АНТИКОАГУЛЯНТНОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2000 года по МПК A61K31/245 

Изобретение относится к области биологии и медицины и может найти применение в клинической практике для профилактики и лечения тромбозов.

В настоящее время антикоагулянты, наряду с фибринолитиками и антиагрегантами используются для предотвращения и избавления от тромбов в кровяном русле /1/.

Известен широко используемый, прямой антикоагулянт - гепарин, обладающий рядом побочных нежелательных эффектов. Применяя его, у экспериментальных животных и больных наблюдаем снижение числа тромбоцитов на 33-45% /2/, а также изменение функциональной активности, включающей рост агрегации клеток под действием аденозиндифосфорной кислоты /3/ и снижение при активации адреналином /4/. Для противотромботической профилактике известно использование per os парааминобензойной кислоты в смеси с аспирином в дозе до 100 мг/кг веса /11/.

Объект изобретения - антикоагулянтное средство, обладающее антитромбиновой, антитромботической и ингибиторной по отношению к активированному фактору десять активностями, отличающееся тем, что представляет собой парааминобензойную кислоту (ПАБК), которая действует при внутривенном введении в диапазоне доз 0,5-3,0 мг/кг, не снижает числа тромбоцитов при введении в кровяное русло, не меняет агрегации тромбоцитов с аденозиндифосфорной кислотой и адреналином в системах in vitro и in vivo, позволяет достичь равного с гепарином эффекта вдвое меньшей, в единицах активированного фактора десять, дозой, дешевле гепарина в 50 раз.

До исследования действия ПАБК на модель венозного стаза у крыс оценивали удельную антитромбиновую (aIIa) и удельную анти-фактор-десять-активированный (aXa) активности этого вещества.

Определение aIIa активности ПАБК основано на изменении активности тромбина в 0,05 мл цитратной, бедной тромбоцитами плазмы человека при активации свертывания 0,250 мл раствора тромбин-реагента (смесь бычьего α-тромбина, хепеса и хлорида кальция) фирмы Behring. О результате судят по увеличению оптической плотности при длине волны 405 нм (5). Для калибровочной кривой использовали пул бедной тромбоцитами плазмы человека с 0.05; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5 aIIa ЕД/мл нефракционированного гепарина Московского Контрольного Института (aIIa - 190 ЕД/мг). Удельная антитромбиновая активность ПАБК составила 7.00±0.32 ЕД/мг.

Для определения aXa активности ПАБК использовали наборы фирмы Behring. Реакция инактивации фактора Xa в 0.025 мл плазмы избытком антитромбина III (0.025 мл) катализируется гепарином, высвобождаемым из комплексов с белками после добавления 0.250 мл смеси равных количеств чистого фактора Xa с сульфатом декстрана в воде и последующей инкубации при 37^oC. Остаточная активность фактора Xa определялась при добавлении 0,1 мл раствора хромогенного субстрата по изменению оптической плотности за минуту при λ = 405 нм (6). Для калибровочной кривой использовали пул бедной тромбоцитами плазмы человека с 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0 aXa ЕД/мл первого Международного стандарта низкомолекулярного гепарина (aXa = 130 ЕД/мг). Удельная aXa активность парааминобензойной кислоты составила 16,70±0,12 ЕД/мг.

В эксперименте на белых беспородных крысах обоего пола весом 200-300 г исследована антитромботическая активность парааминобензойной кислоты (ПАБК). Для наркоза использовали внутрибрюшинное введение нембутала в дозе 60 мг/кг по 1 мл на 200 г веса животного. ПАБК и известный антитромботический агент - гепарин вводили в яремную вену в объеме 1 мл, в ту же вену вводили активированную стеклом сыворотку человека (0,75 мл/кг). За 15 мин до инъекции аутологичной сыворотки животным вводили атропин (5 мг/кг) с целью подавления защитной реакции противосвертывающей системы. Моделирование венозного тромбоза в противоположной яремной вене проводили по методу S.Wessler (7). Для этого, через 15, 60, 90, 120, 180, 240, 300 мин после введения исследуемого вещества активировали систему свертывания сывороткой человека. Затем перевязывали сантиметровый участок вены, которая не использовалась для введения веществ. Действие ПАБК и фраксипарина на экспериментальный тромбоз изучали в следующих вариантах: 1) животным опытной группы вводили ПАБК в дозах 0,5, 1,5 и 3,0 мг/кг или гепарин в дозе 40 анти-Xa ЕД/кг; 2) животным контрольной группы вводили 0,9% раствор NaCl. Эффективность антитромботической активности оценивали в баллах (см. чертеж) по форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены, с последующим пересчетом системы баллов на процент предотвращения тромбоза, по следующей формуле:
(1-Σa/4n)•100,
где a - антитромботический эффект в баллах; n - число экспериментов.

Количество белка в гомогенатах тромбов оценивали по методу Бредфорда (8). Концентрацию белка относили к длине перевязанного участка вены и к весу животного. Для калибровочной кривой использовали фибриноген в концентрации от 8 до 1000 мкг/мл.

Визуальная оценка антитромботического эффекта в баллах и сопряженное с ней определение количества белка в гомогенатах тромбов демонстрируют положительную корреляцию друг с другом (r = 0,94, p<0,05), а так же с изменением дозы, введенной внутривенно ПАБК (r₁ = 0,98, p<0,05; r₂ = 0,99, p<0,05) (таблица 1). Наиболее выраженный и длительный (90-240 мин) эффект отмечался при дозе 1,5 мг/кг. Отобранные при дозе 3 мг/кг пробы плазмы крыс оказывались в 50% гемолизированы, что, по всей вероятности, говорит о негативном воздействии ПАБК в такой концентрации на эритроцитарную мембрану. Известные в настоящее время антитромботические агенты на основе прямых антикоагулянтов, сразу после внутривенного введения в дозах 30-40 анти-Xa ЕД/мг оказывают воздействие (таблица 2). ПАБК вызывал развитие эффекта через 1,5 час после внутривенного введения 1,5 мг/кг.

Антитромбиновую и анти-фактор Xa активности плазмы крыс оценивали также как и активности ПАБК, с той лишь разницей, что для калибровочных кривых использовали пул плазмы крыс. Пик антитромботической активности исследуемого вещества отмечался на 3-ем часу после введения, что коррелировало с антн-IIa и анти-Xa активностями плазмы (таблица 2). Несмотря на то, что доза в 1,5 мг/кг соответствует дозе в 25 анти-Xa ЕД/кг ПАБК, это приблизительно в два раза меньше дозы сравниваемого гепарина (40 анти-Xa ЕД/кг), активность плазмы по отношению к антитромботическому эффекту была достоверно одинакова в обоих случаях. Нами не отмечено каких-либо изменений в соотношениях между анти-Xa и анти-IIa активностями плазмы при внутривенном введении исследуемых веществ. Для ПАБК в дозе 1,5 мг/кг и фраксипарина это соотношение составило 1,5 - 1,7, для ПАБК в дозе 3 мг/кг - 1,8 - 2,0. Вне- и внутригрупповая вариабильность при определении анти-Xa активности составила 4,6% и 4,7%, для определения антитромбиновой активности - 2,9% и 6,7%.

Число тромбоцитов определяли по поглощению 0.4 мл богатой тромбоцитами плазмы при λ = 800 нм (9). Введение 0,5, 1,5 и 3 мг/кг ПАБК не изменяло числа тромбоцитов (таблица 3). Уменьшение числа тромбоцитов на 30% по отношению к контролю и к исходу (p < 0,05) отмечалось сразу после внутривенного введения кроликам гепарина в оптимальной дозе ПАБК (1,5 мг/кг).

Агрегацию тромбоцитов исследовали по методу Борна (10) в 0,45 мл богатой тромбоцитами плазме, с использованием агрегометра Chrono-Log (США).

В качестве индукторов применяли либо АДФ в конечной концентрации 20 μM, либо адреналин в конечной концентрации 5 мкг/мл.

В экспериментах in vitro нами не наблюдалось достоверных различий между агрегацией тромбоцитов человека в контрольных пробах (где концентрация ПАБК равна нулю) и инкубированных 2 мин с ПАБК в конечной концентрации от 5,5 нМ до 180 μM, что соответствует внутривенным дозам (таблица 4).

В экспериментах in vivo, агрегация тромбоцитов под действием АДФ по отношению к исходу (до введения) не менялась при введении 0,5; 1,5 и 3,0 мг/кг ПАБК (таблица 5). Введение гепарина в оптимальной дозе ПАБК (1,5 мг/кг) приводило к увеличению агрегации на 50%.

Вышеобозначенное свидетельствует о том, что пара-аминбензойная кислота, обладая некоторыми свойствами прямого антикоагулянта в системе in vitro и имея не только антитромбиновую активность, но и ингибируя активированный фактор X, при внутривенном введении крысам проявляет антитромботический эффект через 1,5 часа после введения, с пиком активности на 3-м часу и окончанием действия на 5-ом часу. В наших экспериментах отмечается одинаковая активность плазмы после введения гепарина в дозе 40 анти-Xa ЕД/кг и ПАБК в дозе 25 анти-Xa ЕД/кг.

Таким образом, предлагаемое изобретение обладает рядом преимуществ, по сравнению с прототипом:
1. При внутривенном введении не снижается число тромбоцитов в плазме крови кроликов (по анализу оптической плотности).

2. В системе in vitro не меняется агрегационная активность тромбоцитов человека при индуцировании агрегации АДФ или адреналином.

3. В системе in vivo, при внутривенном введении не изменяется агрегация тромбоцитов под действием АДФ.

4. В дозе почти в два раза меньшей (по анти-Xa), чем у гепарина, предлагаемое средство проявляет равный с прототипом антитромботичсский эффект, как при непосредственном, полуколичественном определении на модели венозного стаза, так и при измерении антикоагулянтной "напряженности" плазмы крови крыс по наличию антитромбиновой и анти-Xa активностей.

5. ПАБК в 50 раз дешевле гепарина (1 г ПАБК стоит 20000 руб, 1 г гепарина 1000000 руб).

Пример 1. Определение aIIa активности ПАБК основано на изменении активности тромбина в 0,05 мл цитратной, бедной тромбоцитами плазмы человека при активации свертывания 0,250 мл раствора тромбин-реагента (смесь бычьего α-тромбина, хепеса и хлорида кальция) фирмы Behring. Время появления фибрина в виде мути, при оценке донорской плазмы составило 12 сек. В присутствии ПАБК в концентрации 0,06 мг/мл плазмы фибрин появляется через 40 сек.

Пример 2. Для определения aXa активности ПАБК использовали наборы фирмы Behring. Реакция инактивации фактора Xa в 0,025 мл плазмы избытком антитромбина III (0,025 мл) катализируется гепарином, высвобождаемым из комплексов с белками после добавления 0,250 мл смеси равных количеств чистого фактора Xa с сульфатом декстрана в воде и последующей инкубации при 37^oC. Остаточная активность фактора Xa определялась при добавлении 0,1 мл раствора хромогенного субстрата по изменению оптической плотности за минуту при λ = 405 нм. Скорость реакции при оценке донорской плазмы составила 0,202 ΔA/мин. В присутствии ПАБК в концентрации 0,006 мг/мл скорость реакции составила 0,150 ΔA/мин.

Пример 3. В эксперименте на белых беспородных крысах обоего пола весом 200-300 г исследована антитромботическая активность парааминобензойной кислоты (ПАБК). Для наркоза использовали внутрибрюшинное введение нембутала в дозе 60 мг/кг по 1 мл на 200 г веса животного. ПАБК вводили в яремную вену в объеме 1 мл, в ту же вену вводили активированную стеклом сыворотку человека (0,75 мл/кг). За 15 мин до инъекции аутологичной сыворотки животным вводили атропин (5 мг/кг) с целью подавления защитной реакции противосвертывающей системы. Моделирование венозного тромбоза в противоположной яремной вене проводили по методу S.Wessler. Для этого, через 120 мин после введения исследуемого вещества активировали систему свертывания сывороткой человека. Затем перевязывали сантиметровый участок вены, которая не использовалась для введения веществ. Действие ПАБК на экспериментальный тромбоз изучали в следующих вариантах: 1) животным опытной группы вводили ПАБК в дозе 1,5 мг/кг; 2) животным контрольной группы вводили 0,9% раствор NaCl. Эффективность антитромботической активности оценивали в баллах (чертеж) по форме тромба, извлеченного из перевязанного участка вены. Антитромботический эффект 1,5 мг/кг ПАБК составил 0,3±0,3 балла. В контрольной группе животных через 120 мин после введения хлористого натрия антитромботический эффект составил 3,8±0,2 балла.

Пример 4. Измерение оптической плотности (D) 0,4 мл богатой тромбоцитами плазмы кроликов (спектрофотометрирование при λ = 800 нм) для определения числа клеток показало, что при внутривенном введении физиологического раствора, через два часа, D составила 0,305. Через такой же интервал времени после введения 1,5 мг/кг ПАБК, D составила 0,307.

Пример 5. Измерение на агрегометре активации тромбоцитов (in vitro) в 0,45 мл богатой клетками плазмы человека, при двухминутной инкубации (t = 37^oC) с 50 мкл физиологического раствора, составило 55,0±1,0% с 20 мкМ АДФ и 58,0±0,9% с 5 мкг/мл адреналина. Преинкубация плазмы с 11 мкМ ПАБК в конечной концентрации продемонстрировала агрегацию с АДФ в 52,8±0,5% и с адреналином в 51,5±2,8%. Индукторы добавлялись в 50 мкл.

Пример 6. Измерение на агрегометре активации тромбоцитов (in vivo) в 0,45 мл богатой клетками плазмы кроликов при внутривенном введении физиологического раствора, через два часа составило 38±2%. При введении 1,5 мг/кг ПАБК агрегация через два часа равнялась 43±1%. В качестве индуктора использовали 50 мкл АДФ в конечной концентрации 20 мкМ.

Пример 7. Для приготовления дозы ПАБК исходили из того, что исследуемое вещество растворяли в физиологическом растворе (0,9% р-р NaCl), количество которого составляло 1 мл на 200 мг веса животного. Так, для крысы весом 400 мг состав раствора ПАБК в дозе 1,5 мг/кг был следующим: 0,6 мг порошка ПАБК растворяли в 2 мл 0,9% р-ра NaCl.

Пример 8. Для крысы весом 320 мг состав раствора ПАБК в дозе 3,0 мг/кг был следующим: 0,96 мг порошка ПАБК растворяли в 1,6 мл 0,9% раствора NaCl.

Пример 9. Для крысы весом 370 мг состав раствора ПАБК в дозе 0,5 мг/кг был следующим: 0,19 мг порошка ПАБК растворяли в 1,85 мл 0,9% раствора NaCl.

Литература
1. Huber K., Hornykewycz S., Graf S., Gabriel H., Geppert A. Laboratory monitoring of succes and failure of thrombolytic therapy in acute myocardial infarction. Fibrinolysis, v. 9, suppl. 1, 1995, 53-57.

2. Natelson E.A., Lynch E.C., Alfrey C.P., Gross J.B. Heparin - induced thrombocytopenia. Ann. Intern. Med. 1969, v. 71, p. 1121-1125.

3. Salzman E. W., Rosenberg R.D., Smith M.N. Effect of heparin and heparin fraction on platelet aggregation. J. Clin. Invest. 1980, v. 65, p. 64-73.

4. Gillett M.P.T. Heparin effects on plasma lysolecithin formation and platelet aggregation. Atherosclerosis. 1973, v. l7, p. 503 - 513.

5. Scully M.F., Kakkar V.V. The antiheparin effect of a heparinoid, penrtosan polysulphate. Biochem J. 1984, v. 218, 657-665.

6. Schoen P. , Lindhout T., Hemker C. Ratios of anti-factor Xa to antithrombin activities of heparins as determined in recaltified human plasma.

7. Wessler S., Reimer S.M., Sheps M.C. Biological assay of a thrombosis inducing activity in human serum. J. Appl. Physiol, 1959, v. 14, 943-946.

8. Bradford R. M. Measurement protein concentration. Anal. Biochem., 1978, v. 86, 142-145.

9. Walkowiak B. , Michalak., Koziolriewich W., Cierniewski C. Determination of the platelet quantity. Thromb. Res. 1990, v. 56, N 6, 763 - 766.

10. Born G. V. Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal. Nature (Lond)., 1962, v. 194, 927-929.

11. Sawyer P.N. Methods for administering anti-thrombotic compounds. US, 4954521, A 61 K 31/34, 1990.

Изобретение относится к медицине и может найти применение для профилактики и лечения тромбозов и тромбоэмболий. Предлагаемое средство содержит парааминобензойную кислоту из расчета 0,5-3,0 мг/кг на дозу для внутривенного введения. Средство обеспечивает улучшенное антикоагулянтное действие, при котором не снижается число тромбоцитов и не меняется их агрегация под действием аденозиндифосфорной кислоты и адреналина. 1 ил., 5 табл.

Антикоагулянтное средство, обладающее антитромбиновой, антитромботической и ингибиторной по отношению к активированному фактору десять активностями, содержащее п-аминобензойную кислоту, отличающееся тем, что оно содержит указанную кислоту из расчета 0,5 - 3,0 мг/кг на дозу для внутривенного введения.