РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК Collbd-BMP-7, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pCollbd-BMP-7, ШТАММ Escherichia coli-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Collbd-BMP-7, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Collbd-BMP-7 Российский патент 2011 года по МПК C12N15/12 

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для производства рекомбинантного белка, иммобилизованного на коллагенсодержащем носителе, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов, покрытий и пр.

Хорошо известно, что процесс формирования костной ткани зависит от активности клеток, участвующих в остеогенезе, и от влияния ростовых факторов, так называемых остеоиндуктивных белков. Около 40 лет назад Marshall R. Urist обнаружил, что внеклеточный костный матрикс содержит субстанцию, стимулирующую формирование костной ткани (Urist MR. Bone: formation by autoinduction. Science 1965; 150: 893-9.) Эти соединения, названные позже костные морфогенетические белки (bone morphogenetic proteins, BMPs), стали объектами пристального изучения и разработки на их основе терапевтических препаратов. Дальнейшие исследования привели к выделению индивидуальных BMP, способных стимулировать образование костной ткани мезенхимальными стволовыми клетками (Reddi АН. Bone morphogenetic proteins: from basic science to clinical applications. J. Bone Joint Surg. Am. 2001; 83-A (Suppl. 1): S1-S6).

На сегодняшний день идентифицировано более 20 типов BMP человека. Первый рекомбинантный BMP - BMP-7 - был получен в 1990 г. (Sampath TK, Maliakal JC, Hauschka PV et al. Recombinant human osteogenic protein-1 (hOP-1) induces new bone formation in vivo with a specific activity comparable with natural bovine osteogenic protein and stimulates osteoblast proliferation and differentiation in vitro. J. Biol. Chem. 1992; 267: 20352-62). Однако добиться экспрессии рекомбинантного ВМР-7 в клетках Е.coli не удалось.

Введение биологически активных компонентов с помощью добавления их растворимых форм или пропитки ими материалов обеспечивает лишь кратковременный эффект. Это связано с их быстрым удалением из поврежденного участка, даже при введении ростовых факторов в материал покрытия. Более длительный эффект вызывает иммобилизация биологически активных компонентов непосредственно в раневом покрытии. Таким образом, весьма перспективным подходом для развития методов реконструктивной хирургии является создание материалов и покрытий, несущих на поверхности иммобилизованные специфические факторы роста, и изучение их влияния на приживаемость имплантата.

Однако процессы иммобилизации этих белков, основанные, как правило, на химической пришивке, многостадийны, трудоемки, дорогостоящи и небезопасны с точки зрения обеспечения экологической безопасности производства. Важной проблемой остается разработка методов очистки конечных продуктов от липополисахаридов, балластных белков, ДНК и РНК штаммов-продуцентов; получение функционально активных биологических компонентов.

Аналогов препаратов ВМР-7, иммобилизованного на коллагенсодержащем носителе за счет аффинного взаимодействия, в доступных источниках информации не обнаружено.

В основу заявленной группы изобретений положена задача создания штамма Е.coli, обеспечивающего высокий уровень продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 и одновременно простую и эффективную схему очистки упомянутого белка, с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов и покрытий.

Упомянутая задача решена за счет синтеза рекомбинантного белка Collbd-BMP-7, в частности за счет введения в состав рекомбинантного белка коллагенсвязывающего домена Collbd (SPARC(w)), из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC (ВМ-40, или остеонектина) человека. А также за счет введения между функциональными доменами спейсерной последовательности GGS для сохранения функции активации клеточного роста слитными белками, связанными с коллагеновым матриксом. Помимо этого упомянутая задача решена за счет возможности одностадийной высокоэффективной очистки рекомбинантного белка Collbd-BMP-7, содержащего коллагенсвязывающий домен, и иммобилизации его на коллагенсодержащем нанокомпозитном покрытии.

Сущность изобретения состоит в том, что рекомбинантная плазмида pCollbd-BMP-7 размером 3525 п.н. обеспечивает экспрессию рекомбинантного белка Collbd-BMP-7, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка BMP-7, и содержит:

- искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий: промоторную область раннего промотора бактериофага Т5 (7-87 п.н.), обеспечивающую эффективную транскрипцию контролируемой мРНК; рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка (коллагенсвязывающий домен Collbd - спейсер - костный морфогенетический белок BMP-7) (117-623 п.н.); нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции (663-757 п.н.);

- бактериальный оперон bla (3320-2460 п.н. комплементарной цепи), кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов Е.coli методом контрселекции;

- бактериальный участок инициации репликации типа ColE1 (1630 п.н.), обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах Е.coli.

Штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] получен трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой pCollbd-BMP-7. Полученный штамм является продуцентом рекомбинантного белка Collbd-BMP-7, состоящего из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка ВМР-7.

Рекомбинантный белок Collbd-BMP-7, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC человека, спейсера из остатков глицина и серина и костного морфогенетического белка BMP-7, обладает биологическими свойствами белка BMP-7 и способностью самопроизвольно связываться с коллагенсодержащим сорбентом.

Способ получения рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 включает выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7], индукцию синтеза белка Collbd-BMP-7, разрушение клеток, получение супернатанта, содержащего белок, иммобилизацию белка путем добавления к супернатанту суспензии коллагенсодержащего сорбента, инкубирование, отмывание сорбента со связавшимся белком, последующую элюцию белка с сорбента и диализ.

Техническим результатом заявленного изобретения является обеспечение высокого уровня продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 и одновременно обеспечение простой и эффективной схемы очистки этого белка с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов и покрытий.

Таким образом, технический результат достигается за счет того, что создана рекомбинантная плазмида pCollbd-BMP-7, кодирующая бифункциональный рекомбинантный белок Collbd-BMP-7, с одной стороны, содержащий аминокислотную последовательность BMP-7, а с другой, обладающий способностью самостоятельно связываться с коллагенсодержащим сорбентом благодаря наличию коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC человека.

Также указанный технический результат достигается тем, что штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] является продуцентом рекомбинантного белка Collbd-ВМР-7. При этом отсутствие в клетках Е.coli белков, способных связываться с коллагеном, служит гарантией того, что рекомбинантный белок Collbd-BMP-7 является единственным белком штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7], прочно связывающимся с используемым сорбентом, что обеспечивает возможность одностадийного получения высокоочищенного препарата указанного рекомбинантного белка, иммобилизованного на коллагенсодержащем сорбенте.

Штамм Е.coli M15 [pREP4], содержащий плазмиду pCollbd-BMP-7, - продуцент рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 - характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, грамотрицательные. При рассеве на чашке с 1,5% LB-агаром рост в виде отдельных колоний, иногда в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (LB-бульон, LB-aгap, МПА, МПБ).

Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут в пределах +4 - 42°C при оптимуме рН 6,8-7,5. Штаммы разлагают глюкозу, маннит с образованием кислоты, не разлагают сахарозу, арабинозу, галактозу, сбраживают мальтозу, ксилозу, сорбит, рамнозу. Существенной при использовании данных штаммов является их чувствительность к налидиксовой кислоте (25 мг/мл), стрептомицину (20 мг/мл) и рифампицину (25 мг/мл). Проявляют устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pCollbd-BMP-7, и к канамицину (до 25 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды pREP4.

Указанный технический результат достигается также тем, что рекомбинантный белок pCollbd-BMP-7, включающий в себя аминокислотную последовательность, определяющую способность данного белка связываться с коллагенсодержащим сорбентом, позволяет проводить в одну стадию концентрирование, очистку и иммобилизацию белка Collbd-BMP-7 на коллагенсодержащем сорбенте.

Достигается указанный технический результат также тем, что способ очистки, концентрирования и получения иммобилизованного рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 заключается в обработке супернатанта гидролизата клеток штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] коллагенсодержащим сорбентом с последующей отмывкой сорбента с иммобилизованным рекомбинантным белком.

Изобретение проиллюстрировано чертежом.

На чертеже представлена схема плазмиды pCollbd-BMP-7.

В перечне последовательностей: нуклеотидная последовательность плазмиды pCollbd-BMP-7 - последовательность №1, аминокислотная последовательность белка коллагенсвязывающего домена Collbd - последовательность №2, аминокислотная последовательность глицин-серинового спейсера - последовательность №3, аминокислотная последовательность костного морфогенетического белка BMP-7 - последовательность №4.

Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д.Гловера. Пер. с англ., М.: Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Science, 1988. V.239, №4839, p.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V.74, p.5463-5467).

Ниже приведены примеры, иллюстрирующие изобретение.

Примеры.

Пример 1. Получение плазмиды pQE6-BMP-7.

а) Химический синтез олигодезоксирибонуклеотидов.

Олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы твердофазным фосфорамидитным методом с помощью синтезатора АСМ 100-2 (Новосибирск) и очищены методом электрофореза в 12%-ном ПААГ.

б) Получение гена ВМР-7 с последующим его клонированием.

Копию гена BMP-7 получали методом полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Для этого проводили выделение тотальной РНК человека из скелетной мышцы человека. кДНК получали путем обработки 100ng полиаденилированной РНК скелетной мышцы человека с помощью ImProm-II обратной транскриптазы Promega согласно протоколу производителя.

Для последующей ПЦР были выбраны праймеры, соответствующие началу и концу гена BMP-7. В прямой праймер был введен сайт BamHI, а в обратный - сайты BglII, Kpn2I и стоп-кодон.

DIR: 5'-GGATCCAGATCCTCCACGGGGAGCAAACAGCGCA-3'

REV: 5'-TCCGGACTAAGATCTGTGGCAGCCACAGGCCCGGA-3'

2 мкл полученной в результате обратной транскрипции смеси вносили в реакционную смесь для ПЦР, которая содержала 10 пкМ каждого праймера (Dir и Rev), 67 мМ трис-HCl (рН 8,8 при 25°C), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, дГТФ по 2,5 мМ) и 1 ед. полимеразы Native Pfu Polymerase (Stratagene). Реакцию амплификации проводили в объеме 25 мкл под вазелиновым маслом: 1 цикл 95°C - 3 мин; 35 циклов: 95°C - 15 сек, 72°C - 1 мин.

Продукт амплификации размером 444 п.н. обрабатывали хлороформом, переосаждали этиловым спиртом и растворяли в воде. Для клонирования данного продукта полученную ДНК ВМР-7, а также ДНК плазмиды pQE6 («Qiagene», США) гидролизовали рестрикционными эндонуклеазами BamHI и BspEI при 37°C в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 37°C), 20 мМ ацетата магния, 132 мМ ацетата калия и 0,2 мг/мл BSA в течение 1,5 ч.

Выделенные из геля рестрикционные фрагменты: фрагмент ДНК, соответствующий гену BMP-7 размером 438 п.н., фрагмент плазмиды pQE6 размером 3024 п.н. лигировали с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Эту конструкцию использовали для трансформации клеток E.coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками ампициллином и канамицином. Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса, анализировали с помощью рестриктаз BamHI и Kpn2I, а также рестриктаз, находящихся внутри клонируемых фрагментов, и отбирали клоны, плазмидная ДНК которых рВМР-7 размером 3462 н.п. содержит последовательность гена BMP-7.

Первичную структуру полученной плазмиды подтверждали секвенированием.

г) Получение участка гена SPARC, содержащего последовательность коллагенсвязывающего домена Collbd, с последующим его клонированием в плазмидную конструкцию pQE6-BMP-7.

Коллагенсвязывающий домен Collbd из внеклеточного белка SPARC (ВМ-40 или остеонектин) человека был синтезирован с использованием 4-х олигонуклеотидов следующего состава:

Dir1: CATGGGATCCCTGGACTCTGAACTGACCGAATTCCCGCTGCGCATGCGT

Dir2: GACTGGCTGAAAAACCCGGGTGGTTCTA

Rev1: GATCTAGAACCACCCGGGTTTTTCAGCCAGTCACGCATG

Rev2: CGCAGCGGGAATTCGGTCAGTTCAGAGTCCAGGGATCC.

Олигонуклеотиды были спланированы таким образом, что при гибридизации они образуют двуцепочечный фрагмент ДНК, содержащий липкие концы, соответствующие сайтам гидролиза рестриктаз NcoI и BglII. При синтезе олигонуклеотиды были фосфорилированы по 5' - концу.

Для получения двухцепочечного фрагмента ДНК смесь олигонуклетидов (по 20 пкМ), прогревали при 95°С (10 мин) и в течение 4 часов охлаждали до 25°С. Полученную смесь объединяли с фрагментом плазмиды pQE6-BMP2 (3376 п.н.), гидролизованной эндонуклеазами рестрикции NcoI и BamHI при 37°C в буфере, содержащем 66 мМ Трис-ацетат (рН 7,9 при 37°C), 20 мМ ацетат магния, 132 мМ ацетат калия в течение 1,5 часов. Лигирование проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 в буфере, содержащем 40 мМ Трис-HCl (рН 7,8 при 25°C), 10 мМ хлористого магния, 10 мМ ДТТ и 5 мМ АТФ. Лигированную смесь ДНК использовали для трансформации клеток Е.coli M15 [pREP4] методом электропорации. Трансформированные клетки отбирали на агаризованной среде LB с антибиотиками канамицином (25 мкг/мл) и ампициллином (100 мкг/мл). Из отобранных рекомбинантных клонов выделяли плазмидную ДНК pCollbd-BMP-7 методом щелочного лизиса. Отобранные клоны секвенировали и подтвердили наличие вставки, соответствующей коллагенсвязывающему домену Collbd из внеклеточного белка SPARC (или ВМ-40, или остеонектина) человека.

Пример 2. Получение штамма Е.coli - продуцента рекомбинантного белка Collbd-ВМР-7, состоящего из ВМР-7, спейсера и коллагенсвязывающего домена Collbd (SPARC(w)).

Для получения штамма Е.coli - продуцента рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 - клетки штамма Е.coli M15 [pREP4] (Nals, Strs, rifs, lac^-, ara^-, gal^-, mtl^-, F^-, recA⁺, uvr⁺) трансформировали плазмидой pCollbd-BMP-7. Трансформированные клетки выращивали в 500 мл среды LB при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, индуцировали 150 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 8 часов.

Для контроля продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 клетками штамма Е.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] применяли метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Разделение белков проводили в 12%-ном полиакриламидном геле в стандартной системе буферов (электродный буфер: 25 мМ Трис-HCl, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, рН 8,3; буфер для геля: 375 мМ Трис-HCl, рН 8,8). По окончании электрофореза гели окрашивали 0,15% раствором Кумасси G250 в 25% изопропаноле и 10% уксусной кислоте и отмывали в 10% уксусной кислоте. При сравнении спектра белков у штаммов Е.coli M15 [pREP4] и Е.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] обнаруживали появление дополнительной белковой полосы с молекулярной массой 18,8 кДа, что соответствует молекулярной массе рекомбинантного белка Collbd-BMP-7.

Уровень синтеза белка Collbd-BMP-7 определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы.

Согласно полученным данным клетки штамма Е.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7] синтезируют около 10% Collbd-BMP-7 от общего белка клеток.

Пример 3. Способ получения препарата белка Collbd-BMP-7, иммобилизированного на коллагенсодержащем сорбенте.

Клетки Е.coli M15 [pREP4], трансформированные плазмидой pCollbd-BMP-7, выращивали в 3,5 мл среды LB с ампициллином и канамицином при 37°C до оптической плотности, соответствующей 1 ед. поглощения при длине волны 600 нм, добавляли 3 мкл 0,1 М раствора изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и выращивали в течение 4 ч. Культуру разводили до оптической плотности 0,7 при 530 нм, отбирали 400 мкл суспензии, осаждали клетки центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин. Клетки ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-цитратного буфера (ФЦБ, 50 мМ, рН 6.0), разрушали ультразвуком, клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 16000 об/мин в течение 10 мин.

К 100 мкл 50% суспензии желатин-сефарозы добавляли 2 мл буферного раствора, содержащего 30 мМ Трис, рН 8,0, и 0,15 М хлорида натрия, а также лизат клеток в 7 М растворе гуанидинхлорида. Инкубировали при +4°C в течение 2 ч, затем оставляли на 16 ч при той же температуре. Центрифугировали полученную суспензию в течение 5 мин при 5000 об/мин. Осадок сорбента со связавшимся белком трижды отмывали буферным раствором, содержащим 30 мМ Трис, рН 8,0, и 0,15 М хлорида натрия.

Элюцию белка проводили буферным раствором, содержащим 6 М мочевины, 30 мМ Трис, рН 8,0 и 10 мМ ЭДТА. Анализ результатов связывания и элюции белка Collbd-BMP-7 проводили методом электрофореза по Лэммли в 12% ПААГ в денатурирующих условиях.

По результатам электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН концентрация белка составляла 20 мг на 1 мл сорбента.

Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине. Описан рекомбинантный белок Collbd-BMP-7, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd (SPARC(w)), из внеклеточного кальцийзависимого белка SPARC (ВМ-40 или остеонектина) человека и спейсерной последовательности GGS. Предложен способ его получения, включающий выращивание штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7]. Представлены соответствующий штамм и плазмида. Изобретение позволяет обеспечить высокий уровень продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 и одновременно простую и эффективную схему очистки этого белка с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов и покрытий. 4 н.п. ф-лы, 1 ил.

1. Рекомбинантный белок Collbd-BMP-7, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd из внеклеточного кальций зависимого белка SPARC человека с последовательностью SEQ ID NO: 2, спейсера из остатков глицина и серина с последовательностью SEQ ID NO: 3 и костного морфогенетического белка ВМР-7 с последовательностью SEQ ID NO: 4, обладающий биологическими свойствами белка BMP-7 и способностью самопроизвольно связываться с коллагенсодержащим сорбентом.

2. Рекомбинантная плазмида pCollbd-BMP-7 с последовательностью SEQ ID NO: 1, обеспечивающая экспрессию рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 по п.1, содержащая
искусственный бактериальный оперон химерных белков, включающий промоторную область раннего промотора бактериофага Т5, обеспечивающий эффективную транскрипцию контролируемой мРНК;
рекомбинантный ген, обеспечивающий экспрессию целевого химерного белка по п.1;
нетранслируемую область терминации транскрипции бактериального оперона, обеспечивающую эффективное окончание транскрипции;
бактериальный оперон bla, кодирующий белок бета-лактамазу, являющуюся селективным маркером для отбора клонов-трансформантов Е.coli методом контрселекции;
бактериальный участок инициации репликации типа ColEl, обеспечивающий репликацию плазмиды в штаммах E.coli.

3. Штамм Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7], полученный трансформацией штамма Escherichia coli M15/pREP4 плазмидой pCollbd-BMP-7 по п.2, - продуцент рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 по п.1.

4. Способ получения рекомбинантного белка Collbd-BMP-7 по п.1, включающий выращивание клеток штамма Escherichia coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-7], индукцию синтеза белка Collbd-BMP-7 по п.1, разрушение клеток, получение супернатанта, содержащего белок, иммобилизацию белка путем добавления к супернатанту суспензии коллагенсодержащего сорбента, инкубирование, отмывание сорбента со связавшимся белком, последующую элюцию белка с сорбента и диализ.