению показателей активности кроветворения, чем при использовании в качестве гемостимулятора препарата нативной гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг. Так, отмечалось более существенное увеличение содержания кроветворных прекурсоров, эритроидных клеток, незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге. Аналогичные изменения имели место в периферической крови. Количество нейтрофилов, ретикулоцитов и эритроцитов значительно превосходило значения соответствующих показателей у животных, которым вводили «Лидазу» (табл.3). Кроме того, в отличие от стандартного препарата фермента использование имГД сопровождалось значительным увеличением числа тромбоцитов в периферической крови.

Таким образом, иммобилизированная гиалуронидаза оказывала выраженный стимулирующий эффект в отношении эритроидного, гранулоцитарного и мегакариоцитарного (тромбоцитарного) ростков кроветворения. Причем, данное вещество приводило к максимально быстрому восстановлению показателей костного мозга и периферической крови при цитостатической миелосупрессии как при парентеральном, так и пероральном его использовании в низких дозах.

В целом, исходя из полученных данных следует, что средство, представляющее собой гиалуронидазу, иммобилизированную на водорастворимом носителе с помощью ионизирующего излучения, обладает выраженной гемостимулирующей активностью. При этом эффективность данного средства значительно превышает таковую у стандартных препаратов гиалуронидазы.

Цитируемая литература:

1. Glaspy J.A. Hematopoietic management in oncology practice. Part 1. // Myeloid growth factors Oncology (Huntingt). - 2003. - Vol.17. - №11. - P.1593-1603.

2. Волкова M.A. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - №4. - С.80-84.

3. Дубницкая Л.В., Назаренко Т.А. Возможности применения препарата Лонгидаза® в комплексной терапии патологических изменений эндометрия // Русский медицинский журнал. - 2008. - Т.16 - №19. - С.1248-1251.

4. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.7-10.

5. Патент (RU) на изобретение №2336899 «Способ стимуляции миелопоэза», 2008 г. Авторы: Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В.

6. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - vol.268. - p.2845-2857.

7. De Swarte R.D., Drug allergy. In: Patterson R. e.a. Allergic Diseases Diagnosis and Management, 4th ed. Philadelphia, Pa^ JB Lippincott. - 1993 - p.396-551.

8. Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии // Экспер. и клин. фарм. 2008. Том 71. №1. С.61-69.

9. Евдокимов Ю.М. Пространственно упорядоченные формы ДНК и ее комплексов - основа создания наноконструкций для медицины и биотехнологий // Российские нанотехнологии. - 2006. - №1-2. - С.256-264.

10. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1(9). - С.29-32.

11. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.

Таблица 1 Динамика содержания КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге мышей линии CBA\CaLac (на 10⁵ неприлипающих миелокариоцитов) после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m) Сроки исследования, сутки КОЕ-Э КОЕ-ГМ Фон 6,75±0,73 4,50±0,38   1 9,50±0,50* 8,38±0,63* 3-е 2 8,88±0,81 8,00±0,87*   3 9,13±1,13* 12,38±0,82*#   4 18,50±0,50*#$ 17,00±0,53*#$   5 14,38±1,00*#$ 14,63±0,51*#$   6 15,25±0,33*#$ 16,25±0,86*#$   1 7,25±0,70 6,63±0,73* 5-е 2 7,50±0,53 5,75±0,75   3 10,13±0,44*# 7,88±0,55*   4 14,88±0,44*#$ 10,75±0,45*#$   5 9,38±0,42*# 8,75±0,49*#   6 12,25±0,65*#$ 9,5±0,70*#   1 6,38±0,68 4,25±0,56 10-е 2 5,75±0,37 5,50±0,42   3 7,88±0,83 7,14±0,70*   4 10,00±0,71*# 9,2±0,2*#$   5 7,50±0,53 6,50±0,63*   6 12,1±0,33*#$ 9,88±0,72*#$ Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону, # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана. $ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг

Таблица Динамика костномозгового кроветворения у мышей линии CBA\CaLac (×10⁶/бедро) после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m) Сроки исследования, сутки Незрелые нейтрофильные гранулоциты Зрелые нейтрофильные гранулоциты Эозинофильные гранулоциты Лимфоидные клетки Моноциты Эритроидные клетки фон 1,10±0,10 3,72±0,31 0,47±0,09 3,38±0,30 0,48±0,06 1,77±0,32 3-е 1 0,04±0,01* 0,11±0,04* 0 1,87±0,15* 0,55±0,04 0,18±0,05* 2 0,05±0,02* 0,16±0,03* 0 1,57±0,13* 0,60±0,11 0,13±0,03* 3 0,13±0,03*# 0,15±0,04* 0 1,36±0,10*# 0,42±0,09 0,31±0,02*# 4 0,14±0,05*# 0,17±0,04* 0 1,29±0,12*# 0,61±0,06 0,28±0,02*# 5 0,15±0,02*# 0,11±0,02* 0,01±0,01* 1,36±0,07*# 0,36±0,04# 0,30±0,01*# 6 0,17±0,11*# 0,10±0,01* 0,01±0,01* 1,35±0,14*# 0,39±0,11 0,45±0,02*# 5-е 1 4,22±0,26* 1,45±0,26* 0,30±0,08 2,03±0,21* 0,86±0,08* 1,04±0,16 2 4,82±0,46* 1,69±0,23* 0,07±0,07* 2,66±0,26 0,98±0,20* 1,27±0,28 3 6,31±0,52*# 2,2±0,11*# 0,12±0,08 2,28±0,36 1,29±0,15* 1,98±0,30# 4 8,49±0,50*# 3,98±0,33# 0,17±0,10 2,62±0,23 2,14±0,22*#$ 2,78±0,19#$ 5 5,77±0,44*# 3,26±0,29# 0,31±0,08 2,88±0,09 0,90±0,12* 1,74±0,08# 6 6,01±0,46*# 2,26±0,26# 0,15±0,08* 2,15±0,18 1,07±0,15* 2,09±0,29# 10-е 1 1,00±0,18 6,65±0,45* 0,76±0,45 1,82±0,25* 0,60±0,09 0,35±0,06* 2 0,80±0,11 6,57±0,53* 0,51±0,10 1,87±0,17* 0,66±0,14 0,39±0,03* 3 0,99±0,06 6,11±0,57* 0,33±0,10 2,39±0,50 0,94±0,21 1,29±0,19# 4 0,97±0,13 6,32±0,48* 0,53±0,12 3,35±0,65# 1,00±0,09*# 3,71±0,02*#$ 5 0,74±0,05 6,13±0,68* 0,29±0,10 2,49±0,56 1,39±0,26*# 2,63±0,22*#$ 6 0,86±0,13 5,78±0,34* 0,21±0,06 2,45±0,32 1,49±0,16*# 3,1±0,15*#$ Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону, # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана $ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалупонидазы в дозе 1000 ЕД/кг

Таблица 3 Показатели периферической крови у мышей линии CBA\CaLac после введения дистиллированной воды (1), 50 ЕД/кг (2) и 1000 ЕД/кг «Лидазы» (3), а также 50 ЕД/кг внутрибрюшинно (4), 50 ЕД/кг перорально (5) и 10 ЕД/кг перорально (6) иммобилизированной ГД на фоне введения циклофосфана в МПД, (X±m) Сроки исследования, сутки Эритроциты, Т/л Ретикулоциты, в промиллях Палочкоядерные нейтрофилы, Г/л Сегментоядерные нейтрофилы, Г/л Тромбоциты, Т/л Фон 8,61±0,18 14,1±0,3 0,40±0,06 2,26±0,02 796,57±77,49   1 7,89±0,28* 10,7±0,24* 0,01±0,01* 0,12±0,03* 503,80±25,97* 3-е 2 7,19±0,21* 9,89±0,37* 0,01±0,01* 0,13±0,03* 557,83±46,69*   3 7,84±0,25* 12,8±0,6*# 0,02±0,01* 0,17±0,02* 505,67±24,25 *   4 7,69±0,14* 14,7±0,52#$ 0,02±0,01* 0,15±0,01* 568,17±22,60*   5 7,59±0,18* 12,3±0,41*# 0,04±0,02* 0,14±0,06* 560,67±36,33*   6 7,54±0,45* 12,7±0,38*# 0,02±0,01* 0,15±0,01* 509,83±58,60*   1 7,53±0,15* 28,4±1,3* 0,16±0,04* 0,75±0,23* 349,40±36,84* 5-е 2 7,85±0,27* 27,6±2,4* 0,13±0,05* 0,65±0,10* 393,33±33,96*   3 8,59±0,12# 37,5±1,89*# 0,41±0,08# 1,7±0,16# 321,60±23,22*   4 9,53±0,35*#$ 41,2±1,3*# 0,83±0,25*#$ 2,47±0,16#$ 672,83±22,69#$   5 8,06±0,30 34,5±0,96*# 0,99±0,31*#$ 1,69±1,12# 450,83±11,12*#   6 9,13±0,08*# 32,7±2,3*# 1,03±0,21*#$ 1,79±0,14# 727,67±74,10#   1 7,29±0,18* 15,6±1,4 1,31±0,32* 5,13±0,63* 977,33±27,66 10-е 2 7,18±0,15* 16,7±0,78* 1,71±0,42* 5,36±1,15* 843,33±100,51   3 7,33±0,15* 16,4±0,97* 1,17±0,23* 7,42±0,18*# 884,17±33,78   4 8,14±0,17$ 24,3±1,7*#$ 1,25±0,14* 8,50±0,37*#$ 1143,17±38,51*#$   5 7,36±0,29* 19,4±0,45*#$ 1,18±0,24* 7,93±0,65*# 1367,80±101,30*#   6 8,53±0,18 26,7±1,84*#$ 1,48±0,26* 8,67±0,42*#$ 803,83±98,77 Примечание: * - различия достоверны по отношению к фону, # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана, $ - различия достоверны с группой животных, получавших стандартный препарат гиалуронидазы в дозе 1000 ЕД/кг

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии и гематологии. Средство для стимуляции гемопоэза представляет собой гиалуронидазу, иммобилизированную на низкомолекулярном полиэтиленгликоле с молекулярной массой от 400 до 4000 Да направленным потоком ускоренных электронов 2,5 МэВ, с поглощенной дозой от 2 до 10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/час. Для стимуляции гемопоэза иммобилизированную вышеуказанным образом гиалуронидазу вводят парентерально либо перорально 1 раз в сутки в течение 1-5 дней в дозе 10-1000 ЕД/кг. Использование иммобилизированной с помощью технологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы позволяет повысить безопасность и эффективность стимуляции гемопоэза. 2 н.п. ф-лы, 3 табл.

1. Средство для стимуляции гемопоэза, представляющее собой гиалуронидазу, иммобилизированную на низкомолекулярном полиэтиленгликоле с молекулярной массой от 400 до 4000 Да направленным потоком ускоренных электронов 2,5МэВ с поглощенной дозой от 2 до 10 кГр и скоростью набора дозы 1,65 кГр/ч.

2. Способ стимуляции гемопоэза, включающий введение препарата, отличающийся тем, что в качестве препарата используют иммобилизированную гиалуронидазу по п.1, которую вводят парентерально либо перорально 1 раз в сутки в течение 1-5 дней в дозе 10-1000ЕД/кг.