БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПЕПТИД, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ МОЛОЧНОГО БЕЛКА Российский патент 2011 года по МПК C12P21/06 C07K7/08 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой чистый пептид, который может быть использован для лечебных целей, в том числе для профилактики гипертонической болезни, характеризуемый аминокислотной последовательностью LLYQQPVLGPVRGPFPIIV, полученный из молочного белка.

В последние годы значительно повысился интерес к структуре и функциям низкомолекулярных пептидов, полученных в результате направленного ферментативного гидролиза полноценных белков молока, выполняющих в организме ряд специфических биологических функций.

Биологически активные пептиды в организме человека оказывают влияние на функции центральной нервной системы, проявляют иммуномодулирующее действие, оказывают влияние на процессы агрегации тромбоцитов и высвобождение вазоактивных простагландинов, регуляцию эндокринной функции поджелудочной железы, желудочной секреции и моторики, проявляют пребиотическое действие, стимулируя рост нормальной симбиотической микрофлоры и одновременно подавляя рост в кишечнике условно патогенных, в том числе потенциально патогенных микроорганизмов. Ряд биологически активных пептидов, образующихся при ферментативном гидролизе белков молока, могут проявлять in vivo свойства ингибитора ангиотензин-конвертирующего фермента и, как следствие, способствовать снижению кровяного давления. Эти пептиды имеют потенциальное использование в продуктах или фармацевтических препаратах и могут быть получены посредством различных способов ферментативного гидролиза и микробного брожения, в настоящее время являющихся наиболее распространенными.

Известны способы получения пептидов путем конденсации блочных фрагментов, кристаллизации, гидролиза и фильтрования, упаривания с последующей очисткой конечного продукта (Deigin V.I., Yarova E.R. "Synthesis of dermorphin and its analogs' // In: Peptides 1984, p.325-328).

Известно, что при протеолитическом расщеплении казеина молока образуются регуляторные пептиды (β-казоморфины и фосфопептиды), которые могут выступать как физиологические модуляторы метаболизма. Например, казеинфосфопептиды являются переносчиками различных микроэлементов, особенно кальция, и обладают цитомодулирующими эффектами, стимулируя активность иммунокомпетентных клеток (Meisel Н., FitzGerald R.J. Curr. Pharm. Des. 2003. V.9. Р.1289-1295). Казоморфины участвуют в обеспечении всасывания питательных веществ и последующем синтезе гормонов, иммунопептиды и казокинины обеспечивают иммунную защиту и перенос информации между эндокринной и нервной системой.

Известно изобретение на способ получения пептида, обладающего антибактериальным действием, полученного из гидролизата казеина (αs2-казеин) (ЕР 1114060, Process for producing cationic peptides from biological fluids) и р-казеин и к-казеин (WO 99/26971, Antimicrobial peptides).

Другая важная группа биологически активных пептидов относится к пептидам, обладающим противогипертоническим действием, способным снизить рост гипертонических заболеваний в развитых странах. Механизм действия таких пептидов основан на ингибировании ангиотензинконвертирующего фермента АКФ - неспецифической дипептидилкарбоксипептидазы, играющей ключевую роль в регуляции давления в системе кровообращения путем модуляции ренинангиотензиновой системы (РАС) (Т Takano, Milk derived peptides and hypertension reduction, International Dairy Journal, 1998, 8: 375-381). Антигипертензивные пептиды могут быть выделены из гидролизатов казеина (казеокинины) (US 6514941, Method of preparing a casein hydrolyzate enriched in antihypertensive peptides) и белков сыворотки (лактокинины) (WOO 1/85984, Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting products and treatment of hypertension in mammals).

Наиболее близким к заявляемым пептидам по структуре и свойствам является амид октапептида, обладающий способностью повышать артериальное давление и частоту сердечных сокращений (патент РФ №2346001, МПК С07К 7/06, А61К 38/08, А61Р 9/04. Амид октапептида, обладающий способностью повышать артериальное давление и частоту сердечных сокращений, опубл. 10.09.2009). Полученный пептид и композиция на его основе обладает широкими функциональными возможностями, однако получение его отличается значительной сложностью из-за высокого молекулярного веса, что удорожает его производство.

Технической задачей является получение биологически активного пептида, обладающего антигипертоническим действием и характеризующегося аминокислотной последовательностью LLYQQPVLGPVRGPFPIIV.

Технический результат достигается за счет использования в качестве биологической системы белка молока β-казеин, проведения целенаправленного гидролиза белков при помощи энзиматической системы, состоящей из смеси ферментных препаратов (концентрация составляет 0,01-0,05% от массы белка), обеспечивающих разделение полипептидной цепи на короткие пептиды и очистку полученного пептида с необходимой аминокислотной последовательностью из полученных гидролизатов с помощью мембранных фильтров с последующей стерилизацией полученного фильтрата, его сгущением и сушкой. Таким образом, достигается получение заданного пептида из биологической системы.

Способ получения биологически активного пептида с аминокислотной последовательностью реализуют следующим образом: подготавливают биологическую систему (в качестве биологической системы используют β-казеин, который предварительно восстанавливают, пастеризуют и охлаждают до температуры 36-39°С), подготавливают энзиматическую систему (ферментные препараты: трипсин или химотрипсин или термолизин в одинаковом количестве). После подготовки обеих систем приступают к проведению ферментативного гидролиза. Для этого в подготовленную биологическую систему вносят энзиматическую систему при температуре 35-38°С; концентрация ферментов 0,01-0,05% от массы белка, продолжительность процесса 9-10 часов. После этого ферменты инактивируют методом кратковременного нагревания до 90-92°С и проводят ультрафильтрацию полученных гидролизатов с помощью установки производства «ВЛАДИСАРТ» (Россия) с использованием мембран с диаметром пор 10 и 15 кД при рН 6,0-6,5. Полученный фильтрат стерилизуют, сгущают до содержания сухих веществ 50-55% и сушат до содержания влаги 14-16%.

Пример

Выделение пептида из молока

Подготавливают биологическую систему (в качестве биологической системы используют β-казеин, который предварительно восстанавливают, пастеризуют и охлаждают до температуры 36-39°С), подготавливают энзиматическую систему (ферментные препараты: трипсин или химотрипсин или термолизин в одинаковом количестве). После подготовки обеих систем приступают к проведению ферментативного гидролиза. Для этого в подготовленную биологическую систему вносят энзиматическую систему при температуре 35-38°С; концентрация ферментов 0,01-0,05% от массы белка, продолжительность процесса 9-10 часов. После этого ферменты инактивируют методом кратковременного нагревания до 90-92°С. Затем проводят ультрафильтрацию полученных гидролизатов с помощью установки производства «ВЛАДИСАРТ» (Россия) с использованием мембран с диаметром пор 10 и 15 кД при рН 6,0-6,5. Полученный фильтрат стерилизуют, сгущают до содержания сухих веществ 50-55% и сушат до содержания влаги 14-16%.

Установление аминокислотной последовательности пептида

Идентификацию пептида (определение аминокислотной последовательности) проводили на газофазном секвенаторе 477А и Pth-анализаторе 120А фирмы «Applied Biosystems» (США). Для этого фракции, содержавшие заявляемый пептид, после стадии очистки диализовали против воды, лиофилизовали и растворяли в 0.1% ТФА. Объем колонки 1.9 см, скорость элюции составила 0.2 мл/мин. На секвенирование пептиды отбирали по результатам аминокислотного анализа.

В результате устанавливают полную аминокислотную последовательность, состоящую из 19 аминокислотных остатков: LLYQQPVLGPVRGPFPIIV

Leu-Leu-Tyr-Gln-Gln-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val.

Определение относительной молекулярной массы пептида

Полученную аминокислотную последовательность, а также индивидуальность очищенного пептида подтверждают масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получают на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II TOF/TOF (Bruker Daltonik, Германия), с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют дигидробензойную кислоту (10 мг/мл в 50%-ном ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную трифторуксусную кислоту). Для калибровки прибора используют стандартную смесь пептидов и белков с диапазоном молекулярных масс 700-66000 Да (Sigma, США).

Измеренная моноизотопная молекулярная масса пептида LLYQQPVLGPVRGPFPIIV составляет 2107,23 Да и в пределах точности MALDI-масс-спектрометра (0,01%) не отличается от расчетной (2125,13 Да).

Таким образом, заявляемое изобретение позволяет получить из молочного белка β-казеина биологически активные пептиды обладающие антигипертоническим действием.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биологически активному пептиду, который обладает антигипертонической активностью. Предложенное изобретение может быть использовано для профилактики гипертонических заболеваний. Биологически активный пептид характеризуется аминокислотной последовательностью LLYQQPVLGPVRGPFPIIV. Данный пептид получают из белка молока ферментативным гидролизом. После чего осуществляют очистку и ультрафильтрацию полученных гидролизатов с использованием мембран с диаметром пор 10 и 15 кД при рН 6,0-6,5. Предложенное изобретение позволяет получать биологически активный пептид, который обладает антигипертонической активностью.

Биологически активный пептид, обладающий антигипертонической активностью, имеющий следующую аминокислотную последовательность LLYQQPVLGPVRGPFPIIV, полученный из белка молока ферментативным гидролизом с концентрацией фермента 0,01-0,05% от массы белка с последующей очисткой и ультрафильтрацией полученных гидролизатов с использованием мембран с диаметром пор 10 и 15 кД при рН 6,0-6,5.