СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ МИЕЛОПОЭЗА Российский патент 2012 года по МПК A61K31/712 A61K38/47 A61P43/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.

Высокая частота встречаемости заболеваний системы крови, резистентных к современной медикаментозной терапии [1, 2], является основанием для разработки новых способов стимуляции гемопоэза.

Известно большое количество способов стимуляции гемопоэза.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату прототипом является способ стимуляции миелопоэза с помощью препарата иммобилизированной гиалуронидазы [3].

Недостатком данного способа является его недостаточная эффективность.

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается техническим решением, заключающемся в одновременном введении перорально пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней и однократно внутривенно D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг.

Новым в предлагаемом изобретении является дополнительное однократное введение внутривенно D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг.

На сегодняшний день показана возможность стимуляции эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения с помощью пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) [3]. При этом механизмом действия препарата является стимуляция процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных клеток под влиянием образующихся под действием фермента низко- и среднемолекулярных форм гиалуроновой кислоты (ГК) межклеточного матрикса гемопоэтической ткани [4].

Известны гемостимулирующие эффекты D-глюкуроновой кислоты, но лишь при ее курсовом введении в высоких дозах (50 мг/кг) [5]. При этом широкое клиническое использование данного препарата в качестве гемостимулятора в указанных дозах, учитывая его кислотность, частоту и тяжесть возникновения местнораздражающих реакций, представляется маловероятным.

Вместе с тем, известно, что введение препаратов гиалуронидазы способно сопровождаться разобщением процессов пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников [4, 6], и как следствие - ограничением выраженности гемостимулирующих эффектов, потенциал которых может быть значительно выше. Кроме того, показано снижение способности прогениторных элементов, подвергшихся воздействию гиалуронидазы, к энграфтингу при их трансплантации [7], а также возможность предупреждения формирования данного феномена путем инкубации трансплантата в растворе, содержащем D-глюкуроновую кислоту, представляющую собой структурную единицу мономера ГК [8].

Тем не менее, возможность усиления гемостимулирующего эффекта пэгГД с помощью дополнительного введения D-глюкуроновой кислоты, причем в дозах, значительно ниже терапевтически эффективных доз, остается не известна.

Факт совместного применения пэгГД и D-глюкуроновой кислоты с достижением нового технического результата: создание эффективного способа стимуляции миелопоэза за счет потенцирования специфических гематотропных эффектов каждого из используемых веществ, для специалиста является не очевидным. Эксперимент показал непредсказуемый результат.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Лабораторному животному (мыши) одновременно вводят перорально препарат пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки, в течение 2-х дней, и однократно внутривенно D-глюкуроновую кислоту в дозе 2 мг/кг.

Заявляемая доза и режим введения пэгГД и D-глюкуроновой кислоты подобраны опытным путем и являются оптимальными для получения заявленного технического результата.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac в количестве 244 штук, массой 18-20 г. Мыши 1 категории (конвенциональные линейные мыши) получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Эффективность стимуляции миелопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [9] с помощью стандартных и культуральных гематологических методов на 3, 5 и 8-е сутки после введения цитостатика [10].

Пример 1.

Моделирование цитостатической миелосупрессии осуществляли путем однократного внутрибрюшинного введения циклофосфана в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,3 мл физиологического раствора. Опытным животным на фоне моделирования миелосупрессии вводили перорально препарат пэгГД (ООО «Саентифик фьючер менеждмент», г.Новосибирск) 1 раз в сутки в течение 2-х дней в дозе 50 ЕД/кг (способ-прототип) и препарат пэгГД в аналогичном режиме совместно с однократным внутривенным введением D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг («Sigma», США).

Контролями служили группы животных, которым вводили либо однократно внутривенно D-глюкуроновую кислоту в дозе 2 мг/кг, либо 1 раз в сутки в течение 2-х дней физиологический раствор.

Введение препарата пэгГД на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии сопровождалось стимуляцией процессов регенерации эритроидного и гранулоцитарного ростков кроветворения. Отмечалось увеличение содержания кроветворных прекурсоров (КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) и морфологически распознаваемых клеточных элементов эритроидного и грануломоноцитарного ростков кроветворения в гемопоэтической ткани (табл.1, 2), а также количества зрелых клеток эритроидного и гранулоцитарного ряда в периферической крови (табл.3).

В отличие от этого введение D-глюкуроновой кислоты в дозе 2 мг/кг не оказывало статистически значимого влияния на показатели системы крови (табл.1-3).

В то же время применение D-глюкуроновой кислоты на фоне введения пэгГД сопровождалось значительной стимуляцией процессов кроветворения. Причем темп и выраженность регенерации кроветворной ткани в данном случае существенно превосходили таковые при использовании только пэгГД. Так, количество КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге на 5-е сутки было в 2,3 и 1,8 раз соответственно выше аналогичных параметров у животных, получавших терапию по способу-прототипу.

Указанные изменения состояния пула родоначальных элементов сопровождались закономерно более ранним восстановлением морфологически распознаваемых показателей костного мозга (в первую очередь, незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов, эритроидных клеток) (табл.2) и периферической крови (ретикулоцитов, палочко- и сегментоядерных нейтрофилов и тромбоцитов) (табл.3).

Таким образом, дополнительное введение низких доз D-глюкуроновой кислоты на фоне проведения терапии с помощью пегилированной гиалуронидазы приводило к значительному ускорению регенеративных процессов гемопоэтической ткани. При этом механизмом потенцирования гемостимулирующих эффектов пэгГД, по-видимому, являлось регуляторное влияние D-глюкуроновой кислоты на метаболизм гиалуроновой кислоты гликокаликса кроветворных прекурсоров.

Литература

1. Glaspy J.A. Hematopoietic management in oncology practice. Part 1. // Myeloid growth factors Oncology (Huntingt). - 2003. - Vol.17. - №11. - P.1593-1603.

2. Волкова М.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - №4. - С.80-84.

3. Дыгай A.M., Артамонов А.В., Бекарев А.А. и др. Гемостимулирующие эффекты иммобилизированной гиалуронидазы и механизмы их развития при цитостатической миелосупрессии // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2010. - №5. - С.528-531.

4. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.7-10.

5. Гурьянцева Л.А., Удут Е.В., Симанина Е.В. и др. Механизмы регуляции системы крови под влиянием гемостимуляторов на фоне цитостатической миелосупрессии // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - №3. - С.39-43.

6. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M., Гольдберг Е.Д. Роль гиалуронидазы в регуляции гемопоэза // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2007. - №12. - С.690-695.

7. Hui Zhu, Noboru Mitsuhashi, Andrew Klein e.a. The Role of the Hyaluronan Receptor CD44 in Mesenchymal Stem Cell Migration in the Extracellular Matrix // Stem Cells. 2006 - Vol.24. - N.4. - P.928-935.

8. Патент (RU) на изобретение №2392947 «Способ получения клеточного материала для трансплантации при миелосупрессии», 2010. Авторы: Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др.

9. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1(9). - С.29-32.

10. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.

Таблица 1 Динамика содержания КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в костном мозге мышей линии CBA\CaLac (на 10⁵ неприлипающих миелокариоцитов) после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированиой гиалуронидазы (пэгГД) (3) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m) Сроки исследования, сутки КОЕ-Э КОЕ-ГМ Фон 6,75±0,73 4,50±0,38 3-е 1 8,40±0,30* 8,35±0,44* 2 8,58±0,23* 8,70±0,96* 3 14,1±1,7*# 12,38±0,82*# 4 18,3±0,23*#$ 17,00±0,53*#$ 5-е 1 7,56±0,48 6,63±0,78* 2 7,59±0,51 7,75±0,76* 3 10.73±0,65*# 15,89±0,45*# 4 24,8±1,3*#$ 28,5±0,5*#$ 10-е 1 5,8±0,8 4,25±0,53 2 5,75±0,7 4,4±0,29 3 7,7±0,3# 6,1±0,80* 4 8,10±0,42*# 8,2±0,7*# * - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05; # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05; $ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05.

Таблица 2 Динамика показателей костномозгового кроветворения у мышей линии CBA\CaLac (×10⁶ бедро) после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m) Сроки исследования, сутки Незрелые нейтрофильные гранулоциты Зрелые нейтрофильные гранулоциты Эозинофильные гранулоциты Моноциты Эритроидные клетки фон 1,0±0,05 3,22±0,19 0,57±0,05 0,34±0,08 1,85±0,32 3-е 1 0,03±0,01* 0,10±0,04* 0 0,25±0,05 0,17±0,04* 2 0,03±0,02* 0,15±0,02* 0 0,20±0,14 0,14±0,05* 3 0,14±0,02*# 0,14±0,04* 0 0,42±0,07 0,36±0,03*# 4 0,15±0,02*# 0,17±0,03* 0 0,51±0,03* 0,44±0,02*#$ 5-е 1 1,5±0,21* 2,8±0,24* 0,20±0,08 0,96±0,1* 1,22±0,1 2 1,6±0,06* 2,6±0,29* 0,09±0,05* 0,98±0,08* 1,28±0,26 3 2,31±0,02*# 3,4±0,10*# 0,22±0,05 1,34±0,15* 1,99±0,32# 4 3,49±0,05*#$ 5,7±0,37#$ 0,2±0,20 2,55±0,25*#$ 2,78±0,2*#$ 10-е 1 1,6±0,08* 4,5±0,3* 0,56±0,25 0,40±0,09 1,4±0,04 2 0,80±0,41 4,7±0,5* 0,58±0,10 0,61±0,17 1,39±0,03 3 3,6±0,08*# 6,41±0,4*# 0,53±0,7 0,99±0,31 2,36±0,1*# 4 4,3±0,03*#$ 7,32±0,08*#$ 0,57±0,14 1,07±0,06*# 3,4±0,07*#$ * - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05; # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05; $ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05.

Таблица 3 Показатели периферической крови у мышей линии CBA\CaLac после введения дистиллированной воды (1), 2 мг/кг D-глюкуроновой кислоты (2) и 50 ЕД/кг пегилированной гиалуронидазы (пэгГД) (3) и совместно D-глюкуроновую кислоту с пэгГД (4) на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, (Х±m) Сроки исследования, сутки Ретикулоциты, в промиллях Палочкоядерные нейтрофилы, Г/л Сегментоядерные нейтрофилы, Г/л Тромбоциты, Т/л Фон 9,3±0,2 0,30±0,02 2,34±0,07 654,7±23,4 3-е 1 10,4±0,14* 0,01±0,01* 0,11±0,02* 544,60±31,1* 2 10,89±0,33* 0,01±0,01* 0,14±0,01* 584,6±36,7 3 14,7±0,5*# 0,01±0,01* 0,19±0,02* 507,9±14,7* 4 16,8±0,59*#$ 0,01±0,01* 0,16±0,02* 577,1±23,0 3-е 1 23,7±1,1* 0,06±0,04* 1,5±0,43* 477,8±6,4* 2 22,6±1,3* 0,08±0,03* 1,62±0,29* 493,0±37,9* 3 35,7±0,9*# 0,33±0,04# 2,8±0,26# 487,3±17,8* 4 42,4±2,08*#$ 0,94±0,21*#$ 3,71±0,11*#$ 794,5±21,8*#$ 10-е 1 16,2±1,0* 1,5±0,2* 4,23±0,53* 708,4±17,1 2 15,7±0,7* 1,72±0,1* 4,37±0,7* 869,6±94,3* 3 17,4±0,7* 1,6±0,3* 6,3±0,12*# 1084,7±42,8*# 4 20,1±0,9*#$ 1,97±0,1* 7,43±0,45*#$ 1256,7±21,8*#$ * - различия достоверны по отношению к фону при р<0,05; # - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения циклофосфана при р<0,05; $ - различия достоверны с группой животных, получавших только пэгГД при р<0,05.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для стимуляции миелопоэза. Для этого вводят пегилированную гиалуронидазу в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней и дополнительно однократно внутривенно препарат, содержащий D-глюкуроновую кислоту, в дозе 2 мг/кг. Способ позволяет ускорить регенеративные процессы гемопоэтической ткани при дополнительном введении низких доз D-глюкуроновой кислоты за счет ее регуляторного влияния на метаболизм гиалуроновой кислоты гликокаликса кроветворных прекурсоров. 3 табл.

Способ стимуляции миелопоэза, заключающийся во введении препарата пегилированной гиалуронидазы в дозе 50 ЕД/кг 1 раз в сутки в течение 2 дней, отличающийся тем, что дополнительно однократно внутривенно вводят препарат, содержащий D-глюкуроновую кислоту, в дозе 2 мг/кг.