СУБСТРАТ И СПОСОБ ЕГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/74 A61K31/401 A61L33/10 A61M1/18 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к субстрату и технологии модификации его поверхности, пригодных для применения в области медицины.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Кровь обладает свойствами активироваться и образовывать тромб, когда она контактирует с инородным материалом. В случае, если тромб образуется в контуре циркуляции или установке для диализа при экстракорпоральной циркуляции крови, как в случае искусственной почки, давление циркуляции возрастает и, помимо того, что становится невозможной быстрая циркуляция крови, появляется риск обструкции кровеносного сосуда, если часть образовавшегося тромба проникнет в организм. Таким образом, необходимо добавлять в кровь вещество, обладающее противосвертывающей активностью (антикоагулянт), и указанный способ широко применяется. В качестве антикоагулянта обычно используют недорогой гепарин. Однако гепарин нельзя использовать у пациентов с гепарин-индуцированной тромбоцитопенией (далее в настоящем документе называемой HIT) и у пациентов с кровотечением, таких как пациенты немедленно после оперативного вмешательства, и вместо гепарина необходимо использовать дорогой антикоагулянт, такой как нафомостата мезилат и габексата мезилат, в результате чего возникает проблема повышения стоимости медицинских услуг (см. непатентные документы 1, 2 и 3).

Были проведены исследования, касающиеся противосвертывающих материалов, которые могут сократить использование антикоагулянтов посредством сообщения противосвертывающих свойств поверхности материала или которые можно использовать в условиях, при которых антикоагулянт не добавляется. Иными словами, указанные материалы получаются иммобилизацией препятствующих коагуляции веществ на поверхности материала и включают в себя гепаринизированный материал как наиболее изученный материал. Основной способ иммобилизации гепарина на материале основан на ионной связи, использующей катионы соли аммония и т.п., введенные в материал, и анионы гепарина (см. непатентный документ 4). Однако в данном случае существует вероятность вымывания гепарина, и, таким образом, указанный способ нельзя использовать у пациентов с HIT, а также он порождает проблему понижения противосвертывающей активности. По указанной причине сообщалось о нескольких способах иммобилизации гепарина на основе ковалентной связи для разрешения проблемы вымывания. Во-первых, сообщалось о способе иммобилизации, основанном на ковалентной связи, образованной органическими химическими агентами, но он также порождает проблему понижения противосвертывающей активности во время химической реакции (см. патентный документ 1). Во-вторых, сообщалось о способе иммобилизации на материале гепарина, основанном на ковалентной связи, предотвращающем понижение противосвертывающей активности, в котором используется пучок ионов и лазерный свет, но поскольку используется пучок ионов и лазерный свет, то трудно иммобилизовать гепарин на внутренней поверхности, такой как поверхность внутри полого волокна, где пучок ионов отбрасывает тень (см. патентный документ 2).

Сам по себе гепарин обладает очень низкими антикоагулянтными свойствами и демонстрирует высокую противосвертывающую активность после связывания с антитромбином III (далее в настоящем документе называемым ATIII). Иными словами, существует также проблема, которая заключается в том, что противосвертывающие свойства являются недостаточными в крови с дефицитом ATIII (см. непатентный документ 2).

Что касается перечисленных выше проблем с материалом, иммобилизующим гепарин, были проведены исследования, касающиеся материалов, на которых иммобилизовали соединения, обладающие противосвертывающей активностью, не являющиеся гепарином (см. патентный документ 3). Однако существует проблема, которая заключается в том, что трудно подавлять прикрепление тромбоцитов с использованием одного лишь соединения, обладающего противосвертывающей активностью, что приводит к возникновению тромбоцитарного тромбоза. Кроме того, не было предложений, касающихся проблемы вымывания соединения, обладающего противосвертывающей активностью, из субстрата.

В последние годы изучалась иммобилизация соединения, обладающего противосвертывающей активностью, не являющегося гепарином, посредством излучения (см. патентный документ 4). С помощью указанного способа можно сдерживать понижение противосвертывающей активности посредством облучения с использованием излучения и, кроме того, можно утверждать, что вымывание из субстрата соединения, обладающего противосвертывающей активностью, в некоторой степени уменьшается. Однако, согласно способу иммобилизации одного лишь соединения, обладающего противосвертывающей активностью, может подавляться естественная реакция свертывания крови, но трудно подавить прикрепление тромбоцитов; таким образом, достаточный уровень противосвертывающей активности до сих пор не достигнут. Более того, вещества, не вступающие в реакции при облучении с использованием излучения, в указанном случае не принимаются во внимание, и уменьшение вымывания из субстрата соединения, обладающего противосвертывающей активностью, не может быть восстановлено.

Патентный источник 1: JP-A-H2003-507082

Патентный источник 2: JP-A-H2001-213984

Патентный источник 3: JP-A-H2004-525888

Патентный источник 4: JP-A-H2006-291193

Непатентный источник 1: Kazuo Ota, “Jinkoujinzounojissai (в исправленной форме 4)”, Nankodo, 1993, стр. 158-164

Непатентный источник 2: Tetsuzo Agishi et al. “Tousekinyumon”, Syujunsha, 1994, стр. 170-182

Непатентный источник 3: American journal of gematology. 2006 81(1), стр. 36-44

Непатентный источник 4: Journal Biomedical Materials Research. 1998 39, стр. 86-91

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Проблема, для решения которой предназначено настоящее изобретение

Принимая во внимание описанные выше проблемы, задачей настоящего изобретения является разработка субстрата, которому приданы противосвертывающие свойства, предпочтительно антитромбиновая активность и способность подавлять прикрепление тромбоцитов, и который обладает отличной совместимостью с кровью, а также разработка способа изготовления указанного субстрата, которые, кроме того, способны сокращать вымывание соединения, обладающего противосвертывающей активностью, и гидрофильного полимерного соединения.

1. Субстрат, включающий в себя соединение, обладающее активностью против свертывания крови, и гидрофильное полимерное соединение, в котором вымывание соединения, обладающего активностью против свертывания крови, в количественном отношении составляет менее 0,6 мкг/мл.

2. Субстрат согласно абзацу 1, в котором 1 нг/см² или более соединения, обладающего активностью против свертывания крови, содержится на поверхности субстрата.

3. Субстрат согласно абзацу 1 или 2, в котором соединение, обладающее активностью против свертывания крови, обладает антитромбиновой активностью, а адсорбция тромбина составляет 1,0 нг/см² или более.

4. Субстрат по любому из абзацев 1-3, в котором количество прикрепившихся тромбоцитов составляет 10/(4,3×10³ мкм²) или менее, а время свертывания крови продлевается на 10 секунд или более по результатам теста на свертываемость крови.

5. Субстрат по любому из абзацев 1-4, в котором относительное содержание гидрофильного полимерного соединения составляет 20% мас. или более.

6. Субстрат по любому из абзацев 1-5, в котором соединение, обладающее активностью против свертывания крови, содержит часть, обладающую активностью против свертывания крови, и часть, состоящую из полимерной цепи.

7. Субстрат согласно абзацу 6, в котором часть, состоящая из полимерной цепи, обладает гидрофильностью.

8. Субстрат согласно абзацу 7, в котором часть, состоящая из полимерной цепи, содержит по меньшей мере один из остатка пропиленгликоля, остатка поливинипирролидона, остатка полипропиленгликоля, остатка поливинилового спирта и остатка сополимера одного из указанных остатков.

9. Субстрат согласно абзацу 8, включающий в себя поливиниловый спирт, степень омыления которого составляет 50 мольных % или более и 99,9 мольных % или менее.

10. Субстрат по любому из абзацев 7-9, в котором соединение, обладающее активностью против свертывания крови, представляет собой 4-метоксибензолсульфонил-Asn (PEG2000-Ome)-Pro-4-амидинобензиламидо.

11. Субстрат по любому из абзацев 1-10, в котором гидрофильное полимерное соединение содержит по меньшей мере один агент, выбранный из группы, состоящей из поливинилового спирта, полиэфира, поливинилпирролидона и материала, состоящего из полиэфира и полисилоксана.

12. Субстрат согласно абзацу 11, в котором материал, состоящий из полиэфира и полисилоксана, представляет собой сополимер полиэфир/полисилоксан.

13. Субстрат согласно абзацу 11 или 12, в котором полиэфир включает в себя полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль.

14. Субстрат согласно абзацу 12 или 13, в котором содержание полипропиленгликоля в сополимере полиэфир/полисилоксан составляет 5 мольных % или более и 90 мольных % или менее.

15. Способ изготовления субстрата, в котором после того, как соединение, обладающее активностью против свертывания крови, и гидрофильное соединение, приведенные в контакт с субстратом, облучены с использованием излучения, отмывают непрореагировавшие компоненты.

16. Способ изготовления субстрата согласно абзацу 15, в котором после того, как соединение, обладающее активностью против свертывания крови, и гидрофильное соединение, приведенные в контакт с субстратом, облучены с использованием излучения, субстрат промывают с использованием поверхностно-активного агента.

17. Способ изготовления субстрата согласно абзацу 15 или 16, в котором, когда соединение, обладающее активностью против свертывания крови, и гидрофильное соединение, приведенные в контакт с субстратом, облучены с использованием излучения, субстрат облучают с использованием излучения, в то время как он содержит раствор органического растворителя, удовлетворяющий следующим условиям А и В:

А: Содержание влаги составляет 25 об.% или более или 90 об.% или менее;

В: Содержится по меньшей мере одна вторичная или третичная гидроксильная группа.

18. Способ изготовления субстрата по любому из абзацев 15-17, в котором, когда соединение, обладающее активностью против свертывания крови, и гидрофильное соединение, приведенные в контакт с субстратом, облучены с использованием излучения, субстрат облучают с использованием излучения, в то время как он содержит буферный раствор с рН 3 или более и 10 или менее.

ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению, крайне высокие противосвертывающие свойства можно придать поверхности субстрата внедрением соединения, обладающего противосвертывающей активностью, и гидрофильного полимерного соединения, на поверхность субстрата. В результате использование антикоагулянтов, добавленных в кровь во время экстракорпоральной циркуляции, можно сократить, как и при вариантах использования, при которых кровь и материал контактируют между собой, а также нет необходимости использовать указанные антикоагулянты в некоторых случаях и, таким образом, можно уменьшить риск, такой как риск неблагоприятных реакций на антикоагулянты, и, в конечном итоге, можно ожидать уменьшения затрат на медицинские цели.

Помимо этого, согласно способу изготовления по настоящему изобретению, радиационную привитую полимеризацию осуществляют на поверхности субстрата облучением соединения, обладающего противосвертывающей активностью, и гидрофильного полимерного соединения в контакте с субстратом в присутствии органического растворителя с использованием излучения и далее отмыванием непрореагировавших компонентов, в то же время сохраняя активность соединения, обладающего противосвертывающей активностью, таким образом, что риск вымывания соединения, обладающего противосвертывающей активностью, внедренного на поверхность субстрата, также может быть уменьшен.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 представляет собой схематичный вид сбоку, изображающий пример модуля полых волокон примеров 1 и 2 и сравнительных примеров 1 и 2 настоящего изобретения.

Фиг.2 представляет собой схематичный вид сбоку, изображающий пример мини-модуля полых волокон примеров 12-14 и сравнительных примеров 10-12 настоящего изобретения.

Фиг.3 представляет собой схематичную принципиальную диаграмму, изображающую контур, используемый для проверки циркуляции примеров 12-14 и сравнительных примеров 10-12 настоящего изобретения.

ОБЪЯСНЕНИЕ ОБОЗНАЧЕНИЙ

1 и 1' - порт для крови

2 и 2' - диализный порт

3 - корпус модуля

4 - полое волокно

5 - герметизирующий агент

6 - мини-модуль

7 - силиконовая трубка

8 - перистальтический насос

9 - полистироловая круглая пробирка или пробирка EIKEN № 1

10 - плазма или белковый раствор

11 - манометр

ОПТИМАЛЬНЫЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Субстрат по настоящему изобретению содержит соединение, обладающее противосвертывающей активностью, и гидрофильное полимерное соединение. Если на поверхность субстрата внедрено только лишь соединение, обладающее противосвертывающей активностью, активация реакции свертывания крови факторами свертывания может быть подавлена, но образование тромба и прикрепление тромбоцитов к субстрату полностью подавить невозможно, в случаях, когда кровь с ним контактирует, поскольку агрегацию тромбоцитов подавить нельзя. С другой стороны, если на поверхность субстрата внедрено только лишь гидрофильное полимерное соединение, агрегация тромбоцитов может быть подавлена, но активация факторами свертывания не может быть подавлена, и, таким образом, как в описанном выше случае, образование тромба полностью подавить невозможно. Иными словами, вопрос настоящего изобретения не может быть разрешен простым увеличением количества одного соединения. В настоящем изобретении, однако, только после того как субстрат стал содержать как соединение, обладающее противосвертывающей активностью, так и гидрофильное полимерное соединение, стало возможным подавление множества реакций свертывания и создание эффективного материала, обладающего противосвертывающими свойствами. Кроме того, в настоящем изобретении принимается во внимание вымывание соединения, обладающего противосвертывающей активностью, поскольку соединение, обладающее активностью против свертывания крови, обладает эффектом замедления времени свертывания и может вызывать неблагоприятные реакции. Посредством уменьшения вымывания до уровня менее 1 мкг/мл, предпочтительно менее 0,8 мкг/мл, более предпочтительно менее 0,6 мкг/мл, становится возможным сокращение неблагоприятных реакций, обусловленных соединением, обладающим противосвертывающей активностью, и количества внедренного в субстрат соединения, и также становится возможным достижение безопасности и снижение расходов, в результате чего решается проблема, являющаяся предметом настоящего изобретения.

В настоящем изобретении субстрат, содержащий соединение, обладающее противосвертывающей активностью, и гидрофильное полимерное соединение на своей поверхности, представляет собой субстрат, на поверхности которого присутствуют соединение, обладающее противосвертывающей активностью, и гидрофильное полимерное соединение. Соединение, обладающее противосвертывающей активностью, и гидрофильное полимерное соединение могут быть напрямую связаны между собой или могут быть не связаны. Однако предпочтительно, чтобы указанные соединения были напрямую связаны между собой, поскольку, соответственно, вероятность того, что указанные соединения будут вымываться и не будут способны оказывать свое действие, становится меньше, и можно ожидать уменьшения вымывания указанных соединений. Связь в данном случае включает в себя химическую связь, такую как ковалентная связь, ионная связь, водородная связь, координационная связь, и гидрофобное взаимодействие, а ковалентная связь является предпочтительной, поскольку ковалентная связь представляет собой относительно прочную связь. Альтернативно связь может представлять собой комбинацию множества указанных связей. Способ формирования ковалентной связи, т.е. осуществление прививки соединения, обладающего противосвертывающей активностью, и гидрофильного полимерного соединения на поверхность субстрата, включает в себя органический химический способ посредством реакции нуклеофильного замещения и т.п. и радиационный химический способ посредством облучения с использованием ионизирующего излучения. Среди указанных способов радиационный химический способ является предпочтительным, поскольку количество побочных продуктов реакции меньше, и также субстрат может быть стерилизован правильным выбором типа и дозы излучения. Соединение, обладающее противосвертывающей активностью, и гидрофильное полимерное соединение можно обрабатывать одновременно или по отдельности. Гидрофильное полимерное соединение может служить компонентом, составляющим субстрат, посредством смешивания до однородной массы с сырым материалом во время изготовления субстрата, но в зависимости от типа субстрата, механических или химических свойств (например, прочность, хрупкость, поверхностный заряд и смачиваемость поверхности) субстрата может повреждаться. Следовательно, в указанном случае гидрофильное полимерное соединение может быть внедрено и иммобилизовано на поверхности субстрата, например, непосредственным контактированием водного раствора, содержащего гидрофильное полимерное соединение, с поверхностью субстрата. Если принять указанный способ внедрения/иммобилизации, область применимости может быть расширена, без необходимости подбора типа субстрата. Следовательно, становится возможным не только использование эффекта настоящего изобретения во множестве областей, но также легкое изменение типа гидрофильного полимерного соединения, чтобы оптимизировать субстрат для конкретного применения, что является более удобным с точки зрения функциональности и затрат на производство.

Способ подтверждения вымывания веществ особо не ограничивается, но способ измерения, описанный ниже, приводится в качестве примера. Например, набор ECA-T от компании HaemoSys используется в качестве реагента, а COATRON M1 (код 80 800 000) производства TECO Medical Instruments Production - в качестве аппарата. Область (для полого волокна - область поверхности внутри волокна, которая контактирует с кровью) (далее в настоящем документе называется областью А), которая контактирует с кровью, биогенным веществом или тканью организма, промывают с использованием 160 мкл человеческой плазмы на 1 см² в течение четырех часов. 80 мкл человеческой плазмы после промывки собирают и добавляют к ней 20 мкл дистиллированной воды. Указанный раствор определяют как пробный раствор. Немедленно после изготовления пробного раствора смешивают 100 мкл ECA протромбинового буфера, 30 мкл пробного раствора и 25 мкл субстрата ECA-T и помещают после инкубации при 37°С в течение 60 с в аппарат. Затем для измерения добавляют 50 мкл реагента ЕСА экарин. Заранее проводят измерение смешанного раствора 20 мкл водного раствора соединения, обладающего противосвертывающей активностью, или контрольной дистиллированной воды и 80 мкл человеческой плазмы с использованием той же методики, результаты которого используют в качестве калибровочной кривой, и количество соединения, обладающего противосвертывающей активностью, рассчитанное с использованием калибровочной кривой, определяют как количество вымывания.

Количество соединения, обладающего противосвертывающей активностью, на поверхности субстрата изменяется в зависимости от силы противосвертывающих свойств, но, если количество соединения слишком мало, возникает проблема, которая заключается в том, что противосвертывающий эффект является низким. Таким образом, что касается области А, количество соединения предпочтительно составляет 0,1 нг/см² или более, более предпочтительно 0,5 нг/см² или более, еще более предпочтительно 1 нг/см² или более и наиболее предпочтительно 50 нг/см² или более. Если, с другой стороны, количество соединения, обладающего противосвертывающей активностью, слишком велико, возникает проблема, которая заключается в том, что увеличиваются затраты и вымывание. Таким образом, количество соединения предпочтительно составляет 100 мкг/см² или менее, более предпочтительно 10 мкг/см² или менее и наиболее предпочтительно 1 мкг/см² или менее. Количество соединения, обладающего противосвертывающей активностью, на поверхности субстрата измеряют следующим образом: на основании содержания соединения, обладающего противосвертывающей активностью, относительно субстрата, количество соединения определяют в ходе последующего процесса, например, который представляет собой, главным образом, процесс промывки, вычитанием количества, удаленного с помощью процесса удаления непрореагировавших компонентов, которые не закрепились на субстрате, но способ этим не ограничивается. Также количество соединения можно рассчитать с использованием калибровочной кривой соединения, обладающего противосвертывающей активностью, полученной заранее, и с использованием количества адсорбции тромбина, путем измерения величины адсорбции тромбина, как описано ниже.

Соединение, обладающее противосвертывающей активностью, предпочтительно обладает антитромбиновой активностью. Соединение, обладающее антитромбиновой активностью, в настоящем изобретении представляет собой соединение, которое подавляет активность тромбина, который представляет собой вещество, связанное со свертываемостью крови. Величину адсорбции тромбина измеряют с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (метода ELISA), но способ этим не ограничивается. Подробно экспериментальный метод будет описан ниже, и количество тромбина, абсорбированного субстратом, в настоящем изобретении составляет, в отношении области А, предпочтительно 0,5 нг/см² или более и более предпочтительно 1,0 нг/см² или более.

Также, если количество гидрофильного полимерного соединения слишком мало, возникает проблема, которая заключается в том, что эффект подавления прикрепления тромбоцитов является низким. Субстрат в настоящем изобретении предпочтительно имеет 20% мас. или более поверхностной гидрофильной высокомолекулярной массы. В данном случае определяется поверхностная гидрофильная высокомолекулярная масса, если масса мономерной единицы гидрофильных полимеров (количество молей мономерной единицы х молекулярная масса мономерной единицы) на поверхности субстрата составляет (А), а масса мономерной единицы полимеров (количество молей мономерной единицы х молекулярная масса мономерной единицы), составляющих субстрат, на поверхности субстрата составляет (В), как соотношение, представленное А/(А+В). Поверхностная гидрофильная высокомолекулярная масса является параметром, представляющим степень гидрофильности на поверхности субстрата.

Поверхностную гидрофильную высокомолекулярную массу определяют измерением только поверхности субстрата, т.е. на глубину приблизительно до 10 нм от поверхности, с использованием рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (ESCA) (угол детектора с учетом угла падения рентгеновских лучей составляет 90 градусов). Иными словами, поверхностную гидрофильную высокомолекулярную массу определяют по изменениям величины площади спектров C1s и O1s до и после обработки субстрата. Поверхностная гидрофильная высокомолекулярная масса предпочтительно составляет 20% мас. или более и более предпочтительно 32% мас. Если поверхностная гидрофильная высокомолекулярная масса составляет менее 20% мас., эффект подавления прикрепления органических веществ, таких как белки и биогенные вещества, понижается.

Субстрат по настоящему изобретению имеет 10/(4,3×10³ мкм²) или менее прикрепленных человеческих тромбоцитов. Количество прикрепленных тромбоцитов представляет собой величину, определяемую как количество тромбоцитов, прикрепленных к поверхности субстрата на 4,3×10³ мкм² поверхности субстрата, когда субстрат и кровь находятся в контакте друг с другом в течение одного часа. Способ измерения количества прикрепленных тромбоцитов, который следует использовать, заключается в следующем: после того как образец встряхивают в гепаринизированной человеческой крови при 37°С в течение одного часа, образец промывают физиологическим раствором, компоненты крови иммобилизуют раствором глутарового альдегида и после медленного промывания и сушки (используется сушка при пониженном давлении до тех пор, пока скорость изменения веса не будет в пределах 2% до и после сушки в течение одного часа) поверхность образца изучают при увеличении 1500х под сканирующим электронном микроскопом, подсчитывают количество тромбоцитов в одном поле зрения (4,3×10³ мкм²) и среднюю величину от количеств тромбоцитов в 10 различных полях зрения вблизи от центра образца принимают за количество прикрепленных тромбоцитов (количества/4,3×10³ мкм²). Если количество прикрепленных человеческих тромбоцитов превышает 10/4,3×10³ мкм²), совместимость с кровью будет недостаточной, а также эффект подавления прикрепления органических веществ, таких как белки и биогенные вещества, будет недостаточным.

Далее, субстрат по настоящему изобретению предпочтительно продлевает время свертывания крови на 10 секунд или более, когда осуществляют эксперимент со свертыванием крови. В данном случае время свертывания крови измеряют с использованием Sonoclot (анализатор свертывания и функции тромбоцитов, производства US Sienco Inc.), но использование данного аппарат не является ограничением. В данном случае добавляют физиологический раствор таким образом, чтобы концентрация субстрата достигла 100 мкг/мл, 342 мкл человеческой крови и 14,8 мкл раствора глюконата кальция для инъекций (от компании Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.), и определяют продление времени с использованием набора SonACT и программы АСТ, которая представляет собой внутреннюю программу Sonoclot. Продление времени свертывания крови предпочтительно составляет 10 секунд или более и более предпочтительно 15 секунд или более.

Соединение, содержащее аминокислоту в качестве компонента, можно привести в качестве примера соединения, обладающего противосвертывающей активностью, используемого в настоящем изобретении. Аминокислота имеет различные функциональные группы в качестве боковых цепей и способна демонстрировать активность как благодаря самой аминокислоте, так и связыванию с активными группами. Соединение, содержащее аминокислоту в качестве компонента, представляет собой соединение, содержащее белки, составленные из α-аминокислот, и включает в себя, например, соединение, составленное только из аминокислот, такое как белок и пептид, и соединение, составленное из аминокислот и других компонентов, которые не являются аминокислотами, такое как гликопротеин, аминокислотный комплекс и аминоациладенилат.

Когда кровь приходит в контакт с инородным материалом, компоненты свертывания активируются для быстрого образования тромба. Если тромб образуется в контуре циркуляции или установке для диализа при экстракорпоральной циркуляции крови, как в случае искусственной почки, давление циркуляции возрастает, и, помимо того, что становится невозможной быстрая циркуляция крови, появляется риск обструкции кровеносного сосуда, если часть образовавшегося тромба проникнет в организм. Таким образом, в случае экстракорпоральной циркуляции крови необходимо добавлять в циркулирующую экстракорпорально кровь соединение, обладающее противосвертывающей активностью. Однако, если соединение, обладающее противосвертывающей активностью, добавляют в кровь пациентам немедленно после оперативного вмешательства или пациентам с кровотечением из пищеварительного тракта, у таких пациентов может появиться кровотечение. Таким образом, путем иммобилизации соединения, обладающего противосвертывающей активностью, на поверхности субстрата, используемого для экстракорпоральной циркуляции, становится возможным подавление свертывания крови без добавления в циркулирующую экстракорпорально кровь соединения, обладающего активностью против свертывания крови.

Соединение, обладающее противосвертывающей активностью, представляет собой соединение, которое продлевает протромбиновое время на 30% или более, когда соединение добавляют в кровь таким образом, что его концентрация достигает 10 мкг/мл, по сравнению со случаем, когда его не добавляют. Протромбиновое время можно измерить способом, описанным в следующем литературном источнике:

M. Kanai et al. “Rinsho Kensaho Teiyo (Clinical Examination Method Handbook), 30-е изд.” Kanehara & Co., Ltd., 1993, стр. 416-418.

Конкретно: 10% по объему 3,2% цитрата натрия и 90% по объему крови смешивают, 0,1 мл предварительно выделенной цитратной плазмы помещают в маленькую пробирку (внутренний диаметр 8 мм; длина 7,5 см) и пробирку помещают в баню с постоянной температурой 37°С для нагревания пробирки в течение приблизительно трех минут. В нее добавляют 0,2 мл реагента тканевый тромбопластин/кальций, который поддерживали при той же температуре, и в это же время запускают секундомер и после легкого встряхивания маленькой пробирки измеряют время до отложения фибрина, в то время как маленькая пробирка отстаивается в наклонном положении.

Соединение, обладающее противосвертывающей активностью, использующееся в настоящем изобретении, включает, например, гепарин, нафомостата мезилат, цитрат натрия, оксалат натрия, антитрипсин-α1, макроглобулин-α2, ингибитор С1, тромбомодулин и С-белок. Среди соединений, обладающих противосвертывающей активностью, существует соединение, демонстрирующее сильную активность против свертывания крови посредством подавления активности тромбина, т.е. соединение, обладающее антитромбиновой активностью.

В качестве соединений, обладающих антитромбиновой активностью по отношению к ультрачистой воде, можно назвать 4-метоксибензолсульфонил-Asn (PEG2000-Ome)-Pro-4-амидинбензиламидо (далее в настоящем документе иногда называемое соединением А), представленный следующей общей формулой

Химический агент 1

(где PEG представляет собой остаток полиэтиленгликоля (далее в настоящем документе называемого PEG) со среднечисленной молекулярной массой 2000, а Ме представляет собой метильную группу), ATIII и гирудин.

Если соединение, обладающее противосвертывающей активностью, содержит часть, состоящую из полимерной цепи, подобную соединению А, соединение может связываться с субстратом частью, состоящей из полимерной цепи, таким образом, что часть, обладающая активностью против свертывания крови, может предпочтительно связываться с субстратом, чтобы подавлять снижение активности. Часть, состоящая из полимерной цепи, по настоящему изобретению относится к молекулярной цепи, в которой повторяющиеся единицы, имеющие особую химическую структуру, связаны между собой ковалентной связью и молекулярная масса которой составляет 1000 или более. Указанная часть, состоящая из полимерной цепи, включает гидрофильную полимерную цепь, такую как остаток PEG, остаток поливинилпирролидона (далее в настоящем документе называемого PVP), остаток пропиленгликоля (далее в настоящем документе называемого PPG), остаток поливинилового спирта (далее в настоящем документе называемого PVA) и остаток сополимера одного из указанных остатков. Соединение, имеющее указанную гидрофильную полимерную цепь, может быть использовано особенно предпочтительно, поскольку растворимость в воде соединения, обладающего противосвертывающей активностью, уменьшается с меньшей вероятностью, производные, имеющие аминогруппу или карбоксильную группу, имеются в продаже, а способ изготовления соединения, обладающего противосвертывающей активностью, введением указанных производных в часть, состоящую из полимерной цепи, является относительно легким.

Гидрофильное полимерное соединение в настоящем изобретении относится к полимерному соединению, которое является растворимым в воде или не растворимым в воде, но может вступать в слабое взаимодействие с молекулами воды посредством электростатического взаимодействия или водородной связи. Полимерное соединение относится к соединению, среднечисленная молекулярная масса которого составляет 1000 или более. Примеры гидрофильного полимерного соединения включают в себя, например, PVA, PVP, PEG, PPG, материал, состоящий из полиэфира и полисилоксана, полиэтиленамин, полиаллиламин, поливиниламин, поливинилацетат, полиакриловую кислоту и полиакриламид, а также сополимер или привитой полимер из мономера указанных полимеров и другого мономера, но названными агентами не ограничивается. Среди них гидрофильное полимерное соединение, содержащее по меньшей мере один агент из материала, состоящего из полиэфира и полисилоксана, PVA, полиэфира и PVP, является подходящим для использования, и особенно материал, состоящий из полиэфира и полисилоксана, и PVA достигают высокого гидрофильного эффекта и являются предпочтительными. Материал, состоящий из полиэфира и полисилоксана, используемый в настоящем изобретении, включает в себя сополимер полиэфира и полисилоксана, полимерный комплекс и полимерный смешанный материал. Среди них сополимер является предпочтительным, поскольку сополимер имеет высокую растворимость в воде, и, таким образом, обработка с целью прививки с использованием водного раствора является возможной, так что риски воспламенения растворителя и возгорания в оборудовании для облучения с использованием излучения могут быть снижены. Сополимер полиэфир/полисилоксан состоит из полиэфирной единицы и полисилоксановой единицы, и образованный ими сополимер может представлять собой неупорядоченный сополимер, блок-сополимер или привитой полимер или смесь указанных сополимеров.

PPG и PEG являются подходящими для использования в качестве полиэфира, но по сравнению с PEG PPG является предпочтительным благодаря его более высокой гидрофобности, и, таким образом, он может иметь более сильное гидрофобное взаимодействие с субстратом, и, если, например, осуществляется прививка с использованием излучения, материал, состоящий из полиэфира и полисилоксана, можно эффективно привить на субстрат. В настоящем документе, если содержание PPG в полиэфире слишком сильно увеличивается, растворимость сополимера в воде понижается, и, таким образом, содержание PPG в полиэфире предпочтительно составляет 5 мольных % или более, более предпочтительно 10 мольных % или более и еще более предпочтительно 20 мольных % или более. С другой стороны, содержание PPG в полиэфире предпочтительно составляет 90 мольных % или менее, более предпочтительно 80 мольных % или менее и еще более предпочтительно 60 мольных % или менее. Содержание (в мольных %) PPG в настоящем изобретении рассчитывают по формуле (1):

Р = 100×(а)/(b). (1)

В данной формуле Р представляет собой содержание (в мольных %) PPG, (а) представляет собой количество PPG единиц в полиэфире, а (b) представляет собой количество эфирных PPG единиц в полиэфире. PPG единица в полиэфире относится к структуре, представленной следующей химической формулой:

Химический агент 2

Эфирная единица в полиэфире относится к структуре, представленной следующей химической формулой:

Химический агент 3

В представленной выше формуле R₁ представляет собой алкильную группу, имеющую шесть атомов углерода или менее. Содержание PPG можно измерить с использованием ядерной магнитно-резонансной спектроскопии (далее в настоящем документе называемой ¹Н-ЯМР) или подобного метода.

Помимо этого, полиэфир может быть сополимеризован, и PEG предпочтительно используется в качестве другого компонента сополимеризации, не являющегося PPG, в полиэфире, с учетом его легкой доступности. В материале, состоящем из указанного PEG и PPG, могут содержаться другие сополимеризационные компоненты в количествах, которые не ухудшают его эффект.

Что касается PVA как части, состоящей из полимерной цепи, соединения, обладающего противосвертывающей активностью, или PVA как гидрофильного полимерного соединения, PVA, имеющий низкую степень омыления, является предпочтительным, поскольку он обладает эффектом придавать субстрату дополнительную гидрофильность. В данном случае степень омыления представляет собой величину, определяемую формулой (4). В настоящем документе, если степень омыления является слишком низкой, растворимость в воде становится крайне низкой, и, таким образом, обработка поверхности субстрата может быть затруднительной. Следовательно, степень омыления предпочтительно составляет 50 мольных % или более, более предпочтительно 74 мольных % или более и еще более предпочтительно 78 мольных % или более. С другой стороны, если степень омыления является слишком высокой, растворимость в воде также становится ниже, что требует нагревания во время растворения и приводит к более низкой производительности, и, таким образом, слишком высокая степень омыления не является предпочтительной. Следовательно, степень омыления предпочтительно составляет 99,9 мольных % или менее, более предпочтительно 95 мольных % или менее и еще более предпочтительно 90 мольных % или менее.

Химический агент 4

Химический агент 5

(k) = (m)/((n)+(m))×100 (4)

Обозначения в формуле (4) следующие:

(k): степень омыления

(m): количество мономерных повторяющихся единиц, представленное формулой (2), в PVA

(n): количество мономерных повторяющихся единиц, представленное формулой (3), в PVA

В способе изготовления субстрата по настоящему изобретению используется способ, с помощью которого соединение, обладающее противосвертывающей активностью, и гидрофильное полимерное соединение в контакте с субстратом облучают с использованием излучения. В предпочтительном аспекте способа изготовления субстрата по настоящему изобретению используется способ облучения с использованием излучения указанных соединений в контакте с субстратом в присутствии органического растворителя.

Излучение, используемое в настоящем изобретении, представляет собой пучок частиц или электромагнитную волну высокой энергии, и указанное излучение включает в себя, например, α-лучи, β-лучи, γ-лучи, рентгеновские лучи, ультрафиолетовые лучи, пучок электронов и пучок нейтронов. Среди них предпочтительно используются γ-лучи и пучок электронов, так как их энергия особенно высока, и субстрат можно эффективно модифицировать. γ-лучи, рентгеновские лучи и пучок электронов являются подходящими для модификации субстрата как медицинского материала, поскольку субстрат одновременно можно стерилизовать, контролируя дозу.

В случае, когда субстрат облучают с использованием излучения, если доза облучения является слишком малой, становится затруднительным контролировать дозу, например вариабельность дозы, поглощаемой субстратом. Таким образом, доза облучения составляет предпочтительно 1 кГр или более и более предпочтительно 5 кГр. Если одновременно с модификацией субстрата, такого как медицинский материал, осуществляют стерилизацию, доза облучения предпочтительно составляет 10 кГр или более и более предпочтительно 20 кГр. В настоящем документе облучение избыточной дозой облучения повреждает субстрат, и, таким образом, доза облучения составляет предпочтительно 5000 кГр или менее, более предпочтительно 1000 кГр или менее и еще более предпочтительно 100 кГр или менее.

Если активность соединения, обладающего противосвертывающей активностью, уменьшается из-за облучения с использованием излучения, указанное уменьшение активности можно предотвратить органическим растворителем. Т.е. субстрат, посредством которого соединение, обладающее противосвертывающей активностью, приводится в контакт с кровью, облучают с использованием излучения в присутствии органического растворителя.

Органический растворитель, подходящий для использования в настоящем изобретении, включает в себя растворитель, содержащий гидроксильную группу. Гидроксильная группа обладает мощным стабилизирующим эффектом по отношению к радикалам, генерируемым в результате облучения с использованием излучения, представляет собой неионную функциональную группу, слабо взаимодействует с соединениями, имеющими большие поверхностные заряды, обладает малой силой окисления/восстановления и в малой степени вызывает денатурализацию соединений. В частности, вторичные и третичные гидроксильные группы обладают мощным стабилизирующим эффектом по отношению к радикалам, и, таким образом, в настоящем изобретении используется органический растворитель, имеющий по меньшей мере одну вторичную и третичную гидроксильную группу, например глицерин, пропиленгликоль (далее в настоящем документе называемый PG), изопропанол (далее в настоящем документе называемый IPA), 2-бутонол, 2,3-бутандиол и 1,3-бутандиол. В настоящем документе, поскольку органический растворитель, имеющий только первичные гидроксильные группы, такой как EG и этанол, обладает малым стабилизирующим эффектом по отношению к радикалам и является опасным, если содержание растворителя, обладающего высокой воспламеняемостью, такого как этанол, увеличивается, органический растворитель, имеющий только первичные гидроксильные группы, не включен в органические растворители в настоящем изобретении. Помимо этого, когда в настоящем изобретении используется способ стерилизации соединения для медицинского материала или при изготовлении содержащих его медицинских устройств, необходимо принимать во внимание их безопасность, и, следовательно, среди неводных растворителей, подходящими для использования являются растворители с более низкой токсичностью.

Верхний предел содержания влаги в водном растворе органического растворителя составляет 90 об.%, и если содержание влаги превышает 90 об.%, то невозможно достичь эффекта стабилизации радикалов, присущего органическому растворителю. В пределах 90 об.% или менее, чем выше содержание влаги, тем лучше. С другой стороны, если содержание влаги является низким, например при использовании в медицинских устройствах, на биосовместимость могут влиять остатки органического растворителя после промывки, и, помимо этого, например, при использовании для радиационной прививки можно думать о понижении эффективности прививки. Таким образом, содержание влаги предпочтительно составляет 25 об.% или более по отношению ко всему количеству растворителя и более предпочтительно 50 об.% или более.

В настоящем изобретении растворение соединения, которое является нестабильным по отношению к излучению, означает растворение соединения в органическом растворителе до однородной смеси. Дисперсия соединения, которое является нестабильным по отношению к излучению, означает дисперсию соединения в органическом растворителе. Концентрация соединения в органическом растворителе не ограничивается, но, если концентрация является слишком высокой, некоторые типы соединения могут утратить оригинальные физические свойства соединения после гелеобразования в силу прогрессирования реакции перекрестного сшивания, и, таким образом, концентрация соединения в органическом растворителе предпочтительно составляет 50% мас. или менее, более предпочтительно 30% мас. или менее и еще более предпочтительно 20% мас. или менее.

Содержание влаги в настоящем изобретении определяется следующей формулой:

(Объем воды, содержащейся в соединении, которое является нестабильным по отношению к излучению, и в водном растворе органического растворителя, который растворяет и/или диспергирует соединение)/(Объем соединения, которое является нестабильным по отношению к излучению, и органического растворителя, который растворяет и/или диспергирует соединение) х 100 (%)

Способ, который обеспечивает контакт соединения, обладающего противосвертывающей активностью, с субстратом в присутствии органического растворителя включает в себя способ, посредством которого соединение, обладающее активностью против свертывания крови, растворяют или диспергируют в органическом растворителе, а субстрат опускают в полученную жидкость или полученную жидкость наносят на субстрат. В данном случае растворение соединения, обладающего противосвертывающей активностью, означает образование однородной смеси, т.е. раствора, после растворения соединения в растворителе. Диспергирование соединения, обладающего противосвертывающей активностью, означает диспергирование соединения в растворителе в коллоидном состоянии или состоянии мицелл. Если соединение, обладающее противосвертывающей активностью, трудно растворить в желаемом органическом растворителе, после того как раствор, полученный растворением соединения, обладающего противосвертывающей активностью, в растворителе, имеющем высокую растворимость, касающуюся соединения, обладающего противосвертывающей активностью, приведен в контакт с субстратом, растворитель можно заменить на желаемый органический растворитель. В данном случае растворитель, в котором растворено соединение, обладающее противосвертывающей активностью, может представлять собой неорганический растворитель, такой как вода. Т.е., после того как субстрат был приведен в контакт с раствором, полученным растворением соединения, обладающего противосвертывающей активностью, в воде, воду заменяют на органический растворитель, а субстрат облучают с использованием излучения.

В настоящем изобретении соединение, обладающее противосвертывающей активностью, можно наносить на субстрат или абсорбировать на субстрате заблаговременно, а субстрат, к которому присоединено соединение, можно погружать в органический растворитель.

Буфер, используемый для соединения, обладающего противосвертывающей активностью, и гидрофильного полимерного соединения, в настоящем изобретении представляет собой раствор, изготовленный таким образом, чтобы величина их рН не изменялась даже при добавлении малого количества кислоты или основания и изменении их концентрации, и включает в себя, например, фосфатный буфер, трис-гидроксиметиламинометановый буфер (далее в настоящем документе называемый Tris), бис-(2-гидроксиэтил)имино-трис-(гидроксиметил)метановый буфер (далее в настоящем документе называемый Bis-Tris), ацетатный буфер, цитратный буфер и боратный буфер. Среди указанных буферов для использования подходящими являются фосфатный буфер, Tris-буфер и Bis-Tris буфер, поскольку указанные буферы обладают буферным действием в нейтральных и кислотных областях и часто добавляются в качестве растворителей для соединений, обладающих физиологической активностью. В настоящем документе пределы буфера составляют рН 3 или более и предпочтительно 5 или более, поскольку в условиях высокой кислотности, при рН 3 или менее, или в условиях высокой основности, при рН 10 или более, часть молекулярной структуры соединений, обладающих физиологической активностью, изменяется, что приводит к изменениям их физической функции, химической функции или физиологической функции, а когда, например, создают иммобилизующий прививку материал, поведение самого материала, как полагают, ухудшается. Верхний предел составляет рН менее 10 и предпочтительно 8 или менее. Для измерения рН можно использовать способ с использованием стеклянного электрода, но способ измерения указанным способом не ограничивается, до тех пор, пока рН можно измерять с эквивалентной точностью. Раствор, содержащий буфер, используемый в настоящем изобретении, означает водный раствор буфера или раствор, содержащий другие растворители или растворы, но не означает раствор, который изменяется до значений рН, лежащих вне пределов буфера, как раствор целиком, содержащий буфер, и предпочтительно представляет собой раствор, рН которого не изменяется.

В настоящем изобретении антиоксидантный агент можно использовать в комбинации, когда соединение, обладающее активностью против свертывания крови, и гидрофильное полимерное соединение контактируют с субстратом. Указанный антиоксидантный агент используют, поскольку от него можно ожидать эффекта улавливания гидроксильных радикалов, генерированных в результате облучения с использованием излучения, чтобы подавлять денатурацию соединения, обладающего противосвертывающей активностью. Антиоксидантный агент, используемый в настоящем изобретении, представляет собой соединение, имеющее молекулы, обладающие свойствами с большей вероятностью быть донорами электронов для других молекул, а также свойствами подавлять денатурацию субстрата, а также соединение, имеющее молекулы, обладающие свойствами предохранять субстрат, соединение, обладающее активностью против свертывания крови, и гидрофильное полимерное соединение, от денатурации, вызываемой излучением.

Примеры антиоксидантных агентов включают в себя водорастворимые витамины, такие как витамин С; полифенолы; минеральные соли, такие как гидросульфит натрия, пиросульфит натрия и дитионат натрия; мочевую кислоту; цистеин и глутатион, но не ограничивается ими. Указанные антиоксидантные агенты используют по отдельности или в комбинации двух или более их видов.

Поскольку необходимо принимать во внимание безопасность, когда субстрат по настоящему изобретению используется в медицинских устройствах, используют антиоксидантный агент с более низкой токсичностью. Концентрация антиоксидантного агента зависит от типа используемого антиоксидантного агента и от дозы облучения с использованием излучения, и, таким образом, можно использовать оптимальную концентрацию в соответствии с обстоятельствами.

Для того чтобы уменьшить вымывание соединения, обладающего противосвертывающей активностью, и гидрофильного полимерного соединения, после того как указанные соединения внедрены на поверхность субстрата, субстрат можно промывать до, после или и до, и после облучения с использованием излучения. Поскольку соединение, обладающее противосвертывающей активностью, и гидрофильное полимерное соединение присоединены к поверхности субстрата посредством ковалентных связей, особенно после облучения с использованием излучения, существует малый риск того, что соединение, обладающее противосвертывающей активностью, и гидрофильное полимерное соединение будут избыточно удаляться с поверхности даже при чрезмерной промывке. Кроме того, непрореагировавшие компоненты и побочные продукты можно удалять промывкой, и, таким образом, субстрат без опасений можно использовать, в частности, для медицинских целей. Для промывки можно использовать воду, физиологический раствор, рН буфер или органический растворитель. Хорошим очищающим действием обладает раствор поверхностно-активного агента.

Поверхностно-активный агент в настоящем изобретении означает общепринятый поверхностно-активный агент и представляет собой вещество, которое демонстрирует сильную поверхностную активность по отношению к воде, и имеет в своей молекуле как гидрофильную часть, так и гидрофобную (липофильную) часть. Когда используется субстрат, имеющий ионную функциональную группу, или гидрофильное полимерное соединение, если из поверхностно-активных агентов используется ионогенный поверхностно-активный агент, возможностью изменения физических свойств поверхности вследствие образования ее связей с поверхностно-активным агентом в результате электростатического взаимодействия нельзя пренебречь. Таким образом, предпочтительно использовать неоиногенный поверхностно-активный агент. Среди неоиногенных поверхностно-активных агентов отличным моющим действием обладают алкилфениловый эфир полиоксиэтилена и алкиловый эфир полиоксиэтилена.

В настоящем изобретении поверхностно-активный агент часто представляет собой твердое вещество или вязкую жидкость, и при использовании для промывки поверхностно-активный агент предпочтительно представляет собой жидкость, исходя из удобства использования. Если концентрация раствора является слишком низкой, невозможно добиться достаточного моющего эффекта, и, наоборот, если концентрация раствора является слишком высокой, субстрат может быть поврежден, а издержки производства возрастут. Следовательно, концентрация раствора поверхностно-активного агента предпочтительно составляет 0,001% мас. или более, более предпочтительно 0,005% мас. или более и еще более предпочтительно 0,01% мас. или более. С другой стороны, верхний предел концентрации предпочтительно составляет 20% мас. или менее, более предпочтительно 10% мас. или менее и еще более предпочтительно 5% мас. или менее.

Можно использовать любой способ промывки субстрата, с помощью которого моющий агент, такой как поверхностно-активный агент, и раствор, в который добавлен поверхностно-активный агент, приводится в контакт с субстратом, таким образом, что избыток соединения, обладающего противосвертывающей активностью, и гидрофильного полимерного соединения вымывается. Например, способ промывки, с помощью которого моющий агент пропускают с заранее определенной скоростью потока в заранее определенном направлении, является наиболее эффективным и может хорошо промывать субстрат. Также способ погружения субстрата в поверхностно-активный агент можно использовать как способ промывки. Например, поверхностно-активный агент и раствор, полученный добавлением поверхностно-активного агента, можно использовать в качестве заполняющей жидкости в модуле очистки крови. В случае, когда поверхностно-активный агент или раствор, полученный добавлением поверхностно-активного агента, проходит к субстрату в заранее определенном направлении, поверхностно-активный агент или раствор может циркулировать вокруг субстрата, но повторное использование поверхностно-активного агента, в который вымывалось соединение, обладающее противосвертывающей активностью, гидрофильное полимерное соединение и т.п., может привести к ухудшению моющей эффективности. Если скорость потока, когда моющую жидкость пропускают с заранее определенной скоростью потока для промывки, является слишком низкой, можно не получить достаточного моющего эффекта. Если скорость потока является слишком высокой, время промывки будет больше, что приводит к более низкой производительности. Следовательно, скорость потока на единицу площади поверхности субстрата предпочтительно составляет 0,5 л/м² или более, более предпочтительно 1 л/м² или более и еще более предпочтительно 3 л/м² или более. С другой стороны, верхний предел скорости потока предпочтительно составляет 300 л/м² или менее, более предпочтительно 200 л/м² или менее и еще более предпочтительно 100 л/м² или менее.

Путем дальнейшей промывки водой или физиологическим раствором после промывки субстрата поверхностно-активным агентом можно предотвратить сохранение остатков поверхностно-активного агента на субстрате. Фраза «промывка водой или физиологическим раствором» означает промывку с использованием воды и физиологического раствора по отдельности.

Путем промывки субстрата до облучения с использованием излучения количество соединения, обладающего активностью против свертывания крови, и гидрофильного полимерного соединения, которое не привилось, можно уменьшить так, что промывку после облучения с использованием излучения можно уменьшить.

В качестве субстрата в настоящем изобретении предпочтительно используется полимерный материал. Примеры полимерного соединения, составляющего полимерный материал, включают в себя, например, полиметакрилат, такой как полиметилметакрилат (далее в настоящем документе называемый РММА), полиакрилат, полипропилен, полиэтилен, поливинилхлорид, поливинилиденхлорид, поливинилиденфторид, поливинилацетат, поликарбонат, целлюлозу, ацетат целлюлозы, триацетат целлюлозы, полиакрилонитрил, полиамид, полисульфон (далее в настоящем документе называемый PSf), полиэфирсульфон, полистирол, полиэфир и полиуретан, но не ограничиваются ими.

Субстрат по настоящему изобретению может, соответственно, использоваться в качестве медицинского субстрата. Примеры медицинского субстрата включают в себя искусственный сосуд, катетер, пакет для крови, контактную линзу, внутриглазную линзу и вспомогательные устройства для операций, а также включают в себя сепарационную пленку и адсорбент, содержащиеся и используемые в модуле для разделения биогенных веществ и в модуле очистки крови. В настоящем изобретении модуль для разделения биогенных веществ представляет собой модуль, который разделяет биогенные вещества путем фильтрации, диализа, адсорбции и т.п. для сбора части из них, и не ограничивается медицинским субстратом. Модуль очистки крови представляет собой модуль, выполняющий функцию удаления отходов и токсичных веществ путем адсорбции, фильтрации и диффузии, когда кровь циркулирует экстракорпорально, и включает в себя, конкретно, искусственную почку, ее колонку на входе или выходе и колонку адсорбции экзотоксинов.

Форма сепарационной пленки, содержащейся в модуле очистки крови, специально не ограничивается и используется в форме плоской пленки или полого волокна. Полое волокно обычно имеет большую площадь поверхности на объем жидкости для обработки, и потери давления можно минимизировать таким образом, чтобы способ по настоящему изобретению можно было применять с наибольшей эффективностью. Более маленький внутренний диаметр полого волокна является предпочтительным для увеличения площади поверхности на объем жидкости для обработки и предпочтительно составляет 1000 мкм или менее и более предпочтительно 500 мкм или менее. С другой стороны, плоская пленка имеет то преимущество, что ее легко производить при низких затратах на производство. Материалы для указанных пленок включают в себя целлюлозу, ацетат целлюлозы, поликарбонат, PSf, полиэфирсульфон, полиметакрилат, такой как РММА, полиакрилат, полиамид, поливинилиденфторид, полиакрилонитрил, полиэфир, полиуретан, полистирол, полиэтилен, полипропилен и материал, включающий в себя по меньшей мере один материал, выбранный из группы, состоящей из указанных производных. Среди них РММА может быть присоединено к гидрофильному полимерному соединению, такому как PEG, посредством водородных связей, и когда указанное гидрофильное полимерное соединение иммобилизуют на субстрате посредством ковалентных связей с помощью облучения или т.п., имеет место эффективная иммобилизация, и, таким образом, РММА является подходящим материалом. PSf, в последнее время часто используемый в установках для диализа, имеет отличные характеристики фракционирования и, таким образом, представляет собой предпочтительный материал.

Биогенное вещество в настоящем изобретении относится к клетке, белку, нуклеиновой кислоте, сахару и липиду, полученным из живого организма, или к их комплексам. Также клетки, культивированные in vitro, и генетически модифицированный белок определяются как биогенные вещества. Среди биогенных веществ субстрат по настоящему изобретению является подходящим, когда обрабатываются компоненты крови, т.е. клетки, такие как кровяные тельца и тромбоциты, и компоненты плазмы, такие как белок плазмы.

Субстрат по настоящему изобретению и способ его изготовления далее будут описаны со ссылкой на примеры, но настоящее изобретение не ограничивается указанными примерами.

ПРИМЕР

(Эксперимент с экстракорпоральной циркуляцией у свиньи)

(1) Изготовление контура циркуляции

Использовали контур для крови искусственной почки (“Artificial kidney blood curcuit H-102-KTS”, продаваемый Toray Medical Co., Ltd.) и агрегат для измерения давления в контуре и насос для крови (“MedTech Line Flow LF-300” производства MedTech).

Физиологический раствор (1 л) (производства завода Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) подготавливали и пропускали через модуль для крови искусственной почки со скоростью потока 100 мл/мин в течение пяти минут для промывки. Затем контур, начиная от порта для крови на стороне выхода крови, соединяли с портом для диализной жидкости на стороне входа диализной жидкости и непрерывно пропускали физиологический раствор через модуль диализной жидкости искусственной почки со скоростью потока 100 мл/мин в течение 10 минут для промывки. В том случае, когда пузырьки невозможно было эффективно удалить, сторону диализной жидкости закупоривали и циркуляцию физиологического раствора осуществляли пропусканием через сторону крови со скоростью потока 100 мл/мин.

(2) Подготовка животного и экспериментальная операция

Определяли массу тела свиньи, предназначенной для использования в эксперименте. Использовали миниатюрную свинью («мини-пиг»), масса тела которой находилась в пределах 11,5 кг или более и 13,5 кг или менее. Для осуществления наркоза интраперитонеально вводили 40 мг пентобарбитала натрия («Раствор нембутала для инъекций» от компании Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) на кг массы тела. После проверки состояния анестезии свинью фиксировали на операционном столе в положении на спине. Шейную часть (внутренние части обеих задних конечностей) выбривали с использованием парикмахерской машинки для стрижки волос. После дезинфекции с использованием этанола и раствора иод-повидона (“Isodine” от компании Meiji Seika Kaisha Co., Ltd.) осуществляли разрез для доступа к сонной артерии и яремной вене (бедренной артерии и бедренной вене) и помещали в них катетер для экстракорпоральной циркуляции (“Atom vein catheter (8Fr)” производства Terumo Corporation) и фиксировали в каждой артерии и вене. Катетер заполняли с использованием шприца 10 мл раствором гепарина (5 МЕ/мл) и закрывали. Гепарин использовали только для заполнения катетера после его помещения в сосуд.

(3) Начало экстракорпоральной циркуляции

Коннектор на стороне входа крови (сторона А) в контуре циркуляции крови и катетер в артерии соединяли, чтобы заменить заполняющую жидкость (физиологический раствор) кровью в модуле искусственной почки на стороне для крови. В то же время сторону выхода крови (сторона V) контура циркуляции крови держали в открытом состоянии. Насос останавливали одновременно с завершением замены и коннектор на стороне V соединяли с катетером на венозной стороне. Насос вновь приводили в действие (повторный старт осуществляли вскоре после остановки насоса, и при данном соединении время простоя насоса составляло приблизительно 10 секунд), чтобы начать циркуляцию. Скорость потока циркуляции крови устанавливали на 200 мл/мин. Насос на стороне диализной жидкости приводили в действие после окончания сбора крови через пять минут после начала циркуляции, чтобы начать диализ. Насос для замены жидкости настраивали таким образом, чтобы гематокрит во время экстракорпоральной циркуляции находился в пределах 38±6%.

(4) Измерение

Для измерения давления циркуляции крови устанавливали манометр в контуре между насосом для крови и портом для крови на стороне входа крови, и давление отмечали через 1, 5, 15, 30, 60, 120, 180 и 240 минут после начала циркуляции в (3).

(Изготовление модуля полых волокон (модуль (0)))

5 массовых частей изо-РММА и 20 массовых частей син-РММА секции 20 добавляли к 75 массовым частям диметилсульфоксида для получения неразбавленного раствора для изготовления пленки, после перемешивания при 110°С в течение восьми часов. Неразбавленный раствор для изготовления пленки выпускали из отверстия типа двойного цилиндрического мундштука и проводили в баню для коагуляции из 100% воды после пропускания через воздух на 300 мм для получения полого волокна. Сухой азот использовали в качестве форсуночного газа. Внутренний диаметр полученного полого волокна составлял 0,2 мм, а его толщина составляла 0,03 мм.

Фиг.1 представляет собой схематичный вид сбоку, изображающий пример модуля полых волокон. 11000 полых волокон 4 из PMMA, изготовленных, как описано выше, соединяли в пучок и оба его конца фиксировали к корпусу модуля 3 с использованием уретанового герметизирующего агента 5 таким образом, чтобы полая часть не перекрывалась, для создания модуля полых волокон со структурой, показанной на фиг.1. Его эффективная площадь составляла 1,3 м². Подобно распространенному диализатору типа полых волокон, модуль имеет два порта (порты для крови 1), ведущих во внутреннюю часть полого волокна, и два порта (порты для диализной жидкости 2), ведущих наружу. Полые волокна модуля полых волокон и внутреннюю часть модуля промывали с использованием дистиллированной воды, чтобы получить модуль полых волокон (модуль (0)).

(Изготовление буфера)

Буфер с рН 5 изготавливали растворением Bis-Tris (от компании Dojindo Laboratories) и хлорида натрия (от компании Sigma Aldrich) в сверхчистой воде таким образом, чтобы концентрации составили 0,05 М и 0,1 М соответственно с целью получения раствора с рН 5 при добавлении по каплям 6 Н хлористоводородной кислоты (от компании Sigma Aldrich). Для измерения рН использовали способ стеклянных электродов и рН-метр Custany LAB F-22 производства HORIBA. В результате величина рН составила 5,0. В качестве другого буфера с рН 5 изготавливали также ацетатный буфер. Ацетатный буфер изготавливали растворением уксусной кислоты и ацетата натрия в сверхчистой воде (конечные концентрации составили 0,05 М и 0,1 М соответственно). Результат измерения рН по методике, описанной выше, составил 5,0.

Буферы с рН 7,8 и 10 изготавливали растворением Tris (от компании Katayama Chemical Industries Co., Ltd.) и хлорида натрия (от компании Sigma Aldrich) в сверхчистой воде таким образом, чтобы концентрации составили 0,05 М и 0,1 М соответственно с целью получения растворов с указанными величинами рН, при добавлении по каплям 6 Н хлористоводородной кислоты (от компании Sigma Aldrich). Для измерения рН использовали тот же способ, что и для буфера с рН 5. В результате величины рН буферов составили 7, 8 и 10.

Пример 1

Изготавливали раствор (раствор А) растворением соединения А и соединения В, представляющего собой сополимер (F-3031 (серия 410104) от компании Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.) полиэфира и полисилоксана, в Tris буфере с рН 7,8, таким образом, чтобы их концентрации соответствовали перечисленным в таблице 1, и 0,5 л раствора А запускали со скоростью потока 160 мл/мин от одного порта для крови 1 внутри модуля (0) полых волокон 4 и выпускали из другого порта для крови, пропуская через полые волокна 4, и запускали в порт для диализной жидкости 2' на стороне порта для крови 1' через трубку (не показана) и выпускали из другого порта для диализной жидкости 2 (далее в настоящем документе указанная последовательность называется «последовательностью 1) для циркуляции в течение 15 мин. Впоследствии физиологический раствор запускали со скоростью потока 100 мл/мин с использованием насоса от одного порта для крови 1 внутри полых волокон 4 и до порта для диализной жидкости 2' в течение 75 мин для получения модуля (1).

Модуль (1) использовали в эксперименте с экстракорпоральной циркуляцией крови у свиньи. Таблица 2 показывает результаты экспериментов с давлением циркуляции. В течение 240 минут после начала циркуляции повышения давления не наблюдалось.

Пример 2

Раствор (раствор В) изготавливали при тех же условиях, которые описаны в примере 1, за исключением того, что соединение А, соединение В и IPA (код 10982-7, от компании Aldrich) растворяли таким образом, чтобы их концентрации соответствовали перечисленным в таблице 1, и 2 л раствора В циркулировали со скоростью потока 500 мл/мин через модуль (0) под действием насоса, согласно последовательности 1, в течение 15 мин. Затем модуль (0) облучали с использованием γ-лучей, в то время как порты всех четырех локализаций были закрыты. Поглощенная доза γ-излучения составляла 26 кГр. Внутреннюю поверхность модуля промывали следующим образом: 5 л водного раствора 0,025 об.% октилфенилового эфира полиоксиэтилена (код 30-5140-5, производства компании Sigma Aldrich (далее в настоящем документе называемого TritonX-100)) при 25°С циркулировали со скоростью потока 500 мл/мин под действием насоса, согласно последовательности 1, в течение четырех часов для промывки. Затем аналогичную промывку осуществляли вновь с использованием 5 л водного раствора 0,025 об.% TritonX-100 в течение четырех часов. Впоследствии 50 л сверхчистой воды при 25°С циркулировали со скоростью потока 500 мл/мин, согласно последовательности 1. Затем физиологический раствор запускали со скоростью потока 100 мл/мин с использованием насоса от одного порта для крови 1 внутри полых волокон 4 и до порта для диализной жидкости 2' в течение 75 мин для получения модуля (2).

Модуль (2) использовали в эксперименте с экстракорпоральной циркуляцией крови у свиньи. Таблица 2 показывает результаты экспериментов. В течение 240 минут после начала циркуляции повышения давления не наблюдалось.

Сравнительный пример 1

Модуль (3) получали с использованием того же способа, который описан в примере 1, за исключением того, что концентрация соединения В в растворе А в примере 1 составляла 0 миллионных долей масс. Модуль (3) использовали в эксперименте с экстракорпоральной циркуляцией крови у свиньи. Таблица 2 показывает результаты экспериментов. Наблюдалось повышение давления циркуляции через 60 минут после начала циркуляции, которое достигало 49,3 кПа через 240 минут после начала циркуляции.

Сравнительный пример 2

Модуль (0) использовали в эксперименте с экстракорпоральной циркуляцией крови у свиньи. Таблица 2 показывает результаты экспериментов. Наблюдалось повышение давления циркуляции через 60 минут после начала циркуляции, которое достигало 65,1 кПа через 155 минут после начала циркуляции. Немедленно после этого циркуляция стала невозможной и насос был остановлен.

  Таблица 1 (кПа)   Концентрация
IPA (об.%) Концентрация
соединения А
(массовые
миллионные доли) Концентрация
соединения В
(массовые
миллионные доли) Пример 1 - 30 30 Пример 2 10 100 100 Сравнительный пример 1 - 30 0 Сравнительный пример 2 - 0 0

  Таблица 2 (кПа) Время
циркуляции Пример 1 Пример 2 Сравнительный
пример 1 Сравнительный
пример 2 1 23,5 27,5 30,9 25,9 5 21,6 27,3 28,0 28,0 15 22,4 27,5 26,8 29,5 30 26,3 27,7 27,9 31,6 60 23,6 27,9 28,5 30,4 120 23,7 29,1 38,7 36,7 180 24,8 30,1 46,7 ¹⁾ 65,1 240 25,1 30,3 49,3 - ¹⁾ Величина при времени циркуляции 155 мин

Пример 3

(1) Создание базового материала

Изготавливали раствор 18 массовых частей PSf (“Udel” P-3500 от компании Teijin Amoco), 6 массовых частей PVP (K90 от компании BASF), 72 массовых частей N,N-диметилацетамида (далее в настоящем документе называемого DMAc) и 1 массовой части воды. Впоследствии раствор наносили на стеклянные предметные стекла, сложенные друг с другом с прокладкой толщиной 0,1 мм, и распределяли как пленку с использованием шпателя, а затем немедленно стеклянные предметные стекла опускали в раствор, изготовленный из 52 массовых частей DMAc и 48 массовых частей воды, для отверждения пленки; пленка затвердевала, и ее отслаивали от стеклянных предметных стекол, чтобы получить базовый материал.

(2) Способ обработки для иммобилизации соединения А и соединения В

Изготавливали раствор, как описано для раствора В в примере 2, и по 5 мл указанного раствора разливали в центрифужные пробирки объемом 15 мл (производства IWAKI). Базовый материал, изготовленный в (1), свертывали в трубочку и помещали в центрифужную пробирку таким образом, чтобы его поверхность не перекрывалась. Центрифужную пробирку облучали с использованием γ-лучей при сохранении стандартного положения, при котором базовый материал погружен в раствор В. В указанный момент доза облучения составляла 25 кГр. Базовый материал после облучения с использованием излучения промывали раствором 0,025 об.% TritonX-100, который является поверхностно-активным агентом, сверхчистой водой и затем физиологическим раствором, до полного исчезновения пузырьков поверхностно-активным агента.

(3) Способ оценки

1 мл физиологического раствора добавляли в каждую ячейку 24-ячеечной чашки (производства компании Sumimoto Bakelite Co., Ltd.). Базовый материал, обработанный в (2), нарезали на пленки в форме квадрата со стороной 1 см и все три пленки помещали в ячейки, по одной пленке на ячейку. Затем, немедленно после помещения базового материала в пустую ячейку, у добровольца брали цельную кровь, 1 мл крови добавляли в каждую ячейку и чашку встряхивали. По истечении заданного времени (из-за индивидуальных различий время не было стандартизовано, подготавливали ячейку с кровью без базового материала и время, по истечении которого появлялась отчетливая вязкость, определяли как время погружения в кровь), т.е. по истечении времени погружения в кровь, базовый материал извлекали и осторожно дважды промывали свежим физиологическим раствором. Базовый материал после промывки осматривали визуально и оценивали степень свертывания по шкале от 1 до 5, в зависимости от степени прикрепления кровяного сгустка, чтобы подсчитать среднюю величину. Среднюю величину определяли округлением величины до ближайшего целого числа. Степень свертывания представляли в пределах от 1 (полное отсутствие кровяного сгустка) через 3 (кровяные сгустки были прикреплены приблизительно на половине площади базового материала) до 5 (кровяные сгустки были прикреплены повсюду). Сумма баллов 2 указывает, что кровяные сгустки прикреплены приблизительно на одной четвертой площади базового материала, а сумма баллов 4 указывает, что кровяные сгустки прикреплены приблизительно на трех четвертях площади базового материала. В случае, когда состояние прикрепления кровяных сгустков было таково, что балльность невозможно было определить, состояние расценивали как сумму баллов ближайшего состояния, чтобы определить сумму баллов каждого базового материала. В результате сумма баллов составляла 1.

Сравнительный пример 3

Базовый материал создавали при тех условиях, которые были описаны для примера 3, за исключением того, что соединение А не иммобилизовывали в (2) примера 3, а сумма баллов составляла 4 в результате оценки, произведенной так же, как в (3) примера 3.

Сравнительный пример 4

Базовый материал создавали при тех условиях, которые были описаны для примера 3, за исключением того, что соединение В не иммобилизовывали в (2) примера 3, а сумма баллов составляла 3 в результате оценки, произведенной так же, как в (3) примера 3.

Сравнительный пример 5

Базовый материал создавали при тех условиях, которые были описаны для примера 3, за исключением того, что соединения А и В не иммобилизовывали в (2) примера 3, а сумма баллов составляла 5 в результате оценки, произведенной так же, как в (3) примера 3.

(Измерение величины антитромбиновой активности)

В качестве показателя антитромбиновой активности использовали коэффициент остаточной антитромбиновой активности после облучения с использованием излучения. Для измерения антитромбиновой активности использовали набор ЕСА-Т от HaemoSys в качестве реагента и COATRON M1 (код 80 800 000) производства TECO Medical Instruments Production - в качестве аппарата. Сначала 20 мкл раствора, в котором должно быть произведено измерение, добавляли к 80 мкл человеческой плазмы (Human Plasma 12271210, партия 16878, продается компанией Cosmo Bio Co., Ltd.) и перемешивали. Раствор определяли как пробный раствор. Пробный раствор охлаждали на ледяной бане непосредственно перед измерением. 100 мкл ECA протромбинового буфера, 30 мкл пробного раствора и 25 мкл субстрата ECA-T смешивали и инкубировали при 37°С в течение 60 с перед помещением в аппарат. К смеси добавляли 50 мкл реагента ЕСА экарин. Образец, изготовленный с использованием сверхчистой воды, измеряли в качестве раствора для контрольного измерения. Остаточный коэффициент определяли по следующей формуле (1):

А = 100×(B-D)/(C-D) (1)

В приведенной выше формуле (1) обозначения определяются следующим образом:

А: коэффициент остаточной антитромбиновой активности (%)

В: Величина, измеренная в образце, после облучения с использованием излучения (с)

С: Величина, измеренная в образце, до облучения с использованием излучения (с)

D: Величина контрольного измерения (с)

Стандартные примеры 1-3

Изготавливали раствор IPA растворением IPA (от компании Sigma Aldrich) в сверхчистой воде таким образом, чтобы концентрация соответствовала представленной в таблице 3. Соединение А растворяли в указанном растворе таким образом, чтобы его концентрация составляла 5000 массовых миллионных долей, для получения раствора, который облучали с использованием γ-лучей. Поглощенная доза γ-излучения составляла 25 кГр. Измеряли величины антитромбиновой активности раствора до и после облучения с использованием излучения и рассчитывали коэффициент остаточной антитромбиновой активности согласно представленной выше формуле (1). Результаты представлены на фиг.3.

Стандартный пример 4

Осуществляли эксперимент при условиях, которые описаны в стандартном примере 1, за исключением того, что изготавливали раствор с использованием глицерина (от компании Sigma Aldrich) вместо IPA и рассчитывали коэффициент остаточной антитромбиновой активности согласно представленной выше формуле (1). Результаты представлены на фиг.3.

Стандартный пример 5

Осуществляли эксперимент при условиях, которые описаны в стандартном примере 1, за исключением того, что изготавливали раствор с использованием PG (от компании Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) вместо IPA и рассчитывали коэффициент остаточной антитромбиновой активности согласно представленной выше формуле (1). Результаты представлены на фиг.3.

Сравнительный стандартный пример 1

Осуществляли эксперимент при условиях, которые описаны в стандартном примере 1, за исключением того, что изготавливали раствор соединения А с концентрацией 5000 массовых миллионных долей путем растворения соединения А, использованного в примере 1, и рассчитывали коэффициент остаточной антитромбиновой активности согласно представленной выше формуле (1). Результаты представлены на фиг.3.

Сравнительный стандартный пример 2

Осуществляли эксперимент при условиях, которые описаны в стандартном примере 1, за исключением того, что изготавливали раствор EG (от компании Sigma Aldrich) вместо IPA и рассчитывали коэффициент остаточной антитромбиновой активности согласно представленной выше формуле (1). Результаты представлены на фиг.3.

Сравнительный стандартный пример 3

Осуществляли эксперимент при условиях, которые описаны в стандартном примере 1, за исключением того, что изготавливали раствор PEG (от компании Nacalai Tesque, Inc.) вместо IPA и рассчитывали коэффициент остаточной антитромбиновой активности согласно представленной выше формуле (1). Результаты представлены на фиг.3.

Таблица 3   Органический растворитель Концентрация органического растворителя
(об.%) Коэффициент остаточной антитромбиновой активности (%) Стандартный пример 1 IPA 75 79,4 Стандартный пример 2 IPA 50 61,4 Стандартный пример 3 IPA 10 33 Стандартный пример 4 глицерин 50 53,8 Стандартный пример 5 PG 10 64 Сравнительный стандартный пример 1 - 0 0 Сравнительный стандартный пример 2 EG 50 8,3 Сравнительный стандартный пример 3 PG 50 6,9

Пример 4

Изготавливали водный раствор соединения А с концентрацией 5000 массовых миллионных долей растворением соединения А в сверхчистой воде. Водный раствор соединения А, сверхчистую воду, IPA и Bis-Tris буфер с рН 5 с двойной концентрацией смешивали таким образом, чтобы концентрации соответствовали представленным в таблице 4. Буфер соединения А облучали с использованием γ-лучей. Поглощенная доза γ-излучения составляла 25 кГр. Измеряли величины антитромбиновой активности буфера соединения А до и после облучения с использованием излучения и рассчитывали коэффициент остаточной антитромбиновой активности согласно представленной выше формуле (1). В результате коэффициенты остаточных величин антитромбиновой активности, когда фракции IPA составляли 0,1, 1, 10 и 50 об.%, составили величины, представленные в таблице 4.

Пример 5

Изготавливали водный раствор соединения А таким способом, который описан в примере 4. Водный раствор соединения А, сверхчистую воду, IPA и ацетатный буфер с рН 5 с двойной концентрацией смешивали таким образом, чтобы концентрации соответствовали представленным в таблице 4. Буфер соединения А облучали с использованием γ-лучей таким способом, который описан в примере 4. Измеряли величины антитромбиновой активности буфера соединения А до и после облучения с использованием излучения и рассчитывали коэффициент остаточных величин антитромбиновой активности согласно представленной выше формуле (1). В результате коэффициенты остаточных величин антитромбиновой активности, когда фракции IPA составляли 0,1, 1, 10 и 50 об.%, составили величины, представленные в таблице 4.

Пример 6

Изготавливали водный раствор соединения А таким способом, который описан в примере 4. Водный раствор соединения А, сверхчистую воду, IPA и Tris буфер с рН 7,8 с двойной концентрацией смешивали таким образом, чтобы концентрации соответствовали представленным в таблице 4. Буфер соединения А облучали с использованием γ-лучей таким способом, который описан в примере 4. Измеряли величины антитромбиновой активности буфера соединения А до и после облучения с использованием излучения и рассчитывали коэффициент остаточных величин антитромбиновой активности согласно представленной выше формуле (1). В результате коэффициенты остаточных величин антитромбиновой активности, когда фракции IPA составляли 0,1, 1, 10 и 50 об.%, составили величины, представленные в таблице 4.

Сравнительный пример 6

Изготавливали водный раствор соединения А таким способом, который описан в примере 4. Водный раствор соединения А, сверхчистую воду, IPA и Tris буфер с рН 10 с двойной концентрацией смешивали таким образом, чтобы концентрации соответствовали представленным в таблице 4. Буфер соединения А облучали с использованием γ-лучей таким способом, который описан в примере 4. Измеряли величины антитромбиновой активности буфера соединения А до и после облучения с использованием излучения и рассчитывали коэффициент остаточных величин антитромбиновой активности согласно представленной выше формуле (1). В результате коэффициенты остаточных величин антитромбиновой активности, когда фракции IPA составляли 0,1, 1, 10 и 50 об.%, составили величины, представленные в таблице 4.

Таблица 4   рН буфер Концентрация
IPA (об.%) Коэффициент остаточной антитромбиновой активности (%) Пример 4 5 Bis-Tris 0,1 15,3 1 19,4 10 37,8 50 76,8 Пример 5 5 ацетатный 0,1 0 1 2,0 10 6,5 50 52,1 Пример 6 7,8 Tris 0,1 12,9 1 13,6 10 17,6 50 66,4 Сравнительный пример 6 10 Tris 0,1 2,1 1 2,4 10 1,5 50 4,8

[Способ изготовления мини-модуля полых волокон из PMMA]

50 полых волокон из PMMA, изготовленных, как описано в способе для модуля (0), соединяли в пучок. Оба его конца фиксировали к корпусу модуля с использованием эпоксидного герметизирующего агента, одновременно принимая меры для того, чтобы полая часть полых волокон не блокировалась, для создания мини-модуля (фиг.2), показанного на фиг.2 (указанная работа обозначается как последовательность 2). Диаметр мини-модуля составлял приблизительно 7 мм, а его длина составляла приблизительно 12 см. Подобно распространенному диализатору типа полых волокон, мини-модуль имеет два порта (порты для крови), ведущих во внутреннюю часть полого волокна, и два порта (порты для диализной жидкости), ведущих наружу. Полые волокна мини-модуля и внутреннюю часть мини-модуля промывали с использованием дистиллированной воды.

[Способ изготовления мини-модуля полых волокон из PSf]

18 массовых частей PSf (Udel (зарегистрированный товарный знак) Р-3500 от компании Solvay) и 9 массовых частей PVP (К30 от компании BASF) добавляли к смешанному раствору 72 массовых частей DMAc и 1 массовой части воды, чтобы получить неразбавленный раствор для изготовления пленки, после нагревания при 90°С в течение 14 часов для растворения. Неразбавленный раствор для изготовления пленки выпускали из внешнего патрубка отверстия типа двойного цилиндрического мундштука (внешний диаметр: 0,3 мм; внутренний диаметр: 0,2 мм) в кольцеобразную щель. Раствор, включавший в себя 58 массовых частей DMAc и 42 массовых части воды, выпускали из внутреннего патрубка таким же способом, как и основную жидкость. Выпущенный неразбавленный раствор для изготовления пленки проходил расстояние 350 мм от мундштука до поверхности бани через воздух, перед тем как пройти в баню из 100% воды, в результате чего получали пленку из полых волокон. 50 полых волокон из PSf, изготовленных, как описано выше, соединяли в пучок для создания мини-модуля, согласно последовательности 2. Наружные размеры и порты были те же, которые описаны выше для мини-модуля полых волокон из РММА. Пленку из полых волокон мини-модуля и внутреннюю часть мини-модуля промывали с использованием дистиллированной воды.

[Способ подтверждения элюированных веществ]

Вещества, вымывавшиеся в кровь, устанавливали следующим образом: соединение А растворяли в дистиллированной воде для получения водного раствора соединения А с заранее определенной концентрацией и водный раствор соединения А пропускали через мини-модуль с заранее определенной скоростью потока и облучали с использованием γ-лучей. Конкретная процедура для пропускания водного раствора соединения А через мини-модуль будет описана позднее, в каждом примере и сравнительном примере. Фиг.3 показывает схематичную принципиальную диаграмму, изображающую контур, используемый для прохождения водного раствора соединения А.

На фиг.3 силиконовую трубку 7 (внутренний диаметр: 0,8 мм; длина: 52 см) соединяли с одним портом для крови мини-модуля 6, и перистальтический насос 8 и манометр 11 (АР-32А производства компании Keyence Corporation) устанавливали на середине пути через контур. Силиконовую трубку (внутренний диаметр: 0,8 мм; длина: 16 см) соединяли с другим портом для крови. Другой конец каждой из силиконовых трубок, не соединенный с портом для крови, вставляли в 5 мл полистироловую круглую пробирку 9 (код: 352054) производства BECTON DICKINSON для создания контура циркуляции.

Затем после осуществления способа промывки, описанного в каждом примере или сравнительном примере, контур использовали для осуществления эксперимента с циркуляцией крови, согласно способу, представленному ниже: 5 мл человеческой плазмы (цифра обозначения 10 на фиг. 3) добавляли из полистироловой круглой пробирки 9 и силиконовые трубки вставляли в порты для крови, чтобы передавать жидкость со скоростью потока 0,5 мл/мин с использованием перистальтического насоса, для четырехчасовой циркуляции после слива некоторого количества жидкости в течение первых двух минут. Концентрацию соединения А, вымывшегося в плазму после циркуляции, измеряли с использованием набора ЕСА-Т.

Пример 7

5,8 мл водного раствора, содержавшего соединение А и соединение В (каждая концентрация составляла 6 миллионных долей, а рН Tris буфера составляла 8,0 только в данном случае), вводили со скоростью потока 0,7 мл/мин с использованием перистальтического насоса в один порт для крови мини-модуля полых волокон из РММА, чтобы раствор проходил до другого порта для крови, и после слива первых 1,4 мл циркуляцию продолжали в течение 15 минут. Затем физиологический раствор вводили со скоростью потока 0,46 мл/мин от одного порта для крови мини-модуля полых волокон из РММА, и он выходил из другого порта для крови после прохождения через полые волокна, а затем его вводили в порт для диализной жидкости на стороне порта для крови через силиконовую трубку и сливали из другого порта для диализной жидкости в течение 37 минут. 5,8 мл водного раствора соединения А с концентрацией 6 миллионных долей со скоростью потока 0,7 мл/мин с использованием перистальтического насоса вводили из одного порта для крови мини-модуля полых волокон из РММА, чтобы он выходил из другого порта для крови после прохождения через полые волокна, а затем его вводили в порт для диализной жидкости на стороне порта для крови через силиконовую трубку и сливали из другого порта для диализной жидкости. После промывки физиологическим раствором мини-модуль облучали с использованием γ-лучей, в то время как порты всех четырех локализаций были закрыты. Поглощенная доза γ-излучения составляла 26 кГр. Сепарационную пленку из полых волокон мини-модуля и внутреннюю поверхность мини-модуля промывали пропусканием раствора 0,025% мас. TritonX-100 при 25°С со скоростью потока 10 мл/мин в течение четырех часов с использованием перистальтического насоса. Сепарационную пленку из полых волокон мини-модуля и внутреннюю поверхность мини-модуля промывали еще раз с использованием свежеприготовленного раствора TritonX-100 при тех же условиях в течение четырех часов. Затем полые волокна мини-модуля и внутреннюю поверхность мини-модуля промывали пропусканием 300 мл дистиллированной воды и 300 мл физиологического раствора при 25°С с использованием перистальтического насоса со скоростью потока 10 мл/мин для получения мини-модуля полых волокон (далее в настоящем документе называемого сокращенно мини-модулем (1)). Промывку дистиллированной водой и промывку физиологическим раствором одновременно не проводили.

Измерение количества вымывания соединения А в мини-модуле (1) показало 0 мкг/мл.

Пример 8

30 мл водного раствора, содержавшего соединение А и соединение В (каждая концентрация составляла 100 миллионных долей), вводили со скоростью потока 1 мл/мин с использованием перистальтического насоса в один порт для крови мини-модуля полых волокон из PSf, чтобы раствор проходил до другого порта для крови, и циркуляцию продолжали в течение 15 минут. Затем 30 мл свежеприготовленного водного раствора, содержавшего соединение А и соединение В (каждая концентрация составляла 100 миллионных долей), выпускали из другого порта для крови после прохождения через полые волокна, а затем вводили в порт для диализной жидкости на стороне порта для крови через силиконовую трубку, чтобы он проходил до другого порта для диализной жидкости, и указанную циркуляцию продолжали в течение 15 минут. Затем мини-модуль облучали с использованием γ-лучей при тех же условиях, которые описаны в примере 7. Затем полые волокна мини-модуля и внутреннюю поверхность мини-модуля промывали с использованием того же способа и при тех же условиях, которые описаны в примере 7, для получения мини-модуля (2).

Измерение количества вымывания соединения А в мини-модуле (2) показало 0 мкг/мл.

Сравнительный пример 7

Мини-модуль (3) получали с использованием того же способа, который описан в примере 7, до момента облучения с использованием γ-лучей, за исключением того, что мини-модуль не облучали с использованием γ-лучей.

Измерение количества вымывания соединения А в мини-модуле (3) показало 3,5 мкг/мл.

Сравнительный пример 8

15 мл водного раствора, содержавшего соединение А и соединение В (каждая концентрация составляла 100 миллионных долей), вводили со скоростью потока 1 мл/мин с использованием перистальтического насоса в один порт для крови мини-модуля полых волокон из PSf, для пропускания раствора с использованием того же способа, который описан в примере 8, и циркуляцию продолжали в течение 15 минут. Затем мини-модуль облучали с использованием γ-лучей при тех же условиях, которые описаны в примере 7. Дистиллированную воду при 25°С пропускали со скоростью потока 10 мл/мин с использованием перистальтического насоса для промывки полых волокон мини-модуля и внутренней поверхности мини-модуля в течение двух часов. Затем 300 мл физиологического раствора при 25°С пропускали со скоростью потока 10 мл/мин с использованием перистальтического насоса для промывки полых волокон мини-модуля и внутренней поверхности мини-модуля, для получения мини-модуля (4).

Измерение количества вымывания соединения А в мини-модуле (4) показало 4,7 мкг/мл.

[Измерение количества адсорбции тромбина]

Изготавливали мини-модуль (1) и необработанный мини-модуль полых волокон из РММА и размещали как в контуре, полученном удалением манометра 11 на фиг.2. После запуска физиологического раствора со скоростью потока 0,5 мл/мин для удаления пузырьков, 5 мл белкового раствора (тромбин (НСТ-0020, партия TO326-1MG от компании Technologies Inc.) и альбумин фетальной бычьей сыворотки (BSA (A-7906 (партия № 41К1270) от компании SIGMA)) растворяли в физиологическом растворе таким образом, чтобы конечные концентрации составили 0,35 и 75 мкг/мл соответственно, и весь объем доводили до 27 мл) и запускали в пробирку EIKEN № 1. Первые 1,8 мл после начала запуска раствора сливали и циркуляцию продолжали в течение четыре часов. Плазму после циркуляции собирали в качестве образца и измеряли количество тромбина с использованием анализа ELISA, описанного ниже.

Антитромбиновое антитело (АНТ-5020, партия S0429-01MG, от компании Haemotologic Technologies Inc.) в качестве первичного антитела растворяли в растворе (9,6 г PBS(-) (05913 (партия 137311) от компании Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.) доводили до объема 1 л дистиллированной водой) и доводили до концентрации 0,1 нг/мл. 100 мкл указанного раствора добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета для анализа ELISA (MS-8596F от компании Sumimoto Bakelite Co., Ltd.) и оставляли при комнатной температуре на 60 минут. Раствор выбрасывали с использованием способа, который обычно используется для ELISA, и 400 мкл блокирующей жидкости (0,25 г BSA растворяли в PBS (-) и доводили до концентрации 0,5% мас.) добавляли в каждую лунку и оставляли на 20 минут. Планшет промывали с использованием PBS (-) -T (810 мл PBS (-) и 405 мкл 162-21112 (партия ASP7153) от компании Wako) четыре раза. Затем 100 мкл стандартного тромбина (НСТ-0020, партия Т0326-1MG от компании Haemotologic Technologies Inc.), изготовленного до концентрация для калибровочной кривой на основе образца или разбавителя (изготовленного растворением 0,125 г BSA в 50 мл PBS (-) -T), добавляли в каждую лунку и планшет медленно встряхивали в течение 60 минут. Затем планшет промывали с использованием PBS (-) -T шесть раз. Далее 100 мкл раствора антитромбинового HRP стандартного антитела (SAHT-HRP, партия AB46-67R2 от компании Bilogical Inc.), разведенного в 5000 раз разбавителем, в качестве вторичного антитела добавляли в каждую лунку и после медленного встряхивания при комнатной температуре в течение 30 минут планшет промывали с использованием PBS (-) -T шесть раз. Затем 100 мкл раствора ТМВ один (G7431 (партия 18729904) от компании Promega) добавляли в каждую лунку, планшет медленно встряхивали в течение 10 минут, 100 мкл 1 Н HCl (420-00055 от компании Hayashi Pure Chemical Inc., Ltd.) добавляли в каждую лунку, чтобы остановить реакцию. Немедленно после остановки реакции использовали микропланшет-ридер (MPR-A4iII производства компании TOSOH) для измерения поглощения на длине волны 450 нм (600 нм использовали в качестве стандартной длины волны).

Пример 9

В результате измерения количества адсорбции тромбина в мини-модуле (1) количество адсорбции составило 4,0 нг/см².

Сравнительный пример 9

В результате измерения количества адсорбции тромбина в необработанном мини-модуле полых волокон из РММА количество адсорбции составило 0,5 нг/см².

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ изготовления субстрата, в котором соединение, обладающее активностью против свертывания крови, выбранное из группы, состоящей из гепарина, тромбомодулина, 4-метоксибензолсульфонил-Asn (PEG2000-Ome)-Pro-4-амидинобензиламидо, ATIII и гирудина, и гидрофильное соединение, выбранное из группы, состоящей из PVA, PVP, PEG, PPG, материала, состоящего из полиэфира и полисилоксана, полиэтиленамина, полиаллиламина, поливиниламина, поливинилацетата, полиакриловой кислоты и полиакриламида, а также сополимера или привитого полимера из мономера указанных полимеров и другого мономера, приводят в контакт с субстратом, который содержит раствор органического растворителя, в котором содержание влаги составляет 25 об.% или более и 90 об.% или менее, и содержится по меньшей мере одна вторичная или третичная гидроксильная группа; затем облучают соединение, обладающее активностью против свертывания крови, и гидрофильное соединение, приведенные в контакт с субстратом, с использованием излучения, выбранного из группы, состоящей из β-лучей, γ-лучей, рентгеновских лучей, пучка электронов и пучка нейтронов, и отмывают непрореагировавшие компоненты при помощи неионогенного поверхностно-активного агента. Изобретение обеспечивает сокращение вымывания соединения, обладающего противосвертывающей активностью, и гидрофильного полимерного соединения. 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 3 ил.

1. Способ изготовления субстрата, в котором:
соединение, обладающее активностью против свертывания крови, выбранное из группы, состоящей из гепарина, тромбомодулина, 4-метоксибензолсульфонил-Asn (PEG2000-Ome)-Pro-4-амидинобензиламидо, ATIII и гирудина, и гидрофильное соединение, выбранное из группы, состоящей из PVA, PVP, PEG, PPG, материала, состоящего из полиэфира и полисилоксана, полиэтиленамина, полиаллиламина, поливиниламина, поливинилацетата, полиакриловой кислоты и полиакриламида, а также сополимера или привитого полимера из мономера указанных полимеров и другого мономера приводят в контакт с субстратом, который содержит раствор органического растворителя, в котором содержание влаги составляет 25 об.% или более и 90 об.% или менее, и содержится по меньшей мере одна вторичная или третичная гидроксильная группа; затем облучают соединение, обладающее активностью против свертывания крови, и гидрофильное соединение, приведенные в контакт с субстратом, с использованием излучения, выбранного из группы, состоящей из β-лучей, γ-лучей, рентгеновских лучей, пучка электронов и пучка нейтронов, и
отмывают непрореагировавшие компоненты при помощи неионогенного поверхностно-активного агента.

2. Способ по п.1, в котором, когда соединение, обладающее активностью против свертывания крови, и гидрофильное соединение, приведенные в контакт с субстратом, облучают с использованием излучения, субстрат содержит буферный раствор с рН 3 или более и 10 или менее.