ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ПРОДУКЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК В КОСТНОМ МОЗГЕ Российский патент 2011 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в качестве эффективного средства для повышения количества стволовых клеток в организме.

Из уровня техники известны препараты (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, эритропоэтин), стимулирующие пролиферацию стволовых клеток (см. Дыгай A.M., Жданов В.В., Поженько Н.С., Кривопалова Г.Н., Масычева В.И., Пустошилова Н.М., Синичкина С.А., Гольдберг В.Е. Ускорение созревания кроветворных клеток под действием рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора на фоне цитостатической миелосупрессии. Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 2000, т.129, Приложение 1, с.75-79).

Однако данные вещества активируют также процессы дифференцировки и мобилизации стволовых клеток в периферическую кровь, что приводит, в конечном итоге, к снижению содержания регенераторно-компетентных клеток в естественных депо (костный мозг, жировая ткань и др.). При этом, соответственно, ограничиваются возможности глубокого резерва компенсации, участвующего в процессах саногенеза. Кроме того, препараты указанных ростовых факторов сами обладают целым рядом нежелательных побочных эффектов, что существенно лимитирует их клиническое применение.

Изобретение направлено на создание эффективного средства для увеличения содержания регенераторно-компетентных клеток в костном мозге с низкой токсичностью и возможностью длительного применения.

Решение поставленной задачи достигается тем, что лекарственное средство для стимуляции продукции стволовых клеток в костном мозге, согласно изобретению, содержит активированную форму антител к фактору стволовой клетки (анти-ФСК), полученную путем многократного последовательного разведения и внешнего воздействия - многократного вертикального встряхивания каждого полученного разведения по гомеопатической технологии, обусловливающей сверхмалую дозу упомянутых антител.

Полученный в соответствии с изобретением лекарственный препарат, который представляет собой активированную - потенцированную форму антител к фактору стволовой клетки в сверхмалой дозе, позволяет стимулировать продукцию стволовых клеток и, практически, не имеет побочных эффектов, что подтверждено экспериментально.

Лекарственное средство приготовляют следующим образом.

Для получения антител человеческий или гетерологичный фактор стволовой клетки (в том числе рекомбинантный или генно-инженерный) используют в качестве иммуногена для иммунизации лабораторных животных (кроликов). Полученные антитела очищают методом аффинной хроматографии.

Методика получения поликлональных иммунных и моноклональных антител описана, например, в книге: Иммунологические методы, под ред. Г.Фримеля, М., Медицина, 1987, с.9-33. Методика получения естественных антител описана, например, в кн. Естественные антитела к низкомолекулярным соединениям. М.А.Мягкова. М., МГУЛ, 2001 (ISBN 5-8135-0058-8), с.70-114. Методика получения рекомбинантных антител описана, например, в статье Laffly Е., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.

Выделенные антитела последовательно многократно разводят и подвергают внешнему воздействию, преимущественно вертикальному встряхиванию, до получения активированной формы в сверхмалых дозах, например, по гомеопатической технологии потенцирования (см., например, Гомеопатические лекарственные средства. Руководство по описанию и изготовлению, В.Швабе, Москва, 1967, с.12-38). При этом производят равномерное уменьшение концентрации путем последовательного разведения 1 объемной части исходной субстанции (антител) в 9 объемных частях (для десятичного разведения D) или в 99 объемных частях (для сотенного разведения С) нейтрального растворителя с многократным вертикальным встряхиванием каждого полученного разведения и использованием преимущественно отдельных емкостей для каждого последующего разведения - до получения требуемой дозы разведения (потенции).

Внешнюю обработку в процессе уменьшения концентрации также можно осуществлять ультразвуком, электромагнитным или иным физическим воздействием.

Приготовленное таким образом лекарственное средство используют, преимущественно, в принятых в гомеопатической практике лекарственных формах и разведениях, в виде спиртовых или водных растворов или таблеток (гранул), полученных путем пропитывания до насыщения содержащегося в лекарственной форме нейтрального наполнителя полученным потенцированным раствором - активированной формой антител.

Для повышения лечебного эффекта лекарственное средство может содержать смесь различных гомеопатических разведений антител в активированной - потенцированной форме.

Предлагаемое лекарственное средство было изучено в экспериментах на животных. Для подтверждения положительного влияния заявляемого средства на процессы восстановления количества родоначальных клеток в костном мозге исследования проводили на модели миелосупрессии, вызванной введением циклофосфана. При этом использованы 239 мышей-самцов CBA/CaLac (конвенциональные линейные мыши 1 категории). Животные получены из питомника ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).

Для моделирования миелосупрессии экспериментальным мышам однократно внутрибрюшинно вводили циклофосфан в максимально переносимой дозе (250 мг/кг).

Заявляемое средство: потенцированную форму антител к фактору стволовой клетки (далее по тексту - анти-ФСК) вводили по 0,2 мл per os (1 раз в день), начиная с 1-го дня после введения цитостатика в течение 10 дней. Данная доза для анти-ФСК была установлена как наиболее эффективная в предварительных экспериментах. Контрольным животным на фоне циклофосфана в аналогичном режиме вводили дистиллированную воду. 10 мышей, содержащихся в аналогичных условиях, служили фоном.

Пример 1.

Были изучены изменения состояния пула клеток-предшественников грануломоноцитопоэза в костном мозге под действием анти-ФСК на фоне цитостатической миелосупрессии.

Исследования были выполнены на 65 мышах-самцах CBA/CaLac в возрасте 2-х месяцев.

Опытных животных (введение после циклофосфана анти-ФСК) и контрольных (введение после циклофосфана дистиллированной воды) умерщвляли на 3, 5, 7 и 10-е сутки после начала эксперимента (инъекция циклофосфана) методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. После асептического выделения бедренных костей в костном мозге каждой мыши определяли содержание коммитированных предшественников грануломоноцитопоэза методом колониеобразования в полувязкой среде in vitro. Кроме того, оценивали интенсивность процессов их пролиферации методом самоубийства с использованием гидроксимочевины и активность дифференцировки путем подсчета индексов созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в той же лунке). Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

Проведенные эксперименты показали, что под действием циклофосфана на 3-й сутки исследования развивается более чем двукратное угнетение колониеобразующей способности костного мозга (таблица 1). На 5-е сутки отмечался временный подъем числа гранулоцитомакрофагальных предшественников в кроветворной ткани, значительно более выраженный у мышей, которым вводили препарат антител к ФСК. Количество гранулоцитомакрофагальных предшественников при этом в 1,5 раза превысило исходное. Величина данного показателя в указанной группе не только на 5-е, но и на 3-е сутки эксперимента достоверно превосходила таковую у животных, получавших после цитостатика воду. Последующее падение колониеобразующей способности кроветворной ткани отмечалось как у контрольных, так и у опытных мышей, однако в последнем случае она существенно возросла к 10-м суткам, когда количество прекурсоров грануломоноцитопоэза практически вернулось к исходным значениям (в отличие от контрольных животных).

Изучение механизмов, лежащих в основе таких различий в состоянии пула кроветворных прекурсоров, позволило выявить резкое увеличение доли ДНК-синтезирующих предшественников грануломоноцитопоэза под действием препарата СМД антител к ФСК на 5-е сутки опыта, следовавшее за периодом выраженной депрессии их числа (таблица 1). На 7-е сутки наблюдения интенсивность пролиферации клоногенных миелоидных элементов достоверно снижалась в обеих исследуемых группах. На последнем этапе эксперимента процент гранулоцитарно-макрофагальных предшественников, находящихся в S-фазе митотического цикла, практически нормализовался у всех экспериментальных мышей.

Что касается интенсивности созревания гранулоцитомакрофагальных прекурсоров, то существенной разницы по этому показателю между животными обеих экспериментальных групп на протяжении всего исследования отмечено не было. Обращало на себя внимание лишь повышение скорости дифференцировки родоначальных клеток в тех случаях, когда их содержание в костном мозге было понижено относительно исходного уровня в условиях недостаточно активной пролиферации (таблица 1). Ускорение созревания в таких условиях представляет собой компенсаторное явление, направленное на обеспечение потребностей организма в зрелых клетках крови.

Пример 2.

Были изучены изменения состояния пула эритроидных клеток-предшественников в костном мозге под действием анти-ФСК на фоне цито-статической миелосупрессии.

Исследования были выполнены на 54 мышах-самцах CBA/CaLac в возрасте 2-х месяцев.

Опытных животных (введение после циклофосфана анти-ФСК) и контрольных (введение после циклофосфана дистиллированной воды) умерщвляли на 3, 5, 7 и 10-е сутки после начала эксперимента (инъекции циклофосфана) методом дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом. После выделения бедренных костей в костном мозге каждой мыши определяли содержание коммитированных предшественников эритропоэза методом колониеобразования в полувязкой среде in vitro. Кроме того, оценивали интенсивность процессов пролиферации эритроидных предшественников методом самоубийства с использованием гидроксимочевины и активность их дифференцировки путем подсчета индексов созревания (отношение числа кластеров к количеству колоний, выросших в той же лунке). Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

Содержание эритроидных предшественников в костном мозге снижалось под действием циклофосфана на 3-е сутки исследования более чем вдвое по сравнению с исходным уровнем (таблица 2). На 5-е сутки, как и со стороны гранулоцитомакрофагальных прекурсоров, отмечался «абортивный» (временный) подъем числа эритроидных предшественников в кроветворной ткани. При этом выход соответствующих колоний у мышей, которым вводили препарат антител к ФСК, практически достигал уровня фона. В указанной группе на 5-е сутки эксперимента величина данного показателя достоверно превосходила таковую у животных, получавших после цитостатика воду. Последующее падение колониеобразующей способности кроветворной ткани сменялось существенным ее возрастанием под действием анти-ФСК к 10-м суткам, когда количество прекурсоров эритропоэза вдвое превысило таковое у контрольных животных.

Исследование интенсивности пролиферации кроветворных прекурсоров выявило выраженное увеличение доли ДНК-синтезирующих предшественников эритропоэза под действием препарата анти-ФСК на 5-е сутки опыта, следовавшее за периодом снижения их числа (таблица 2). На 7-е сутки наблюдения темп деления клоногенных эритроидных элементов в данной группе значительно превысил таковую у интактных животных, нормализовавшись в дальнейшем.

Достоверной разницы по интенсивности созревания эритроидных прекурсоров между животными опытной и контрольной групп на протяжении всего исследования отмечено не было.

Таким образом, препарат анти-ФСК продемонстрировал достаточно выраженную способность повышать содержание родоначальных клеток различных ростков кроветворения в костном мозге в условиях миелосупрессии, вызванной циклофосфаном. Данные свойства препарата обусловлены, как оказалось, стимуляцией процессов пролиферации коммитированных гемопоэтических предшественников.

Пример 3.

Были изучены изменения содержания стромальных клеток-предшественников в костном мозге и периферической крови под действием анти-ФСК на фоне цитостатической миелосупрессии.

Эксперименты были проведены на мышах линии CBA/CaLac в количестве 66 голов, массой 18-20 г.

Опытных животных (введение циклофосфана и затем - анти-ФСК) и контрольных (введение циклофосфана и дистиллированной воды) умерщвляли на 3, 5, 7 и 10-е сутки после начала эксперимента (инъекции циклофосфана) методом частичной декапитации под эфирным наркозом. В костном мозге и в периферической крови мышей всех групп определяли содержание коммитированных стромальных предшественников (КОЕ-Ф) методом колониеобразования в полувязкой среде in vitro.

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

При исследовании состояния костномозгового пула клеток, дающих начало стромальным элементам, было обнаружено существенное падение их количества после введения циклофосфана в обеих экспериментальных группах на протяжении почти всего периода наблюдения, за исключением 3-х суток. В это время число КОЕ-Ф у мышей, которых поили после цитостатика как препаратом анти-ФСК, так и водой, достоверно превысило исходные значения (таблица 3). В дальнейшем снижение числа стромальных предшественников в костном мозге животных опытной группы было не столь выраженным, как в контрольной, достоверно превышая значения данного показателя в группе сравнения на 5-е, 7-е и 10-е сутки исследования.

Динамика содержания стромальных предшественников в периферической крови характеризовалась в целом 2-3-кратным увеличением числа циркулирующих КОЕ-Ф на протяжении всего эксперимента. Указанный феномен оказался максимально выраженным в обеих группах на 5-е сутки опыта (таблица 3). Обнаруженный феномен, наряду с уменьшением содержания клеток, обладающих аналогичными свойствами, в костном мозге, говорит в пользу их мобилизации в периферическую кровь под действием цитостатика. Однако тот факт, что при этом под действием препарата анти-ФСК в ранние сроки исследования содержание КОЕ-Ф в кроветворной ткани все-таки повышалось, свидетельствует о способности препарата стимулировать продукцию соответствующих клеток.

Таким образом, состояние пула предшественников фибробластов характеризуется их мобилизацией в периферическую кровь под действием циклофосфана, причем убыль КОЕ-Ф в костном мозге компенсируется под действием препарата СМД антител к ФСК за счет повышения их продукции.

Пример 4. Были изучены изменения содержания мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге и периферической крови под действием анти-ФСК на фоне цитостатической миелосупрессии.

Эксперименты были проведены на 54 мышах линии CBA/CaLac, массой 18-20 г.

Опытных животных (введение циклофосфана и анти-ФСК) и контрольных (введение циклофосфана и дистиллированной воды) умерщвляли на 3, 5, 7 и 10-е сутки после начала эксперимента (инъекции циклофосфана) методом частичной декапитации под эфирным наркозом. В костном мозге (на 3, 5, 7 и 10-е сутки) и в периферической крови (на 3-е сутки) мышей обеих сравниваемых групп определяли содержание мехенхимальных стволовых клеток (МСК) по методике, описанной In't Anker P.S., в собственной модификации.

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Частоту встречаемости МСК в костном мозге и периферической крови определяли с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных лимитирующих разведений одномерной модели Пуассона оценивалось посредством линейной log-log регрессии. При этом теоретическая фракция отрицательных лунок µ_i распределялась как µ_i=exp(-fx_i), где f - частота встречаемости МСК, xi - количество клеток, высаженных в лунку.

Проведенные исследования показали, что со стороны родоначальных клеток соединительной ткани, количественное определение которых проводили методом лимитирующих разведений в культуре, наблюдались изменения, аналогичные таковым в отделе коммитированных прекурсоров. Содержание мезенхимальных стволовых клеток в костном мозге возрастало лишь на 3-е сутки опыта у животных обеих сравниваемых групп. В последующие сроки наблюдения количество МСК падало, однако при этом величина данного показателя в группе с анти-ФСК практически втрое превышала таковую в контроле на 5-е, 7-е и 10-е сутки исследования (таблица 4). Изучение клеток, способных к длительному поддержанию культуры стромальных механоцитов, не выявило существенной разницы их содержания в периферической крови мышей сравниваемых групп на 3-е сутки исследования (таблица 4). Этот факт свидетельствует о том, что МСК не так чувствительны к мобилизующему действию циклофосфана, как их более дифференцированные потомки.

Таким образом, действие препарата анти-ФСК на состояние пула мезенхимальных стволовых клеток сходно с таковым в отношении коммитированных предшественников стромальных механоцитов (КОЕ-Ф), но его эффект выражен в меньшей степени, чем в отношении КОЕ-Ф.

Приведенные результаты показывают, что предлагаемое средство эффективно обеспечивает стимуляцию прогениторных-стволовых клеток различных линий дифференцировки и степеней зрелости, но практически не активирует их созревание и не вызывает мобилизацию в периферическую кровь, и не имеют побочных эффектов, что обусловливает возможность длительного применения.

Таблица 1 Динамика содержания клеток-предшественников грануломоноцитопоэза (КОЕ-ГМ, на 10⁵ нуклеаров) в костном мозге, доля КОЕ-ГМ, находящихся в S-фазе митотического цикла (%), и интенсивность их созревания (коэффициент дифференцировки) у мышей линии CBA/CaLacY после введения им циклофосфана (ЦФ) и препарата СМД антител к SCF (1) либо ЦФ и дистиллированной воды (2) (X±m) Сроки исследования, сутки КОЕ - ГМ Доля в S-фазе митотического цикла Созревание Фон 10,67±1,26 57,95±4,63 2,37±0,29 3-е 1 5,33±0,42*# 10,58±5,06* 3,79±0,38* 2 4,0±0,37* 21,67±7,38* 5,2±1,15* 5-е 1 16,5±1,73*# 56,17±4,56 2,17±0,25 2 9,83±1,35 44,58±6,2 3,13±0,47 7-е 1 6,0±0,58* 27,25±6,97* 4,75±0,52* 2 6,5±0,67* 19,18±7,57* 4,4±0,53* 10-е 1 8,67±0,33# 52,8±1,36 3,69±0,26* 2 5,83±0,31* 51,32±2,54 3,12±0,24 Примечание: * - отмечена достоверность различий с фоном при р<0,05
# - отмечена достоверность различий с контрольной группой 2 (вода) при р<0,05

Таблица 2 Динамика содержания клеток-предшественников эритропоэза (КОЕ-Э, на 10⁵ нуклеаров) в костном мозге, доля КОЕ-Э, находящихся в S-фазе митотического цикла (%), и интенсивность их созревания (коэффициент дифференцировки) у мышей линии CBA/CaLacY после введения им циклофосфана (ЦФ) и препарата СМД антител к SCF (1), либо ЦФ и дистиллированной воды (2) (X±m) Сроки исследования, сутки КОЕ-Э Доля в S-фазе митотического цикла Созревание Фон 12,5±0,81 37,98±3,76 2,1±0,19 3-й 1 5,33±0,42* 16,5±5,92* 2,42±0,24 2 4,5±0,22* 8,0±3,58* 2,39±0,29 5-е 1 10,33±0,56 40,83±3,52 2,2±0,08 2 8,0±1,03* 33,43±6,15 2,79±0,26 7-е 1 7,0±0,86* 49,67±4,88 2,96±0,15* 2 7,67±1,12* 42,45±7,25 3,23±0,26* 10-е 1 10,5±1,06# 34,72±5,29 2,93±0,3* 2 5,5±0,34* 26,02±4,0 3,18±0,48* Примечание: * - отмечена достоверность различий с фоном при P<0,05
# - отмечена достоверность различий с контрольной группой 2 (вода) при P<0,05

Таблица 3 Динамика содержания КОЕ-Ф в костном мозге и в периферической крови мышей линии CBA/CaLac (на 250 тыс. мононуклеаров) после введения им циклофосфана (ЦФ) и препарата СМД антител к SCF (1) либо ЦФ и дистиллированной воды (2) (X±m) Сроки исследования Группы Костный мозг Периферическая кровь   Фон 23,83±1,28 13,33±1,09 3 1 42,83±1,17* 28,50±0,96*# 2 41,17±1,14* 8,50±0,96* 5 1 14,50±1,23*# 36,00±2,85* 2 5,83±0,65* 32,00±2,16* 7 1 7,83±1,33*# 26,25±1,11* 2 1,83±0,54* 28,25±0,25* 10 1 6,67±1,17*# 35,83±1,96* 2 0,67±0,33* 30,25±3,68* Примечание: * - отмечена достоверность различий с фоном (Р<0,05)
# - отмечена достоверность различий с контрольной группой 2 (вода) при P<0,05

Таблица 4 Динамика содержания мезенхимальных стволовых клеток (на 10 мононуклеаров) в костном мозге и периферической крови мышей линии CBA/CaLac после введения им циклофосфана (ЦФ) и препарата СМД антител к SCF (1) либо ЦФ и дистиллированной воды (2) (X±m) Сроки исследования (сутки) Костный мозг Периферическая кровь фон 113±12 53±6 3-е 1 219±87 73±16 2 157±39 60±0 5-е 1 81±9#         2 32±7*   7-е 1 38±7*#   2 12±2*   10-е 1 32±7*#   2 7±2*   Примечание: * - отмечена достоверность различий с фоном при P<0,05
# - отмечена достоверность различий с контрольной группой 2 (вода) при P<0,05

Изобретение относится к биотехнологии. Описано лекарственное средство, содержащее активированную форму антител к фактору стволовой клетки (анти-ФСК), полученную путем многократного последовательного разведения и внешнего воздействия - многократного вертикального встряхивания каждого полученного разведения по гомеопатической технологии, обусловливающей сверхмалую дозу упомянутых антител. Изобретение может быть использовано в качестве эффективного средства для повышения количества стволовых клеток в организме. 4 табл.

Лекарственное средство для стимуляции продукции стволовых клеток в костном мозге, характеризующееся тем, что содержит активированную форму антител к фактору стволовой клетки (анти-ФСК), полученную путем многократного последовательного разведения и внешнего воздействия - многократного вертикального встряхивания каждого полученного разведения по гомеопатической технологии, обусловливающей сверхмалую дозу упомянутых антител.