СПОСОБ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ ЭРИТРОПОЭЗА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ Российский патент 2007 года по МПК G09B23/28 A61K38/19 A61P25/00 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к фармакологии, и касается способа коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии.

Известны способы коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при моделировании гипоксии, сопровождающейся развитием энцефалопатии, с помощью оксибутирата натрия, вводимого сразу после воздействия в наркотической дозе 750 мг/кг [1] и с помощью неселективного бета-адреноблокатора - пропранолола [2].

Недостатком способа коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при моделировании гипоксической энцефалопатии, с помощью оксибутирата натрия является его низкая эффективность в случае отсроченного применения данного препарата, когда развитие гипоксической энцефалопатии (а нарушения в системе крови связаны именно с энцефалопатией [1]) предотвратить уже невозможно, а в клинической практике далеко не всегда является возможным проведение лечебных мероприятий сразу после гипоксической травмы [3].

Недостатком способа коррекции нарушений эритропоэза, сопровождающих энцефалопатию, с помощью пропранолола является факт отсутствия значимого влияния данного препарата на непосредственную причину развития нарушений в системе крови - поражение структур ЦНС. В связи с чем способ эффективен только при постоянном приеме препарата.

Данный способ (с помощью пропранолола) является наиболее близким к заявляемому по достигаемому результату и выбран в качестве способа прототипа.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности предлагаемого способа.

Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой коррекцию нарушений эритропоэза, заключающимся в подкожном введении лабораторным животным (мыши) после моделирования энцефалопатии препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день, в течение 1-5 дней.

Новым в предлагаемом изобретении является использование препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, вводимого в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день, в течение 1-5 дней.

Повреждение головного мозга при воздействии различных болезнетворных факторов зачастую сопровождается расстройствами функционирования органов и систем, подчиненных регуляторному влиянию тех структур центральной нервной системы, которые ответственны за их деятельность и которые существенно "пострадали" в результате воздействия. Таким образом, поражение структур ЦНС, ответственных за управление деятельностью внутренних органов и систем, способно приводить к развитию дизрегуляторной патологии висцеральных органов после воздействия [4].

Система крови играет одну из ключевых ролей в поддержании гомеостаза и формировании адекватных компенсаторно-приспособительных реакций организма при воздействии болезнетворных факторов. В то же время известно, что развитие энцефалопатии при гипоксических воздействиях вызывает дизадаптацию гемопоэтической ткани, проявляющуюся в повреждении кроветворных прекурсоров, снижении уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и продукции патологических форм эритроцитов, что существенно ухудшает окислительное обеспечение тканей организма, перенесшего терминальное состояние [1, 5].

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) является линейно рестриктивным гемопоэтическим фактором с его основным специфическим гранулоцитопоэз-стимулирующим действием [6]. При этом сведений о существенном стимулирующем влиянии данного цитокина на эритропоэз нет. В то же время известно, что Г-КСФ обладает выраженным нейропротективным действием и способен положительно влиять на психоневрологический статус при энцефалопатии различного генеза [7]. Однако факт применения препарата Г-КСФ с целью коррекции нарушений эритропоэза для специалиста не является очевидным. Эксперимент показал непредсказуемые результаты. При этом в предварительных экспериментах было выявлено, что доза 125 мкг/кг гранулоцитарного колониестимулирующего фактора является оптимальной и эффективна даже при однократном введении препарата. В то же время увеличение кратности введения Г-КСФ до 5 раз (1 раз в день, 5 дней) повышает эффективность способа максимально.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют эффективно коррегировать нарушения эритропоэза при энцефалопатии, и предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: "Новизна", "Изобретательский уровень", "Промышленная применимость".

Способ осуществляют следующим образом.

Лабораторному животному (мыши) после моделирования энцефалопатии 1 раз в день подкожно вводили по 125 мкг/кг в течение 1-5 дней препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рч Г-КСФ).

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 278 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

На 3, 5, 7, 10-е сут определяли показатели периферической крови с помощью автоматического гематологического анализатора ABACUS (Diatron, Австрия) в ветеринарном режиме, костномозгового кроветворения стандартными гематологическими методами, содержание эритроидных клеток-предшественников (КОЕ-Э) в костном мозге, их пролиферативную активность и интенсивность дифференцировки [8]. Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Пример 1.

Гипоксическая энцефалопатия моделировалась с помощью гермокамеры объемом 500 мл. Мыши помещались в гермокамеру, крышка закрывалась, и мыши оставались там до агонального судорожного припадка или остановки дыхания, определяемой визуально, в течение 10-15 секунд. После извлечения из гермокамеры и восстановления самостоятельного дыхания, через 5-10 минут, мыши вновь помещались в гермокамеру также до наступления агонального состояния (генерализованного судорожного припадка или остановки дыхания) [5]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа однократно подкожно на 2-е сут после воздействия вводили пропранолол ("Arzneimittelwerk", Германия) в дозе 5 мг/кг. Опытным животным на 2-е сут после моделирования гипоксии подкожно однократно вводили 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) - нейпоген ("Hoffinan-la Roche", Швейцария) - в эквивалентном объеме растворителя (0,2 мл).

В ходе эксперимента введение пропранолола на 2-е сут после воздействия приводило к увеличению в периферической крови числа эритроцитов (7-е сут), содержания гемоглобина (5-е сут) и отмене развития гипохромной анемии. Указанные изменения со стороны периферической крови явились закономерным отражением динамики костномозгового эритропоэза. Отмечалось увеличение количества эритрокариоцитов в костном мозге на 5-е сут опыта, связанное с повышением содержания эритроидных прекурсоров (5-е сут) в гемопоэтической ткани, и ускорение темпа их деления на 3-е сут исследования.

Назначение рчГ-КСФ в те же сроки после воздействия сопровождалось значительно более существенным и продолжительным увеличением количества эритроцитов (7, 10-е сут), содержания гемоглобина (5, 7, 10-е сут) в периферической крови, числа эритроидных ядросодержащих клеток (5, 10-е сут) и КОЕ-Э в костном мозге (5, 7, 10-е сут) на фоне ускорения деления прекурсоров эритропоэза на 3, 5, 7-е сут опыта (табл.1).

Пример 2.

Энцефалопатия моделировалась на мышах линии CBA/CaLac, массой 18-20 г путем однократного внутрибрюшинного введения раствора соляно-кислого фенилгидразина в дозе 150 мг/кг [9]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа подкожно на 1-3-е сут после воздействия вводили пропранолол ("Arzneimittelwerk", Германия) в дозе 5 мг/кг. Опытным животным в те же сроки подкожно вводили в дозе 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) - нейпоген ("Hoffman-la Roche", Швейцария).

Проведенные исследования показали, что введение пропранолола приводило к достоверным, но незначительным изменениям со стороны системы эритрона. Отмечалось повышение количества эритроцитов и гематокрита на 7, 10-е сут наблюдения. Со стороны костномозгового кроветворения имело место повышение уровня гиперплазии эритроидного ростка на 5-е сут опыта в результате повышения содержания колониеобразующих единиц эритропоэза (3-е сут) в костном мозге.

При введении препарата рчГ-КСФ увеличение количества эритроцитов и гематокрита также регистрировалось на 7, 10-е сут, а числа эритрокариоцитов в костном мозге на 5, 7, 10-е сут. При этом имело место возрастание содержания КОЕ-Э в гемопоэтической ткани на 5, 7, 10-е сут эксперимента, связанное с повышением их пролиферативной активности (табл.2).

Пример 3.

Энцефалопатию моделировали у мышей линии CBA/CaLac, массой 18-20 г, путем пункции ретроорбитального синуса и выпускания через промытую раствором гепарина пастеровскую пипетку в течение 3-х часов дробно, за 3 раза, 70% объема циркулирующей крови. Расчет необходимого для забора количества крови производят из предположения, что у грызунов объем циркулирующей крови составляет 1/13 часть от массы тела животного [10]. Контрольной группе животных по схеме способа прототипа подкожно с 1 по 5-е сут после воздействия вводили пропранолол ("Arzneunittelwerk", Германия) по 5 мг/кг. Опытным животным в те же сроки подкожно вводили в дозе 125 мкг/кг препарата рекомбинантного человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (рчГ-КСФ) - нейпоген ("Hoffinan-la Roche", Швейцария).

Введение пропранолола повышало количество эритроцитов на 5, 7, 10-е сут и гематокрит на 5-е сут наблюдения. При этом в костном мозге имело место увеличение количества эритрокариоцитов в костном мозге на 5, 7-е сут опыта по сравнению с животными, которым активность адренергических механизмов не коррегировалась. Культуральные методы исследования механизмов развития описанных феноменов выявили возрастание числа КОЕ-Э в костном мозге на 3, 7-е сут наблюдения.

Курсовое введение рчГ-КСФ увеличивало количество эритроцитов и гематокрит на 5, 7, 10-е сут после воздействия. Повышение количества эритрокариоцитов в костном мозге регистрировалось на 5, 7, 10-е сут опыта, причем изменения данного параметра значительно превосходили аналогичные значения в группе животных, леченных по способу-прототипу. Описанные изменения явились следствием возрастания пролиферативной активности КОЕ-Э и увеличения их содержания в костномозговой ткани практически во все сроки наблюдения (табл.3).

Таким образом, введение препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при моделировании энцефалопатии приводило к повышению содержания прекурсоров эритропоэза в гемопоэтической ткани, возрастанию уровня гиперплазии эритроидного ростка кроветворения и увеличению количества эритроцитов в периферической крови. По всем показателям "положительный" эффект рчГ-КСФ превосходил эффект коррекции нарушений эритропоэза по способу-прототипу. При этом механизмом действия препарата, очевидно, являлось его нейропротективное действие [7] и предотвращение повреждения коммитированных клеток-предшественников эритропоэза в результате отмены дизрегуляции системы крови.

Предлагаемый способ позволяет эффективно проводить коррекцию нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии различного генеза.

Цитируемая литература

1. Зюзьков Г.Н. Механизмы регуляции гемопоэза в постгипоксическом периоде: Дисс... канд. мед. наук. - Томск, 2003. - 158 с.

2. Зюзьков Г.Н., Абрамова Е.В., Дыгай А.М., Гольдберг Е.Д. Роль адренергических механизмов регуляции эритропоэза при гипоксии высокой степени тяжести // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. - №7. - С.18-23.

3. Алексеева Г.В., Гурвич А.М., Семченко В.В. Постреанимационная энцефалопатия (патогенез, клиника, профилактика и лечение). - Омск; Омская областная типография, 2003.-152 с.

4. Дизрегуляционная патология. / Под ред. Г.Н.Крыжановского. - М.: Медицина, 2002. - 652 с.

5. Патент РФ на изобретение №2240604 "Способ моделирования постгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови".

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск, 1999. - 114 с.

7. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Суслов Н.И., Ставрова Л.А., Сотникова Н.В. Психофармакологические эффекты гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и их механизмы при гипоксии высокой степени тяжести // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2005. - №4. - С.367-370.

8. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 264 с.

9. Патент РФ на изобретение №2253152 "Способ моделирования гипоксической энцефалопатии".

10. Патент РФ на изобретение №2257620 "Способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии".

Таблица 1Динамика показателей системы эритрона у мышей линии CBA\CaLac при постгипоксической энцефалопатии (1), при введении пропранолола (2) и Г-КСФ (3) после гипоксического воздействия, (Х±m)Сроки исследования, суткиЭритроциты, Т/лГемоглобин, г/лЭритрокариоциты, × 10⁶/бедроКОЕ-Э, на 10⁵/нуклеаровКОЕ-Э в S-фазе, %Интенсивность диф-ки, в усл.ед.интакт11,42±0,14147,72±5,481,31±0,064,5±0,5623,19±8,4213,51±0,493-е111,78±10,32151,12±10,26,22±0,597,67±0,4917,84±6,3424,65±1,75    ** * 211,41±0,12148,78±6,915,87±0,437,5±0,9871,09±3,4210,98±0,57    ***#  311,5±0,45156,7±7,15,7±1,26,89±0,9380,1±7,420,1±2,3      *#* 111,45±0,26143,3±4,23,19±0,318,14±0,7429,81±8,4722,25±1,875-е   ** *  12,26±0,06162,25±4,944,12±0,211,53±0,3139,22±1,5824,69±2,97 2**#*#*#**  11,97±0,22164,7±5,34,56±0,4710,3±0,2674,5±5,627,4±3,6 3 *#*#*#*#* 110,6±0,24121,4±6,743,9±0,615,5±0,5021,73±4,7529,12±3,347-е ***  * 211,98±0,06149,94±12,354,3±0,685,8±0,4328,6±3,7820,98±0,57  *# ** * 311,73±0,04153,48±6,14,51±1,018,4±6,162,9±7,127,89±2,9  *##**#*#*10-е111,0±0,21151,4±3,953,35±0,277,16±0,6055,77±3,7424,14±3,29    **** 211,51±0,2149,17±7,264,1±0,787,43±0,4943,36±3,5423,7±1,34    ****  12,01±0,27167,32±4,54,78±0,3210,2±0,4961,2±11,719,4±2,3 3*#*#*#*#*** - отмечена достоверность различий с интактным контролем при р<0,05# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных без препарата (1) при р<0,05

Таблица 2Динамика показателей системы эритрона у мышей линии CBA\CaLac после моделирования энцефалопатии, введением 150 мг/кг солянокислого фенилгидразина (1), при введении пропранолола (2) и Г-КСФ (3) после воздействия, (Х±m)Сроки исследования, суткиЭритроциты, Т/лГематокрит, %Эритрокариоциты, × 10⁶/бедроКОЕ-Э, на 10⁵/нуклеаровКОЕ-Э в S-фазе, %Интенсивность диф-ки, в усл.ед.интакт11,22±0,1645,88±0,763,02±0,253,83±0,4837,33±6,1715,56±2,893-е15,57±0,1720,47±0,823,39±0,175,67±0,4953,79±3,6234,79±1,77  ** * * 26,07±0,1427,15±4,283,2±0,587,83±0,7353,28±5,0541,04±4,38  **   * 36,07±0,1427,15±4,283,2±0,587,4±0,883,28±4,0539,5±3,74  **  *#*5-е15,59±0,6521,9±2,365,01±0,314,33±0,6170,0±3,3537,99±2,79  ****** 26,2±0,129,32±4,536,2±0,297,0±0,5862,93±6,239,49±6,45  ***#*# * 36,2±0,129,32±4,536,7±0,347,3±0,4460,4±3,942,3±5,97  ***#*#**7-е14,4±0,5518,5±2,844,91±0,275,17±0,456,0±2,019,95±0,77  *****  25,63±0,1924,2±3,385,82±0,215,4±0,4361,67±9,1223,53±2,87  *#*#** * 35,9±0,3428,3±2,096,07±0,356,9±0,1688,6±6,933,53±4,2  *#*#*#*#*#*10-е13,94±0,5721,32±3,115,34±0,468,67±0,8857,55±3,5125,96±1,65  ****** 25,1±0,1130,48±1,915,5±0,267,03±1,142,47±6,7526,24±5,82  *#*#**    6,0±0,1834,7±2,26,5±0,1712,03±1,0747,31±12,116,24±8,2 3*#*#*#*#  * - отмечена достоверность различий с интактным контролем при р<0,05# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных без препарата (1) при р<0,05

Таблица 3Динамика показателей системы эритрона у мышей линии CBA\CaLac после моделирования энцефалопатии, вызванной потерей 70% объема циркулирующей крови (1), при введении пропранолола (2) и Г-КСФ (3) в постгеморрагическом периоде, (Х±m)Сроки исследования, суткиЭритроциты, Т/лГематокрит, %Эритрокариоциты, × 10⁶/бедроКОЕ-Э, на 10⁵/ нуклеаровКОЕ-Э в S-фазе, %Интенсивность диф-ки, в усл.ед.интакт11,42±0,2848,45±1,052,44±0,37,67±1,1219,95±5,436,64±0,563-е16,22±0,0927,98±0,315,45±0,649,33±1,9157,02±6,918,08±1,6  ****** 26,33±0,0729,91±0,545,7±0,4114,5±0,4341,09±6,6217,29±1,16  ****#** 36,41±0,1427,1±0,615,7±0,4113,7±0,2475,4±7,1116,9±2,3  ****#*#*5-е16,49±0,1229,73±0,534,88±0,2310,5±0,7246,79±4,4416,26±0,4  ****** 27,85±0,4136,34±0,896,74±0,3111,8±0,8638,79±3,4116,22±1,53  *#*#*#*** 38,15±0,4837,4±0,877,0±0,6213,8±0,9181,6±10,0219,4±2,6  *#*#*#*#*#*7-е16,59±0,1430,08±0,716,33±0,6810,5±1,144,67±2,9612,0±1,59  ****** 27,27±0,2733,78±2,77,1±0,9515,67±0,944,38±4,1815,68±1,38  *#***#** 37,8±0,2135,0±1,17,33±0,1111,67±1,0979,3±7,6214,8±0,97  *#*#*# *#*10-е19,08±0,3939,5±1,186,01±0,2412,33±0,829,17±3,117,16±0,65  ****   28,87±0,2140,45±1,277,2±0,2115,33±1,8437,06±2,97,66±0,74  *#**#**  39,68±0,2142,6±0,977,06±0,1818,7±1,433,2±4,16,39±1,3  *#*#*#*#* * - отмечена достоверность различий с интактным контролем при р<0,05# - отмечена достоверность различий с показателями в группе животных без препарата (1) при р<0,05

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальному обоснованию терапии для коррекции нарушений эритропоэза, развивающихся при энцефалопатии. Для этого используют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор. Это средство в дозе 125 мкг/кг вводят подкожно 1 раз в день в течение 1-5 дней. При этом энцефалопатию моделируют гипоксией или внутрибрюшинным введением раствора солянокислого фенилгидразина. Предлагаемый способ позволяет эффективно проводить коррекцию нарушений эритропоэза за счет нейропротективного действия и предотвращения повреждения коммитированных клеток-предшественников эритропоэза. 3 табл.

Способ коррекции нарушений эритропоэза при экспериментальной энцефалопатии путем введения препарата, отличающийся тем, что энцефалопатию моделируют гипоксией или внутрибрюшинным введением раствора солянокислого фенилгидразина, а для коррекции нарушений эритропоэза в качестве препарата используют гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, который вводят подкожно после моделирования энцефалопатии в дозе 125 мкг/кг 1 раз в день в течение 1-5 дней.