Изобретение относится к области экспериментальной медицины, конкретно к гематологии и фармакологии.
Известны адекватные и высокочувствительные способы определения гранулоцитопоэзстимулирующей активности различных фармакологических средств и синтетических и природных соединений [1]. Однако их общим недостатком во всех случаях является значительная трудоемкость, необходимость развитой материально-технической базы и сложность используемых методик.
Известен способ определения гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ по регистрации абсолютного количества незрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге экспериментальных животных до и после введения фармакологического вещества на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии, и при увеличении их количества не менее чем в 2 раза считают вводимое вещество активным [1].
Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.
Изучение показателей, регистрируемых по способу-прототипу, требует значительных трудозатрат, навыка исследователя и достаточно длительного времени (изучение общей клеточности костного мозга и подсчет миелограмм).
Задачей, решаемой данным изобретением, является упрощение способа определения гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ.
Поставленная задача достигается тем, что после воспроизведения гипоплазии кроветворения у экспериментальных животных (мышей) путем однократного введения цитостатика в максимально переносимой дозе (МПД) (циклофосфана либо 5-фторурацила) производят подсчет абсолютного количества клеток гранулоцитарного ростка кроветворения - нейтрофилов - в периферической крови, при этом критерием достаточной гранулоцитопоэзстимулирующей эффективности является увеличение их числа до 150% и более.
Новым в предлагаемом способе является определение количества клеток гранулоцитарного ростка кроветворения в периферической крови и использование в качестве критерия гранулоцитопоэзстимулирующей активности увеличение абсолютного числа нейтрофилов до 150% и более после введения фармакологического вещества.
Одной из актуальных проблем экспериментальной гематологии и фармакологии является поиск новых эффективных лекарственных средств, способных стимулировать кроветворение при гипопластических состояниях различного генеза. Используемые в настоящее время с этой целью в эксперименте и клинике препараты зачастую являются малоэффективными, либо обладают рядом нежелательных эффектов, либо высокой стоимостью [1, 2, 3]. Таким образом, весьма перспективным можно считать создание и изучение потенциальных стимуляторов, в том числе и грануломоноцитопоэза. В связи с этим становится актуальной и проблема разработки быстрой, качественной и достоверной оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности средств, планируемых к применению в качестве гемостимуляторов.
Клетки гранулоцитарного ряда периферической крови (нейтрофилы) представляют собой очень мобильную фракцию клеточных элементов: при их выходе из органов гемопоэза они могут участвовать в создании маргинального сосудистого резервного пула лейкоцитов, циркулировать определенное время в токе крови либо, напротив, быстро мигрировать в ткани организма [4, 5]. В связи с этим даже при одном уровне продукции нейтрофилов в гемопоэтической ткани и их одинаково быстром выходе из органов гемопоэза при различных физиологических и патологических состояниях число нейтрофилов в периферической крови может колебаться в определенных пределах.
Поэтому факт использования в качестве достоверного критерия эффективности гранулоцитопоэзстимулирующей активности увеличение в периферической крови числа нейтрофилов до 150% и более с целью упрощения способа определения гранулоцитопоэзстимулирующей активности веществ для специалиста является неочевидным.
Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не являющиеся очевидными для специалиста и не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют быстро, качественно и достоверно определять гранулоцитипоэзстимулирующую активность веществ, планируемых к применению в качестве стимуляторов гранулоцитопоэза, и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной медицине с выходом в практическое здравоохранение для создания новых эффективных гемостимуляторов. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.
Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».
Способ осуществляют следующим образом.
Экспериментальным животным (мыши) путем однократного внутрибрюшинного введения цитостатика в максимально переносимой дозе (МПД) (циклофосфан, 5-фторурацил) воспроизводится гипоплазия кроветворения.
Через 24 ч после инъекции цитостатика опытным мышам начинают вводить препарат, планируемый к применению в качестве стимулятора гранулоцитопоэза. Режим и доза введения каждого препарата определяется индивидуально в зависимости от его ожидаемой специфической активности, токсичности, побочных эффектов и пр. факторов. Контрольные животные после введения цитостатика аналогичным способом введения и в соответствующем режиме получают физиологический раствор.
На следующие сутки после окончания введения испытуемого средства у мышей обеих групп производят забор периферической крови для исследования лейкоцитов. Для этой цели можно использовать как автоматический гематологический анализатор, так и общепринятые стандартные гематологические методы [6], один из которых приведен ниже.
В этом случае из надреза предварительно обработанного спиртом кончика хвоста выдавливают каплю крови, которая набирается до отметки «0,5» в смеситель для белой крови и разводится до метки «11» 3-5%-ным раствором уксусной кислоты, после чего содержимое смесителя тщательно перемешивается в течение 2-3 мин. Перед заполнением камеры Горяева две капли жидкости из смесителя удаляют. Подсчет ведут в 100 больших квадратах, сгруппированных по 4 (объектив 8, окуляр 15). Подсчитав число лейкоцитов во всех 100 квадратах, записывают результат, а затем производят расчет по формуле:
где Х - количество лейкоцитов в 1 л крови;
а - сумма лейкоцитов, подсчитанных в 100 квадратах;
б - разведение крови в 20 раз;
в - число сосчитанных малых квадратов - 1600;
4×109 - множитель, приводящий результат к 1 л крови.
Одновременно с набором крови в смеситель готовят тонкие мазки крови для подсчета лейкоцитарной формулы на заранее обезжиренных предметных стеклах и высушивают их на воздухе. Зафиксированные (3-5 мин в метаноле) мазки окрашивают по методу Нохта-Максимова. Краска для этого готовится путем смешивания очищенной воды, 0,1%-ного водного раствора азура II (ТУ 6-09-07-553-75) и 0,1%-ного водного раствора эозина (ТУ 6-09-183-75) в соотношении 6:1:0,5. Окрашивание длится 35-45 минут, после чего мазки промывают и высушивают.
Подсчет лейкоцитарной формулы производят с помощью иммерсионной системы микроскопа. При этом сосчитывают не менее 100 лейкоцитов, а затем определяют процентное содержание их отдельных морфологических форм. Затем вычисляют абсолютное содержание лейкоцитов каждого вида в периферической крови. При этом используется следующая пропорция:
а - 100%;
Х - б,
где Х - содержание лейкоцитов определенного вида в 1 л крови;
а - общее количество лейкоцитов в крови, подсчитанное в камере Горяева;
б - процентное содержание лейкоцитов соответствующего вида, подсчитанное в мазке крови.
Анализируя полученные данные, сравнивают абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов в 1 л периферической крови у мышей, получавших только циклофосфан, и у животных, получавших испытуемый препарат на фоне циклофосфана. Величина указанного показателя в опытной группе должна составлять не менее 150% от таковой у контрольных животных.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 298 шт., массой 18-20 г. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется).
Пример 1.
Определяли специфическую (гранулоцитопоэзстимулирующую) активность рчГ-КСФ («Нейпоген», Hoffman-la-Roche, Швейцария).
Для тестирования активности препарата использовали мышей-самцов линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Все животные получали однократно внутрибрюшинно циклофосфан в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,2 мл физиологического раствора. Через 24 ч после инъекции цитостатика опытным мышам начинали вводить рчГ-КСФ в дозе 125 мкг/кг в объеме 0,2 мл подкожно, ежедневно в течение 4-х дней. В качестве растворителя использовали забуференный физиологический раствор. Контрольные животные после введения цитостатика получали четырехкратно в эквивалентном объеме растворитель.
На 5-е сутки после введения циклофосфана (на следующий день после окончания введения рчГ-КСФ) у мышей обеих групп производили забор периферической крови для определения абсолютного количества нейтрофилов. При этом для подтверждения уровня активности гиперпластических процессов в костном мозге определяли абсолютное количество незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов (по способу-прототипу) и число гранулоцитарных колониеобразующих единиц (КОЕ-Г) в костном мозге с помощью метода клонирования в полувязкой среде [6].
В ходе исследований введение рчГ-КСФ достоверно повышало уровень содержания нейтрофилов в периферической крови до 237,9% от контрольных значений. При этом описанные изменения явились отражением возрастания содержания КОЕ-Г в костном мозге до 608,6% от контрольных значений и числа незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани (до 243,8% и 116,5% от контрольных значений соответственно) (табл.1).
Таким образом, рчГ-КСФ приводил к увеличению числа нейтрофилов в периферической крови более чем на 150% от контрольных значений, отражающему и соответствующему высокой интенсивности репаративных процессов в костном мозге, вызванном введением данного препарата.
Пример 2.
Определяли специфическую (гранулоцитопоэзстимулирующую) активность субстанции глюкуроновой кислоты (фармацевтическая компания «Поиск», Томск).
Для тестирования активности субстанции использовали мышей линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Все животные получали однократно внутрибрюшинно 5-фторурацил в максимально переносимой дозе (228 мг/кг) в 0,2 мл физиологического раствора. Через 24 ч после инъекции цитостатика опытным мышам начинали вводить раствор субстанции глюкуроновой кислоты в дозе 30 мг/кг в объеме 0,2 мл внутривенно, ежедневно в течение 3-х дней. В качестве растворителя использовали физиологический раствор. Контрольные животные после введения цитостатика получали трехкратно в эквивалентном объеме растворитель.
На 4-е сутки после введения 5-фторурацила у мышей обеих групп производили забор периферической крови для определения абсолютного количества нейтрофилов. При этом для подтверждения уровня активности гиперпластических процессов в костном мозге определяли абсолютное количество незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов (по способу-прототипу) и число гранулоцитарных колониеобразующих единиц (КОЕ-Г) в костном мозге с помощью метода клонирования в полувязкой среде [6].
В ходе исследований введение глюкуроновой кислоты достоверно повышало уровень содержания нейтрофилов в периферической крови до 159,1% от контрольных значений. При этом в костном мозге, в отличие от контроля, отмечалось появление КОЕ-Г и регистрировалось возрастание числа незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани (до 241,2% и 158,3% от контрольных значений соответственно) (табл.2).
Таким образом, глюкуроновая кислота приводила к увеличению числа нейтрофилов в периферической крови более чем в 1,5 раза, сопровождавшемуся возрастанием интенсивности гиперпластических процессов в костном мозге, вызванным введением данного препарата, также регистрируемым способом-прототипом.
Пример 3.
Определяли специфическую (гранулоцитопоэзстимулирующую) активность жидкого экстракта шлемника байкальского (ЭШБ), полученного из ГНЦЛС (Харьков, Украина).
Для тестирования активности субстанции использовали мышей линии CBA/CaLac массой 18-20 г. Все животные получали однократно внутрибрюшинно циклофосфан в максимально переносимой дозе (250 мг/кг) в 0,2 мл физиологического раствора. Через 24 ч после инъекции цитостатика опытным мышам начинали вводить зондом per os раствор экстракта шлемника байкальского в дозе 1 мл/кг в объеме 0,2 мл, ежедневно в течение 9-ти дней. Контрольные животные после введения цитостатика получали в течение 9-ти дней эквивалентный объем физиологического раствора.
На 10-е сутки после введения циклофосфана у мышей обеих групп производили забор периферической крови для определения абсолютного количества нейтрофилов. При этом для подтверждения уровня активности гиперпластических процессов в костном мозге определяли абсолютное количество незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов (по способу-прототипу) и число гранулоцитарных колониеобразующих единиц (КОЕ-Г) в костном мозге с помощью метода клонирования в полувязкой среде [6].
В ходе исследований введение экстракта шлемника байкальского достоверно повышало уровень содержания нейтрофилов в периферической крови до 123,0% от контрольных значений. При этом в костном мозге не регистрировалось статистически значимых изменений содержания КОЕ-Г по сравнению с контрольными значениями и числа незрелых нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани. В то же время имела место тенденция к снижению количества зрелых нейтрофильных гранулоцитов, но не достигающая статистической значимости (табл.3).
Таким образом, экстракт шлемника байкальского приводил к увеличению числа нейтрофилов в периферической крови, но менее чем в 1,5 раза от контроля. При этом не отмечалось возрастания интенсивности регенераторных процессов в костном мозге, определяемых как по способу-прототипу, так и с помощью более чувствительных культуральных методов. В связи с этим можно утверждать, что выявленное увеличение количества нейтрофилов в периферической крови являлось результатом активации определенных перераспределительных механизмов и не было связано со специфической гранулоцитопоэзстимулирующей активностью исследуемого вещества.
Таким образом, увеличение количества нейтрофилов в периферической крови до 150% и более после введения средств, планируемых к применению в качестве стимуляторов гранулоцитопоэза, на фоне моделирования гипоплазии кроветворения у экспериментальных животных (мышей) путем однократного введения цитостатика в максимально переносимой дозе (циклофосфана либо 5-фторурацила) является достоверным и простым в методическом плане критерием оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности веществ.
Предлагаемый способ позволяет достоверно и просто определять наличие гранулоцитопоэзстимулирующей активности.
Литература
1. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ. // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1(9). - С.29-32.
2. Гершанович М.Л. Осложнения при химио- и гормонотерапии злокачественных опухолей. - М.: Медицина, 1982. - 224 с.
3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. и др. Механизмы гемостимулирующего эффекта гранулоцитарного колониестимулирующего фактора при цитостатическом воздействии. // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 1999. - №8. - С.194-199.
4. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. - Новосибирск: Наука, 1989. - 344 с.
5. Дыгай A.M., Клименко Н.А. Воспаление и гемопоэз. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 276 с.
6. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ МИЕЛОПОЭЗА | 2008 |
|
RU2366452C1 |
СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ДЕПРЕССИИ ГРАНУЛОЦИТОПОЭЗА ПРИ ЦИТОСТАТИЧЕСКОМ ВОЗДЕЙСТВИИ | 2008 |
|
RU2366422C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ГЕМОСТИМУЛЯТОРОВ ПРИ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ МИЕЛОСУПРЕССИИ | 2009 |
|
RU2421720C2 |
СРЕДСТВО, ИЗБИРАТЕЛЬНО СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ГРАНУЛОМОНОЦИТОПОЭЗ ПРИ ГИПОПЛАЗИИ КОСТНОМОЗГОВОГО КРОВЕТВОРЕНИЯ, ВЫЗВАННОГО ЦИТОСТАТИКОМ | 1988 |
|
RU2020936C1 |
СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ МИЕЛОПОЭЗА | 2007 |
|
RU2336899C1 |
ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО | 2013 |
|
RU2514648C1 |
СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ЭРИТРОИДНЫЙ И ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ РОСТКИ КРОВЕТВОРЕНИЯ ПРИ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ МИЕЛОДЕПРЕССИЯХ | 2003 |
|
RU2243782C1 |
ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ЭРИТРОИДНЫЙ И ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ РОСТКИ КРОВЕТВОРЕНИЯ ПРИ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ МИЕЛОДЕПРЕССИЯХ | 1993 |
|
RU2083201C1 |
ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ЭРИТРОИДНЫЙ РОСТОК КРОВЕТВОРЕНИЯ ПРИ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ МИЕЛОДЕПРЕССИЯХ | 1992 |
|
RU2061475C1 |
СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ЦИТОСТАТИЧЕСКОЙ МИЕЛОСУПРЕССИИ | 2012 |
|
RU2488890C1 |
Изобретение относится к области экспериментальной медицины, конкретно к гематологии и фармакологии. Предложенный способ заключается в том, что после воспроизведения гипоплазии кроветворения у экспериментальных животных (мышей) путем однократного введения цитостатика в максимально переносимой дозе (МПД) (циклофосфана либо 5-фторурацила) производят подсчет абсолютного количества клеток гранулоцитарного ростка кроветворения - нейтрофилов - в периферической крови до и после введения вещества, при этом достоверным критерием гранулоцитипоэзстимулирующей активности вводимого фармакологического вещества является увеличение числа нейтрофилов до 150% и более. Технический результат представляет собой упрощение способа определения гранулоцитопоэзстимулирующей активности фармакологических веществ и расширение сферы его применения. 3 табл.
Способ оценки гранулоцитопоэзстимулирующей активности, заключающийся в определении после моделирования цитостатической гипоплазии костного мозга количества клеток гранулоцитарного ростка кроветворения до и после введения фармакологического вещества, отличающийся тем, что определение проводят в периферической крови и при увеличении абсолютного числа нейтрофилов до 150% и более после введения вещества, данное фармакологическое вещество оценивают как обладающее гранулоцитопоэзстимулирующей активностью.
ДЫГАЙ A.M., ЖДАНОВ В.В., ГОЛЬДБЕРГ В.Е | |||
и др | |||
Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств | |||
Топчак-трактор для канатной вспашки | 1923 |
|
SU2002A1 |
RU 2063751 С1, 20.07.1996 | |||
СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ПОБОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ ХИМИОЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ | 1995 |
|
RU2110995C1 |
ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, СТИМУЛИРУЮЩЕЕ ЭРИТРОИДНЫЙ И ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ РОСТКИ КРОВЕТВОРЕНИЯ ПРИ ЦИТОСТАТИЧЕСКИХ МИЕЛОДЕПРЕССИЯХ | 1993 |
|
RU2083201C1 |
СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ КОСТНО-МОЗГОВОГО КРОВЕТВОРЕНИЯ | 1992 |
|
RU2096048C1 |
Авторы
Даты
2008-08-27—Публикация
2006-11-07—Подача