Способ получения средства для регенерации кости, содержащего рекомбинантный белок ВМР-2, и его применение Российский патент 2022 года по МПК A61K35/32 C12N15/12 

Изобретение относится к биотехнологии. В частности, к рекомбинантному фактору роста кости 2 (ВМР-2), полученному с помощью микробиологического синтеза в Escherichia coli и имеющему дополнительный белковый домен - «s-tag» способствующий повышению активности и растворимости ВМР-2. Дополнительный белковый домен «s-tag» является 15-звенным олигопептидом из рибонуклеазы А поджелудочный железы млекопитающего, например, быка. Также изобретение относится к средству, содержащему иммобилизованный на носитель ВМР-2, и к способу получения такого средства, а также к его применению.

Технический результат состоит в обеспечении стабильных параметров и высоких контролируемых остеоиндуктивных свойств, независящих от изменений условий хранения, а также удобной для использования и хранения физической формы средства.

Уровень техники

В медицине широко используется введение терапевтических белков, полученных в микробиологических системах экспрессии, в частности, Е. coli. В частности, использование прокариотической клетки-хозяина, такой, как предпочтительно Е. coli для получения ВМР-2 раскрыто в RU 2227743 С2 от 27.04.2004. Однако указанный документ не раскрывает получение рекомбинантного ВМР-2, содержащего дополнительный белковый домен - «s-tag». Таким образом, не раскрывает преимущества использования такого ВМР-2. Напротив, известное изобретение направлено на получение полипептидов с повышенной гепаринсвязывающей активностью, а не ВМР-2, обладающего повышенной стабильностью и высокими контролируемыми остеоиндуктивными свойствами, независящими от изменений условий хранения, в удобной для использования и хранения физической форме. Наличие дополнительного домена «s-tag» позволяет получить ВМР-2 с повышенной активностью и растворимостью, что приводит к снижению эффективной концентрации фактора роста, обуславливающий остеогенные свойства. Таким образом достигается прологированный остеоиндуктивный эффект полученного средства с иммобилизованным ВМР-2, продолжающийся не менее двух недель после имплантации за счет выхода ВМР-2 с носителя. К условиям хранения такого материала предъявляют жесткие требования, поскольку при изменении влажности и температуры в значительной степени снижается содержание активного ВМР-2. и соответственно изменяются остеоиндуктивные свойства материала. Снижение концентрации активного ВМР-2 значительно понижает ос геоиндуктивный потенциал получаемого материала вплоть до его полной потери.

Таким образом, настоящее изобретение решает указанную проблему за счет наличия у ВМР-2 дополнительного белкового домена «s-tag» приводящего к повышению удельной активности, стабильности конформации и растворимости фактора роста, а также оптимальной кинетике выхода используемого ВМР-2 с носителя.

Однако данный документ может быть рассмотрен как аналог заявленного изобретения.

Еще одним аналогом изобретения является RU 2408727 С1 от 10.01.2011. В данном источнике раскрыто получение, включающее выращивание штамма E.coli M15 [pREP4, pCollbd-BMP-2]. Представлены соответствующий штамм и плазмида. рекомбинантный белок Collbd-BMP-2, состоящий из коллагенсвязывающего домена Collbd (SPARC(w)), из внеклеточного кальций-зависимого белка SPARC (ВМ-40 или остеонектина) человека и спейсерной последовательности GGS. Изобретение позволяет обеспечить высокий уровень продукции рекомбинантного белка Collbd-BMP-2 и одновременно простую и эффективную схему очистки этого белка с иммобилизацией его на коллагенсодержащем сорбенте. Настоящее изобретение, как было указано выше, обладает другими эффектами и свойствами, обусловленные иным составом рекомбинантного белка. Однако решение по RU 2408727, также, как и настоящее изобретение, относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для получения рекомбинантного белка, иммобилизованного на носителе, входящем в состав нового поколения изделий и материалов медицинского назначения - имплантатов, покрытий и др. В отличии от известного решения представленное изобретение может быть иммобилизовано не только на коллагенсодержащем сорбенте, но и на носителе, представляющим собой минеральный костный матрикс, полученные из костей крупного рогатого скота, а также содержит дополнительный домен «s-tag». приводящий к повышению удельной активности ВМР-2 и его растворимости. Суммируя вышесказанное, данное решение может быть принято в качестве аналога.

В патенте РФ №2456003 С1 раскрыт способ получения материала деминерализованного костного матрикса в виде крошки. Материал включает измельченную, обработанную и отмытую кость, которая фракционирована до размера крошки 0,5-2,0 мм и содержит костный морфогенетический белок ВМР-2, ВМР-7 в количестве 250-350 нг/г продукта. Существенной проблемой данного способа является наличие, помимо ВМР-2 и ВМР-7, большого количества других неколлагеновых белков, что увеличивает потенциальную иммуногенность материала на его основе, что может приводить к нежелательному воспалению и инкапсулированию имплантата.

Таким образом, существует необходимость в получении материала, который будет лишен указанных выше недостатков, а именно материала, обладающего высокой биологической активностью, имеющего стабильные свойства, в меньшей степени зависящие от условий хранения, безопасного в применении, содержащего необходимые для высокой остеоиндукции количества костного морфогенетического белка, при этом белок должен обладать определенными неизменными стандартными параметрами с обеспечением контроля качества, а материал должен иметь удобную для применения в указанных областях медицины форму и низкую иммуногенность.

Раскрытие изобретения

Настоящая заявка относится к группе изобретений, представляющей собой:

П.1 Способ получения рекомбинантного ВМР-2:

- получают плазмиду pET-s-tag-BMP-2, встраивая в плазмиду рЕТ фрагмент ДНК, кодирующий ВМР-2 и s-tag:

- клетки Е. coli трансформируют плазмидой pET-s-tag-BMP-2;

- культивируют полученный штамм:

- проводят разрушение клеток штамма в стандартных условиях;

- осуществляют центрифугирование разрушенных клеток;

- отмывают тельца включения буфером;

- осуществляют осаждение телец включения центрифугированием;

- тельца включения растворяют в 5-кратном объеме раствора 8 М мочевины в буфере 10-100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50-100 мМ NaCl, 10 мМ имидазола;

- нерастворимые компоненты удаляют центрифугированием;

- осуществляют хроматографию на колонке с сорбентом WorkBeads 40 Ni (Bio-Works», Швеция);

- фракции, содержащие белок, денатурируют;

- в течение 5-10 дней проводят рефолдинг белка разведением денатурированных фракций до конечной концентрации целевого белка 0,1-0,5 мг/мл буфером: 10-100 мМ Трис-HCl, рН 8.0. 1-3% CHES, 2М NaCl, 10 мМ глутатиона восстановленного. 1 мМ глутатиона окисленного;

- полученный белок подвергают тангенциальной фильтрации для концентрирования и смены буфера в 10-100 мМ Трис-HCl, рН 6,8, содержащем 4-6 М мочевины;

- осуществляют хроматографию на колонке с гепарин-сефарозой Heparin Sepharose CL-6B ("Amersham Pharmacia Biotech", Швеция);

- осуществляют анализ полученной фракции белка электрофорезом, концентрацию белка определяют спектрофотометрически;

- очищенный белок диализуют против 10 мМ Na-фосфатного буфера, рН 4,5-5,5;

- диализованный раствор белка фильтруют в стерильные флаконы через фильтр 0.20 мкм.

П.2 Способ получения средства для регенерации кости, представляющего собой минеральный костный матрикс или деминерализованный костный матрикс с иммобилизованным на нем рекомбинантным белком ВМР-2:

- осуществляют способ по пп. 1;

- рекомбинантный белок ВМР-2, полученный способом по пп. 1 иммобилизуют на костном материале.

П.3 Способ по п. 2. где носитель ВМР-2 получают путем распиливания костей крупного рогатого скота, очистки, обезжиривания, формирования форм-фактора конечного материала, окисления материала и отмывки, доведения до нужного рН, лиофилизации конечного материала.

П.4 Способ по п. З. где распил костей, в том числе, замороженных при температуре от -5 до -60°С, осуществляют на пластины толщиной от 5 до 20 мм или палочки, толщиной от 5 до 20 мм неограниченной длины; отмывку осуществляют с использованием детергента при перемешивании, взбалтывании, нагреве;

П.5 Способ по п. 4, где дополнительно осуществляют сушку при температуре от 40 до 100°С, предпочтительно 55°С, размол в крошку с размерами частиц от 0,12 до 4 мм. обработку крошки окисляющим агентом, например, хлорноватистым натрием, в соотношении агент/ вода от 1:9 до 1:1, осуществляют отмывку крошки водой, в том числе, проточной, прокаливание крошки при температуре от 500 до 1000°С в течение от 1 до 10 часов, промывку прокаленной крошки от пыли с контролем и. при необходимости, корректировкой рН с помощью 5-100 мМ раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного или 5-100 мМ раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного, сушку крошки при температуре от 40 до 100°С, предпочтительно 55°С, фракционирование крошки с помощью грохота с амплитудой от 0,2 до 2 мм в течении от 10 до 90 минут на фракции от 0,12 мм до 4 мм.

П.6 Способ по пп. 3-5, где после иммобилизации рекомбинантного ВМР-2, осуществляют лиофилизацию и стерилизацию.

П.7 Способ по пп. 2, 6, где иммобилизацию осуществляют инкубированием костного материала с раствором, содержащим очищенный s-tag ВМР2 в 10 мМ Na-фосфатного буфера, при рН 4.5-5.5. в течение 3 часов, после чего проводят трехкратную отмывку тем же буфером и лиофилизацию.

П.8 Средство для регенерации кости, полученное способом по п. 2, включающее носитель с иммобилизованным на нем рекомбинантным белком ВМР-2.

П.9 Средство по п. 8, где носитель представляет собой минеральный костный матрикс или деминерализованный костный матрикс.

П.10 Средство по пп. 7-8. где средство выполнено в виде гранул, блоков или мембран.

П.11 Средство по п. 9, отличающееся тем, что частицы имеющие форму гранул, имеют наибольший линейный размер от 0,12 до 4 мм и массу от 0.25 до 5 г; частицы, выполненные в форме блоков, представляют собой пористый параллелепипед с размерами в мм: 10×10×10, 10×10×20, 10×20×20 или 35×10×5; частицы, имеющие форму пластинчатых мембран, обладают толщиной от 0.5 до 1 мм и площадью 15×20 мм. 20×30 мм или 30×40 мм.

П.12 Применение средства по пп. 8-11 в качестве остеопластического материала для восполнения анатомической целостности костной ткани.

Группа изобретений направлена на решение задачи расширения арсенала средств для челюстно-лицевой хирургии, травматологии и ортопедии для восстановления анатомической целостности и функциональности сегментов опорно-двигательного и костного аппарата.

Технический результат заявленного изобретения представляет собой обеспечение стабильных параметров и высоких контролируемых остеоиндуктивных свойств, не зависящих от изменений условий хранения, возможность получения средства в удобной для использования и хранения физической форме. При этом осуществляется повышение растворимости ВМР-2 и формирование нативной конформации, за счет наличия дополнительного белкового домена «s-tag» и оптимизации условий очистки и рефолдинга. Особенности иммобилизации белка на носителе обеспечивают пролонгированный биологический эффект и повышение остеоиндуктивности в зоне регенерации костной ткани, что в свою очередь позволяет: сократить продолжительность лечения в днях, увеличить объем образованной костной ткани, повысить прогнозируемость достижения клинического результата лечения, такого как восстановление костного дефекта. Кроме того, достигается стабилизация конформации, уточненная на основании оценки с применением метода электрофореза в 12% ПААГ в неденатурирующих условиях, высокая удельная биологическая активность (на основании результатов метода in vitro для количественной оценки способности вызывать дифференциацию клеток линии С2С12, сопровождающуюся синтезом щелочной фосфатазы), а также постепенный выход определенного количества белка с носителя на протяжении срока не менее двух недель после имплантации, по методу количественного определения белка с помощью ИФА.

Технический результат достигается за счет конструирования рекомбинантного ВМР-2. содержащего «s-tag» - 15-звенный олигопептид из рибонуклеазы А поджелудочный железы млекопитающего, например, быка. Было установлено, что конечные свойства композиции, включающей минеральный костный матрикс, либо деминерализованный костный матрикс и белок ВМР-2, в значительной мере повышаются, а именно повышается активность ВМР-2 и его растворимость, за счет введения в состав конструкции белка дополнительного домена «s-tag».

Фигуры:

Фиг. 1. Электрофореграмма результатов анализа образцов рекомбинантного белка s-tag-BMP-2. (1-2) - чистые димерные формы ВМР-2; (М) - маркер молекулярной массы 14-97 кДа фирмы BIO-RAD (США).

Фиг. 2. Удельная активность щелочной фосфатазы (единицы активности/мкг белка) в клетках линии С2С12 при добавлении различных препаратов ВМР-2: s-tag-BMP-2; коммерческий препарат ВМР-2 (R&D Systems, США). * - достоверное отличие по сравнению с коммерческим препаратом (р<0,01). Точками обозначены средние значения, квадратами - стандартные ошибки среднего, планками погрешностей - стандартное отклонение.

Фиг. 3. Результаты исследования кумулятивной кинетики выхода s-tag-BMP-2 с минерального носителя.

Фиг. 4. Результаты гистологического и томографического анализа образцов после имплантации в бедренную мышцу мышей материалов на основе деминерализованного костного матрикса (ДКМ) с добавлением ВМР-2 с дополнительными белковыми доменами. Гистологический анализ проводили с использованием окраски гематоксилин/эозином.

Фиг. 5. Результаты томографического анализа образцов после имплантации в бедренную мышцу мышей материалов на основе деминерализованного костного матрикса (ДКМ) с добавлением ВМР-2. На графике приведены количественные результаты томографического анализа: относительный объем костной ткани (BV/TV). количество трабекул (Tb.N), толщина трабекул (Tb.Th), плотность костной ткани (BMD). Звездочкой обозначены отличия при сравнении с контрольной группой (р<0,05).

Фиг. 6. а) Исходное состояние бокового отдела верхней челюсти у светлогорской мини-свиньи через 2 месяца после удаления зубов; б) формирование костного дефекта 40×20×10 мм без апроксимальных опорных стенок; в) извлеченный участок кости, г) заполнение дефекта увлажненным кровью минеральным матриксом с s-tag-BMP-2; д-е) формирование новообразованной костной ткани на месте дефекта через 4 месяца после операции.

Фиг. 7. Результаты гистологического анализа зоны дефекта через 4 месяца после операции, а) Фрагмент альвеолярного гребня челюсти, ×5 раз; б) участок имлантированного материала, окруженный новообразованной костной тканью, ×100 раз; в) зона контакта новообразованной костной ткани с соединительной тканью регенеративного типа, ×200 раз. М - имплантируемый материал, МК - материнская кость, К - новообразованная костная ткань, С - соединительная ткань, О - остеобласты. Гистологический анализ проводили с использованием окраски методом тройного окрашивания - небесный трихром.

Примеры

Пример 1

Получение носителя

Распилили и очистили исходный материал - кости крупного рогатого скота, провели обезжиривание материала, формирование форм-фактора конечного материала, осуществили окисление материала и отмывку, прокаливание и доведение рН, осуществили сушку и фракционирование конечного материала. Распил костей, замороженных при температуре от -5 до -60°С, производили на пластины, толщиной от 5 до 20 мм или палочки, толщиной от 5 до 20 мм неограниченной длины. Отмывку осуществляли с использованием детергента при перемешивании, взбалтывании, нагреве. Сушку осуществляли при температуре предпочтительно 55°С. Также в еще одном варианте осуществления сушку осуществляли при температуре 40°С, а также в еще одном варианте при 100°С. Таким образом, при воспроизведении изобретения сушка может быть осуществлена при температуре от 40 до 100°С. Далее провели размол в крошку с размерами частиц от 0,12 до 4 мм. Обработали крошку окисляющим агентом, хлорноватистым натрием в соотношении агент/ вода 1:9. Также крошку в еще одном варианте осуществления соотношение агент/вода было 1:1. Таким образом, при воспроизведении изобретения соотношение агент/вода может быть от 1:9 до 1:1. Отмывку крошки осуществляли проточной водой, прокаливание крошки осуществляли при температуре 500°С в течение от 1 до 10 часов. В еще одном варианте прокаливание крошки осуществляли при температуре 1000°С. Таким образом, при воспроизведении изобретения прокаливание крошки может быть осуществлено при температуре от 500 до 1000°С. Далее осуществляли промывку прокаленной крошки от пыли, контроль и корректировку рН путем добавления 5 мМ раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного. Также корректировку рН в еще одном варианте осуществляли путем добавления 100 мМ раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного. Таким образом, при воспроизведении изобретения концентрация натрия фосфорнокислого однозамещенного может быть от 5 до 100 мМ. При необходимости поднять рН. корректировку рН производили путем добавления 5 мМ раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного. Также корректировку рН в еще одном варианте осуществляли путем добавления 100 мМ раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного. Таким образом, при воспроизведении изобретения концентрация натрия фосфорнокислого двузамещенного может быть от 5 до 100 мМ. Сушку крошки осуществляли при температуре 55°С. Также в еще одном варианте осуществления сушку осуществляли при температуре 40°С, а также в еще одном варианте при 100°С. Таким образом, при воспроизведении изобретения сушка может быть осуществлена при температуре от 40 до 100°С. Затем осуществили фракционирование крошки с помощью грохота с амплитудой от 0,2 до 2 мм в течение 10 минут на фракции от 0,12 мм до 4 мм. В еще одном варианте осуществления фракционирование крошки осуществили с помощью грохота с амплитудой от 0,2 до 2 мм в течение 90 минут на фракции от 0,12 мм до 4 мм. Таким образом, при воссоздании изобретения фракционирование может быть осуществлено с помощью грохота с амплитудой от 0,2 до 2 мм в течение от 10 до 90 минут на фракции от 0,12 мм до 4 мм.

Пример 2

Получение штамма Е. coli - продуцента рекомбинантного s-tag-BMP2

В работе использовали бактериальный штамм Е. coli BL21 (DE3) (Е. coli В F^- dcm ompT hsdS(rB^- mB^-) gal λ(DE3) («Agilent Technologies», США) и плазмидный pET30a(+) («Novagen», США). Осуществили получение генно-инженерной конструкции, кодирующей s-tag-ВМР-2. Фрагмент ДНК, кодирующий ВМР-2, получали с помощью ПЦР с праймерами BMP-2F 5'-AATAATGGATCCCAAGCCAAACACAAACAGCGGAAACG-3' и BMP-2R 5'-TAATAAAGATCTTAGCGACACCCACAACCCTCCACAA-3', используя в качестве матрицы геномную ДНК человека («Promega», США), гидролизовали эндонуклеазами рестрикции BamHI и BglII и клонировали в экспрессионный вектор рЕТ-30а(+) по сайту BamHI. Ориентацию вставки определяли рестрикционным картированием. Выделение плазмидной ДНК, гидролиз ДНК, лигирование, электрофорез в агарозном геле и другие стандартные процедуры выполняли согласно общепринятым методам. Культуры трансформированных клеток Е. coli выращивали в среде LB с добавлением соответствующих антибиотиков на качалке при 180 об/мин и 37°С до достижения ОП₆₀₀ 1,0-1,2. Синтез белка индуцировали 0,5 мМ ИПТГ, далее культуры выращивали еще 4 ч в тех же условиях и центрифугировали в течение 30 мин при 5000 g и 10°С. Биомассу хранили при -20°С. При сравнении спектра белков, синтезированных клетками штамма Е. coli BL21 [pET-s-tag-BMP-2], с белками нетрансформированного штамма, с помощью электрофореза обнаруживали появление дополнительной белковой полосы. Молекулярная масса дополнительной полосы соответствовала ожидаемой для рекомбинантного белка s-tag-BMP2 массе - 18.3 кДа. Уровень синтеза белков в Е. coli определяли, сравнивая интенсивность окрашивания полосы рекомбинантного белка с полосой соответствующего белка - стандарта молекулярной массы. Было показано, что рекомбинантный белок s-tag-ВМР2 синтезируется в клетках Е. coli в нерастворимой форме в виде телец-включения. Уровень синтеза целевого белка составлял 30% от суммарного белка бактериальной клетки.

Пример 3

Получение рекомбинантного ВМР-2

Получение телец включения

Разрушение клеток штамма продуцента проводили в стандартных условиях 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,25 М NaCl 0,5% на френч-прессе. Центрифугирование телец включения (ТВ) проводили при 10000 об/мин, 30 мин, 10°С. Отмывку телец включения проводили в лидирующем буфере (3 раза), осаждая центрифугированием в том же режиме.

Тельца включения растворяли в 5-кратном объеме раствора 8 М мочевины в буфере 10-100 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 50-100 мМ NaCl, 10 мМ имидазола. Содержание целевого белка в промытых ТВ составляло порядка 80%. Нерастворимые компоненты удаляли центрифугированием при 10000 об/мин, 30 мин, 20°С.

Очистка на металл-хелатном сорбенте WorkBeads 40 Ni-NTA

Хроматографию на колонке с сорбентом WorkBeads 40 Ni-NTA проводили в буфере 10-100 мМ Трис-HCl, рН 8.0. 50-100 мМ NaCl, 10 мМ имидазола, содержащем 6-8 М мочевины. Фракции, содержащие белок, денатурировали в буфере 6 М гуанидин хлорид, 10-100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, с 50-100 мМ дитиотреитола (ДТТ). Рефолдинг рекомбинантного белка. Рефолдинг белка проводили разведением денатурированных фракций до конечной концентрации целевого белка 0,1-0,5 мг/мл буфером: 10-100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1-3% CHES, 2 М NaCl, 10 мМ глутатиона восстановленного, 1 мМ глутатиона окисленного. Длительность рефолдинга составляет от 5-10 дней. Далее белок подвергали тангенциальной фильтрации для концентрирования и смены буфера в 10-100 мМ Трис-HCl, рН 6.8, содержащем 4-6 М мочевины.

Очистка на аффинном сорбенте гепарин-сефарозе

Хроматографию на колонке с гепарин-сефарозой, проводили в буфере 10-100 мМ Трис-HCl, рН 6,8, содержащем 4-6 М мочевины. Элюцию целевого белка проводили градиентом NaCl от 0 до 1 М в 10-100 мМ Трис-HCl, рН 6,8, содержащем 4-6 М мочевины. Полученные фракции белка анализировали методом электрофореза в 12%-ном ПААГ-ДСН по Лэммли. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически по методу Бредфорда. Очищенный белок диализовали против буфера 10 мМ Na-фосфатного буфера, рН 4,5-5,5. Диализованный раствор белка фильтровали в стерильные флаконы через фильтр 0.20 мкм.

Пример 4

Получение средства, содержащего рекомбинантный ВМР-2

Подготовленный минеральный костный матрикс инкубировали с раствором, содержащим очищенный s-lag-BMP2 в 10 мМ Na-фосфатного буфера, рН 4,5-5,5, в течение 3 часов, после чего проводили трехкратную отмывку тем же буфером и лиофилизацию. Содержание s-tag-BMP2 составляло 80 мкг на 1 г минерального костного матрикса. Стерилизацию проводили радиационным способом (значение поглощенной дозы 15±5 кГр).

Пример 5

Получение средства, содержащего рекомбинантный ВМР-2

Подготовленный деминерализованный костный матрикс (ДКМ) инкубировали с раствором, содержащим очищенный s-tag-BMP2 в 10 мМ Na-фосфатного буфера, рН 4,5-5,5, в течение 3 часов, после чего проводили трехкратную отмывку тем же буфером и лиофилизацию. Содержание s-tag-BMP2 составляло 80 мкг на 1 г ДКМ. Стерилизацию проводили радиационным способом (значение поглощенной дозы 15±5 кГр).

Пример 6

Исследование стабильности конформации димеров ВМР-2

Исследование стабильности конформации димеров ВМР-2 проводили с применением метода электрофореза в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) в невосстанавливающих условиях. Стабильность конформации димерной формы ВМР-2 определяли по положению и форме полосы. В случае анализа белка, получаемого по предложенному методу, наблюдают одну тонкую полосу на уровне 36,6 кДа (в случае s-tag-BMP-2) (фиг. 1, треки 1-2). В случае аналогов рекомбинантных ВМР-2 можно наблюдать наличие мономеров (14-18 кДа), а также олигомерных форм, например в статье Sharapova, N.E., Kotnova, А.P., Galushkina. Z.M., et al. Production of the recombinant human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli and testing of its biological activity in vitro and in vivo. Mol. Biol. (Moscow). - 2010. - Vol. 44. - P. 1036-1044.

Кроме того, существенное размытие полосы свидетельствует о нестабильности конформации и наличии альтернативных форм помимо нативной.

Пример 7

Биологическая удельная активность полученных препаратов

Биологическая удельная активность полученных препаратов проверялась in vitro по способности вызывать дифференциацию специфических клеток С2С12, сопровождающуюся синтезом щелочной фосфатазы согласно методике Katagiri Т., Yamaguchi A., Komaki М. Abe Е., et al. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage. J. Cell Biol. - 1994. - Vol. 127(6 Pt 1). - P. 1755-66. Клетки мышей линии C2C12 (мышь С3Н, мышца конечности) полученные из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), засевали в концентрации 104 клеток на лунку в 48-луночном планшете и культивировали с использованием среды DMEMF12, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, при 37°С во влажной камере с 5% СО₂ в воздухе в течение 24 часов. Затем клетки в течение трех суток инкубировали в 400 мл среды DMEMF12, содержащей 0,5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и рекомбинантный белок ВМР-2 в концентрациях 1 мкг/мл, 10 мкг/мл и 100 мкг/мл. Затем клетки отмывали буферным раствором (100 мМ Na₂HPO₄ - NaH₂PO₄ рН 7,4) и разрушали их с помощью добавления 0,1% раствора Тритон-Х-100 на 100 mM Na-фосфатном буферном растворе и трехкратной процедуры замораживания-оттаивания для разрушения клеточных мембран. Активность щелочной фосфатазы определяли по общепринятой методике с использованием п-нитрофенилфосфата в качестве субстрата. В качестве положительного контроля использовали коммерческий препарат белка ВМР-2 человека (R&D Systems, США). Специфическую удельную активность ВМР-2 in vitro выражали в количестве единиц активности щелочной фосфатазы на 1 мкг белка. Полученная удельная биологическая активность белка s-tag-BMP-2 составляла 0,126±0,013 ед./мкг (фиг. 2), при этом превосходя значение, полученное для коммерческого препарата сравнения (0,101±0,006 ед./мкг), а также значения, приведенные у схожих препаратов в литературе, например, Karyagina. A.S., Boksha, I.S., Grunina. Т., М., et al. Optimization of rhBMP-2 active form production in a heterologous expression system using microbiological and molecular genetic approaches. Mol. Genet. Microbiol. Virol. - 2016. - Vol. 31. - P. 208-213.

Пример 8

Изучение кинетики высвооожбения ВМР-2

Для изучения кинетики высвобождения ВМР-2 из носителей брали навески материала с иммобилизованным ВМР-2 массой 0,1 г и помещали в полипропиленовые пробирки с крышками. В каждую пробирку добавляли 1 мл инкубационного буфера, содержащего 25 мМ фосфата натрия (рН 7,4), 1% BSA и 0,02% азида натрия. Пробирки инкубировали при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 300 об/мин. Весь объем образца удаляли через 0, 3, 10 часов и 1, 2, 3, 4, 7, 8, 14, 21, 28 и 35 суток и заменяли каждый раз 1 мл инкубационного буфера. Собранные образцы замораживали при -80°С. В конце эксперимента концентрации ВМР-2 измеряли с помощью с помощью ранее коммерческих наборов ИФА (R&D Systems, США). Полученные результаты исследования кинетики выхода s-tag-BMP-2 с минерального носителя приведены на фиг. 3. При этом наблюдается продолжающийся выход белка на сроке до 35 суток, что свидетельствует о пролонгированной биологической активности материала. При сравнении с аналогами, например, в работе Xie G., Sun J., Zhong G., Liu C., Wei J. Hydroxyapatite nanoparticles as a controlled-release carrier of BMP-2: absorption and release kinetics in vitro. J. Mater. Sci. Mater. Med. - 2010. - Vol. 21(6). - P. 1875-1880, наблюдался выход высвобожденного кумулятивного количества ВМР-2 на плато с минерального материала (наночастицы гидроксиапатита) на 13 сутки после начала исследования.

Пример 9

Исследование эффективности применения материала на основе ДКМ с добавлением s-tag-BMP-2

Исследование эффективности применения материала на основе ДКМ с добавлением ВМР-2 с дополнительным белковым доменом «s-tag» исследована на модели эктопического остеогенеза при имплантации мышам в бедренную мышцу на двух сроках после операции: 1 неделя (группа 1) и 4 недели (группа 2). Исследование проводилась на 24 самцах аутбредных мышей линии ICR (CD-1) возраста 38-47 дней. Животных делили на 4 группы по 6 мышей в каждой. В качестве контрольной группы использовали имплантаты на основе ДКМ без ВМР-2 (группа 3: 1 неделя; группа 4: 4 недели). Перед проведением всех хирургических процедур животных выдерживали в течение 24 часов на голодной диете для облегчения перенесения наркоза. Для введения животных в общий наркоз использовали смесь анестетиков «Золетил 100» (Virbac С.А., Франция) в дозировке 15 мг/кг веса и «Рометар» (Bioveta, Чехия) в дозировке 6 мг/кг веса. Все хирургические процедуры проводили в ламинарном боксе Lamsystems с соблюдением правил асептики и антисептики. Хирургическое поле освобождали от шерсти, обрабатывали антисептиком «Велтосепт-2» (ООО «НПО «ВЕЛТ», Россия). Мышей фиксировали на хирургическом столике для лабораторных животных (Medax, Германия), оборудованном нагревательным элементом для обеспечения поддержания постоянной температуры тела во время операции. После введения животных в наркоз имплантаты, представляющие собой блоки ДКМ размером 1×1×4 мм, вставляли в бедренную мышцу обеих задних лап животного. После этого раны послойно ушивали атравматической нитью Викрил 4/0 (ETHICON, Бельгия). По окончании операционного вмешательства для предупреждения развития бактериальной инфекции шов обрабатывали антибиотиком широкого спектра действия «Террамицин» (Pfizer Animal Health, США), после чего животных помещали в камеру реабилитации до полного выхода из наркоза и восстановления подвижности. Эвтаназию, и гистологический анализ проводили через 1 и 4 недели после операции (фиг. 4). Наличие ВМР-2 с дополнительным белковым доменом «s-tag» в составе материала приводило к формированию новообразованной костной ткани, прилегающей к поверхности имплантатов из ДКМ. Помимо формирования обширных очагов роста внутри и вокруг имплантата, наблюдалось формирование костной капсулы, значительно превышающей размеры имплантата. Область внутри капсулы была заполнена трабекулами новообразованной костной ткани и зрелым костным мозгом. По результатам гистоморфометрического анализа площадь новообразованной костной ткани составляла 15,7±2,9 мм² (37,6±8,1%). На сроке 1 неделя после имплантации вокруг имплантата в будущей области костной капсулы наблюдались обширные зоны хондрогенеза с многочисленными остеопрогениторными клетками. Микрокомпьютерную томографию имплантатов с прилегающими тканями проводили после эвтаназии, на микрокомпьютерном томографе Skyscan 1172 (Bruker, США) (фиг. 4-5). Результаты количественного анализа полученных томограмм по ряду параметров (относительный объем костной ткани (BV/TV). количество трабекул (Tb.N), толщина трабекул (Tb.Th). плотность костной ткани (BMD)) согласуются с результатами гистологического анализа. При использовании в схожей ситуации препарата-аналога, описанного в работе Lee С.Н., Jin M.U., Jung Н.М., Lee J.T., Kwon T.G. Effect of dual treatment with SDF-1 and BMP-2 on ectopic and orthotopic bone formation. PLoS One. - 2015. - Vol. 10(3). - e0120051, к 4 неделе наблюдалось формирование 22,9±9,2% новообразованной костной ткани (13,4±4,1 мм²), не наблюдалось образование костной капсулы, а также обширных областей костного мозга. При этом использовался материал на основе коллагенового носителя с добавлением s-tag-BMP-2.

Пример 10

Исследование эффективности применения материала на основе минерального матрикса с добавлением s-tag-BMP-2

Исследование эффективности применения материала на основе минерального матрикса с добавлением ВМР-2 с дополнительным белковым доменом «s-tag» проведено на модели аугментации критического дефекта кости в боковом отделе верхней челюсти с наружной стороны у мини-свиней Светлогорской породы (3 головы). За 2 месяца до начала эксперимента проводилась экзодентия бокового отдела верхней челюсти с обеих сторон. Перед началом хирургического вмешательства животное вводили в наркоз комбинацией седативных препаратов и миорелаксанта. Во время непосредственно операции производили надрез десны с наружной стороны верхней челюсти, затем стоматологическим бором создавали с обеих сторон критический костный дефект без апроксимальных опорных стенок размером 40 мм длиной, 20 мм шириной, 10 мм глубиной. Далее вводили 3 г материала, представляющего собой минеральный костный матрикс с s-tag-BMP-2 с концентрацией 80 мкг/г. после чего область вмешательства послойно ушивали рассасывающимся шовным материалом (Фиг. 6 а-г). 4 месяца спустя животных выводили из эксперимента, проводился забор гистологического материала для исследования области интереса. При этом фрагменты тканей, содержащие сетчатый имплантат, фиксировались в 10% забуференном растворе формалина («Биовитрум», Россия). Затем промывались в проточной воде, в течение 4 часов с последующем обезвоживанием в изопропаноле («Биовитрум». Россия) восходящей концентрации и проходили проводку в полимерной смоле Technovit 9000 согласно инструкции производителя. Срезы из полимерных блоков получали путем распила их на прецизионном станке фирмы BUHLER ISOMET 4000. Толщина первичных срезов составляла 100 мкм. Полученные первичные спилы помещали на предметном стекле и полировали на станке BUHLER ALPHA&BETA/VECTOR до толщины среза в 10-15 мкм с использованием шлифовальных кругов нисходящей зернистости (от 300 до 1200Gr). Полученные шлифы окрашивали методом тройного окрашивания - небесный трихром, согласно публикации Волков А.В., Шустров С.А., Корсаненков К.С. Набиева Е.Х. Новый метод окраски недекальцинированной костной ткани. Клиническая и экспериментальная морфология. - 2016. - №4(20). - С. 55-58. Окрашенные гистологические срезы исследовали на световом микроскопе Axio Lab. A1 (Zeiss, Германия), оснащенного цифровой фотокамерой, с помощью которой осуществляли фотодокументирование.

Через 4 месяца в зоне дефекта у всех животных с обеих сторон челюсти наблюдалось формирование новообразованной костной ткани высокой плотности, по своему объему равной изначальному дефекту (Фиг. 6 д-е). По результатам гистологического анализа фрагмент альвеолярного гребня челюсти представлял в большей степени кортикальной пластинкой и губчатой костной тканью (Фиг. 7). Кортикальная пластинка имела дефект, проникающий сквозь всю ее толщину. Внутри костного дефекта обнаружены гранулы остеопластического материла костной структуры. На поверхности материала выявлены напластования новообразованной костной ткани, которая представлена как ретикулофиброзной, так и пластинчатой костной тканью. На поверхности костного вещества определялись остеобласты, формирующие остеоид. Новообразованная костная ткань плотно прилегала к гранулам остеопластического материала, сливаясь с ними с образованием трабекулярных структур. Между костными балками определялась ретикулярная строма костного мозга, а в поверхностных областях соединительная ткань регенеративного типа. Вне области костного дефекта обнаружено костное вещество пластинчатого строения.

Таким образом, заявленная группа изобретений обладает новизной, изобретательским уровнем, так как сочетание признаков каждого из изобретений группы не известно из уровня техники и неочевидно для специалиста, приводит к достижению неожиданных технических результатов.

Приведенные примеры демонстрируют возможность реализации каждого из изобретений заявленной группы, а также показывают использование в медицине и промышленности.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ получения рекомбинантного человеческого костного морфогенетического белка 2 (bone morphogenetic protein 2, ВМР-2) путем трансформации клеток Е. coli плазмидой pET-s-tag-BMP-2 с последующей хроматографической очисткой белка и получения средства, содержащего такой белок, путем иммобилизации указанного белка на носителе. Носитель представляет собой минеральный костный матрикс или деминерализованный костный матрикс (ДКМ). Изобретение также относится к средству для регенерации кости, включающему носитель с иммобилизованным на нем рекомбинантным белком ВМР-2. Средство выполнено в виде гранул, блоков или мембран. Изобретение также относится к применению указанного средства в качестве остеопластического материала для восполнения анатомической целостности костной ткани. Технический результат заявленного изобретения представляет собой обеспечение стабильных параметров и высоких контролируемых остеоиндуктивных свойств средства, независящих от изменений условий хранения, возможность получения средства в удобной для использования и хранения физической форме. Технический результат осуществляется за счет повышения растворимости и формирования нативной конформации ВМР-2, являющихся следствием присутствия в белке дополнительного белкового домена и оптимизации условий очистки и рефолдинга. Более точно технический результат достигается за счет включения в состав рекомбинантного ВМР-2 дополнительного белкового домена - s-tag - 15-звенного олигопептида из рибонуклеазы А поджелудочный железы млекопитающего, например быка. Было установлено, что конечные свойства композиции, включающей минеральный костный матрикс или деминерализованный костный матрикс и белок ВМР-2, выражающиеся в повышенной остеоиндуктивности и стабильности при хранении, определяются свойствами ВМР-2, а именно повышенной активностью ВМР-2 и его растворимостью, за счет введения в состав конструкции белка дополнительного домена «s-tag». Особенности иммобилизации белка на носителе обеспечивают клинически обоснованную кинетику выхода определенного количества белка с носителя на протяжении двух недель после имплантации. Кроме того, за счет иммобилизации обеспечиваются пролонгированный биологический эффект и повышение остеоиндуктивности в зоне регенерации костной ткани, что в свою очередь позволит сократить продолжительность лечения в днях, увеличить объем образованной костной ткани, повысить прогнозируемость достижения клинического результата лечения, такого как образование костной ткани и восстановление костного дефекта. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 7 ил., 10 пр.

1. Способ получения рекомбинантного ВМР-2, заключающийся в следующем:

- получают плазмиду pET-s-tag-BMP-2, встраивая в плазмиду рЕТ фрагмент ДНК, кодирующий ВМР-2 и s-tag;

- клетки E. coli трансформируют плазмидой pET-s-tag-BMP-2;

- культивируют полученный штамм;

- проводят разрушение клеток штамма в стандартных условиях;

- осуществляют центрифугирование разрушенных клеток;

- отмывают тельца включения буфером;

- осуществляют осаждение телец включения центрифугированием;

- тельца включения растворяют в 5-кратном объеме раствора 8 М мочевины в буфере 10-100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 50-100 мМ NaCl, 10 мМ имидазола:

- нерастворимые компоненты удаляют центрифугированием;

- осуществляют хроматографию на колонке с сорбентом WorkBeads 40 Ni («Bio-Works», Швеция);

- фракции, содержащие белок, денатурируют;

- в течение 5-10 дней проводят рефолдинг белка разведением денатурированных фракций до конечной концентрации целевого белка 0,1-0,5 мг/мл буфером: 10-100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1-3% CHES, 2М NaCl, 10 мМ глутатиона восстановленного, 1 мМ глутатиона окисленного;

- полученный белок подвергают тангенциальной фильтрации для концентрирования и смены буфера в 10-100 мМ Трис-HCl, рН 6,8, содержащем 4-6 М мочевины;

- осуществляют хроматографию на колонке с гепарин-сефарозой Heparin Sepharose CL-6B ("Amersham Pharmacia Biotech", Швеция);

- осуществляют анализ полученной фракции белка электрофорезом, концентрацию белка определяют спектрофотометрически;

- очищенный белок диализуют против 10 мМ Na-фосфатного буфера, рН 4,5-5,5;

- диализованный раствор белка фильтруют в стерильные флаконы через фильтр 0.20 мкм.

2. Способ получения средства для регенерации кости, представляющего собой минеральный костный матрикс или деминерализованный костный матрикс с иммобилизованным на нем рекомбинантным белком ВМР-2, заключающийся в следующем:

- осуществляют способ по п. 1:

- рекомбинантный белок ВМР-2, полученный способом по п. 1, иммобилизуют на костном материале.

3. Способ по п. 2, где носитель ВМР-2 получают путем распиливания костей крупного рогатого скота, очистки, обезжиривания, формирования форм-фактора конечного материала, окисления материала и отмывки, доведения до нужного рН, лиофилизации конечного материала.

4. Способ по п. 3, где распил костей, в том числе замороженных при температуре от -5 до -60°С, осуществляют на пластины толщиной от 5 до 20 мм или палочки толщиной от 5 до 20 мм неограниченной длины; отмывку осуществляют с использованием детергента при перемешивании, взбалтывании, нагреве.

5. Способ по п. 4, где дополнительно осуществляют сушку при температуре от 40 до 100°С, предпочтительно 55°С, размол в крошку с размерами частиц от 0,12 до 4 мм, обработку крошки окисляющим агентом, например хлорноватистым натрием, в соотношении агент/вода от 1:9 до 1:1, осуществляют отмывку крошки водой, в том числе проточной, прокаливание крошки при температуре от 500 до 1000°С в течение от 1 до 10 часов, промывку прокаленной крошки от пыли с контролем и, при необходимости, корректировкой рН с помощью 5-100 мМ раствора натрия фосфорнокислого двузамещенного или 5-100 мМ раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного, сушку крошки при температуре от 40 до 100°С, предпочтительно 55°С, фракционирование крошки с помощью грохота с амплитудой от 0,2 до 2 мм в течение от 10 до 90 минут на фракции от 0,12 до 4 мм.

6. Способ по пп. 3-5, где после иммобилизации рекомбинантного ВМР-2 осуществляют лиофилизацию и стерилизацию.

7. Способ по пп. 2, 6, где иммобилизацию осуществляют инкубированием костного материала с раствором, содержащим очищенный s-tag ВМР-2 в 10 мМ Na-фосфатного буфера, при рН 4,5-5,5, в течение 3 часов, после чего проводят трехкратную отмывку тем же буфером и лиофилизацию.

8. Средство для регенерации кости, полученное способом по п. 2, включающее носитель с иммобилизованным на нем рекомбинантным белком ВМР-2.

9. Средство по п. 8, где носитель представляет собой минеральный костный матрикс или деминерализованный костный матрикс.

10. Средство по пп. 7, 8, где средство выполнено в виде гранул, блоков или мембран.

11. Средство по п. 9, отличающееся тем, что частицы, имеющие форму гранул, имеют наибольший линейный размер от 0,12 до 4 мм и массу от 0,25 до 5 г; частицы, выполненные в форме блоков, представляют собой пористый параллелепипед с размерами в мм: 10×10×10, 10×10×20, 10×20×20 или 35×10×5; частицы, имеющие форму пластинчатых мембран, обладают толщиной от 0,5 до 1 мм и площадью 15×20 мм, 20×30 мм или 30×40 мм.

12. Применение средства по пп. 8-11 в качестве остеопластического материала для восполнения анатомической целостности костной ткани.