СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НИЗКОГИДРОЛИЗОВАННОЙ ПЕПТИДНОЙ КОМПОЗИЦИИ ИЗ БЕЛКОВ МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ Российский патент 2014 года по МПК A23J3/08 A23J1/20 

Изобретение относится к молочной промышленности, в частности к получению низкогидролизованных пептидных композиций из белков молочной сыворотки с антиоксидантными и гипотензивными свойствами и привлекательными органолептическими характеристиками, используемых при производстве функциональных пищевых продуктов массового потребления и специализированных продуктов для лиц с пищевой непереносимостью белков молока.

В последнее десятилетие большое внимание уделяется разработке функциональных пищевых продуктов массового потребления и специализированных продуктов для питания ключевых категорий лиц с пищевой непереносимостью или аллергией на определенные пищевые компоненты, или алиментарно-зависимыми заболеваниями. При этом основой данных категорий пищевых продуктов, придающих им соответствующие свойства, являются функциональные пищевые ингредиенты. Многочисленные исследования показали, что ферментативные гидролизаты пищевых белков, в том числе гидролизаты казеина и белков молочной сыворотки, обладают не только питательной ценностью за счет содержания незаменимых и заменимых аминокислот в легкоусвояемой форме, но и являются источником биологически активных пептидов, участвующих в регуляции различных функций организма, включая поддержание баланса микрофлоры желудочно-кишечного статуса, антиоксидантного и иммунного статуса, регуляцию артериального давления и др. Таким образом, очевидно, что для профилактики развития клинических признаков пищевой непереносимости молочных белков, повышения антиоксидантного статуса, профилактики функциональных нарушений со стороны деятельности сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта и восстановления баланса его микрофлоры необходимо разрабатывать способы получения пептидных композиций, обладающих антиоксидантным, гипотензивным и пребиотическим действием.

В частности, известен способ получения гидролизата белка молочной сыворотки, предусматривающий смешивание сывороточного белкового продукта, содержащего по меньшей мере 65% белка из расчета по сухому веществу, и воды с получением суспензии с содержанием белка до 20%, протеолитический гидролиз суспензии до степени гидролиза 15 и 35%, выделение из смеси на ультра- или микрофильтрационном устройстве со значением отсекания выше 10000 белкового гидролизата в виде пермеата, отличающийся тем, что перед протеолитическим гидролизом суспензию подвергают тепловой обработке при температуре выше 60°C, нагретую таким образом смесь подвергают регулированию pH щелочным веществом, гидролиз ведут протеазой, продуцируемой В. licheniformis, предпочтительно Alcalase, и/или протеазой, продуцируемой В. subtilis, предпочтительно Neutrase, посредством метода нестатичного pH, после выделения белкового гидролизата проводят инактивацию ферментов (см. Патент РФ №2084172, 27.05.1992 г.).

Недостатком данного способа является получение средне (степень гидролиза 5-20%) и глубоко (степень гидролиза более 20%) гидролизованных пептидных композиций со средней длиной пептидной цепи не более 5 аминокислотных остатков, обладающих низкой степенью горечи, что снижает как потребительские свойства гидролизатов, так и пищевых продуктов на их основе. Кроме того, в примерах, раскрывающих данное изобретение, приводятся данные по использованию для гидролиза сывороточных белков молока композиции из двух ферментных препаратов (Neutrase и Alcalase 2.4L), что приводит к увеличению себестоимости получения гидролизатов.

Известен способ получения частичного гидролизата молочных белков (при соотношении сывороточные белки/казеин от 40/60 до 80/20), включающий гидролиз, концентрирование и сушку. Гидролиз осуществляют в одну стадию под действием смеси ферментов трипсина и химотрипсина, при этом белок предварительно термически денатурируют при (70-80)°C. Гидролиз проводят в 4-6% растворе субстрата при фермент-субстратном соотношении 0,6-0,8% при температуре (30-50)°C в течение 2-6 часов. Устанавливают исходный pH 7,5-8,0 ед. и далее в ходе процесса не pH-статируют, позволяя pH опуститься до величины 6,5-6,8 ед. Далее проводят термическую инактивацию фермента при температуре (80-90)°C, концентрирование и сушку. Гидролизат используют в продуктах непосредственно, без дальнейшей очистки. По данным иммуноферментного анализа (проводимого в варианте метода торможения непрямого иммуноферментного теста) антигенность гидролизата снижается на 75-95% в сравнении с исходным белком (см. Патент US №5405637, НКИ 426/580, 11.04.1995 г.).

Приведены исследования молекулярно-массового распределения методом эксклюзионной жидкостной хроматографии высокого давления на колонке TSK, которые, однако, были получены в водно-органических средах и поэтому недостаточно адекватно отражают состав гидролизата.

Аналогичный метод получения "частичных" гидролизатов молочного белка приводится в патенте (см. Патент US №5589357, НКИ 435/68.1, 31.12.1996 г.). В отличие от описанного выше способа инактивацию смеси ферментов трипсин+химитрипсин в гидролизате проводят острым паром.

Недостатки представленных выше аналогов следующие:

- дополнительно необходима стадия термической инактивации фермента, которая может приводить к ухудшению качества продукта (снижению биологической ценности из-за потери части незаменимых аминокислот);

- непосредственно после проведения гидролиза и инактивации ферментов гидролизат сушат без дополнительной очистки. Это приводит к тому, что в состав продукта попадают остаточные количества нерасщепленного белкового субстрата и компоненты ферментных препаратов, которые могут сами по себе обладать аллергенным действием, что ухудшает качество продукта и снижает возможность его использования в гипоаллергенных смесях;

- степень снижения антигенности получаемого продукта составляет 75-95%, что соответствует снижению в 4-20 раз. Этого крайне недостаточно для использования данного гидролизата в гипоаллергенных продуктах питания. В составе гипоаллергенных смесей профилактического назначения степень снижения антигенных свойств должна составлять 10⁴ (10.000) раз или более;

- в ходе проведения процесса производится мониторинг молекулярно-массового распределения пептидов методом эксклюзионной хроматографии на колонке TSK G-2000 SWXL. Однако при этом применяется растворитель, содержащий ацетонитрил, что может исказить результаты анализа, а именно привести к занижению содержания пептидов с молекулярными массами более 10 кДа (килодальтон) вследствие выпадения их в осадок при растворении в подвижной фазе, содержащей ацетонитрил. При этом следует отметить - степень потери белково-пептидного материала зависит от концентрации ацетонитрила в подвижной фазе, что делает результаты анализа неопределенными.

Наиболее близким по техническому решению к заявляемому способу является способ получения ферментативного гидролизата сывороточных белков со средней степенью гидролиза. Способ включает получение белкового раствора, его пастеризацию, ферментативный гидролиз панкреатином, ультра- и диафильтрацию полученного гидролизата с разделением на фильтрат и концентрат, сушку. Белковый раствор получают из сухого концентрата сывороточного белка, а гидролиз ведут при фермент-субстратном соотношении 1,5-2,5%, при температуре 48-54°C в течение 3-3,5 часов, с начальным pH 7,9-8,3 (см. Патент РФ №2375910).

Недостатками предложенного способа являются:

- использование панкреатина для получения гидролизата, что приводит к увеличению его себестоимости по сравнению с гидролизатами, полученными при использовании бактериальных пищевых ферментных препаратов.

- диафильтрация полученного раствора, приводящая к дополнительным потерям белка.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в получении низкогидролизованных пептидных композиций из белков молочной сыворотки с привлекательными органолептическими характеристиками (без горечи), с антиоксидантной и гипотензивной активностью и пониженным содержанием белков-аллергенов молочной сыворотки, что дает возможность их использования при производстве функциональных пищевых продуктов массового потребления и специализированных пищевых продуктов для людей с пищевой непереносимостью белков молока.

«Protamex» является протеазным комплексом, продуцируемым микроорганизмами рода Bacillus. Активность ферментативного препарата составляет не менее 400 Протеолитических единиц на 1 г. Использование фермента «Protamex», разрешенного для применения в пищевых производствах и пищевых системах, обеспечивает приятный вкус готовому продукту без наличия горечи в отличие от известных аналогичных продуктов и серо-бежевый или кремовый цвет.

Технический результат достигается тем, что способ получения низкогидролизованных пептидных композиций белков молочной сыворотки включает приготовление белкового раствора (очистку молочной сыворотки, сепарирование), его пастеризацию, ультрафильтрацию, ферментативный гидролиз препаратом «Protamex» и пастеризацию полученного гидролизата для термической инактивации ферментного препарата «Protamex». Белковый раствор получают из сухого концентрата сывороточного белка, сухой молочной сыворотки или используют нативную подсырную сыворотку. При содержании жира в белковом растворе более 0,05% его обезжиривают пропусканием через сепаратор. Пастеризацию белкового раствора проводят при температуре от 75 до 85°C с выдержкой 20-30 с. Ультрафильтрацию белкового раствора проводят при температуре 8-12°C на ультрафильтрационных мембранах с молекулярной массой отсекаемых компонентов от 1 до 5 кДа до содержания сухих веществ в ретентате 8-18%. Перед внесением ферментного препарата «Protamex» ретентат подогревают до температуры 50-55°C и его начальное значение pH доводят добавлением 20% водного раствора гидроксида натрия до 7,0-7,2, а гидролиз ведут при температуре 50-55°C, дозе (E/S) ферментного препарата «Protamex» 2.5-4,0% от содержания белка в ретентате в течение 1,5 часов без pH-статирования, после чего полученный гидролизат пастеризуют при температуре 80-85°C в течение 5-10 минут.

Экспериментально было установлено, что оптимальная температура проведения гидролиза составляет 50-55°C. Отклонение в меньшую сторону ниже 50°C нежелательно, т.к. приводит к увеличенному содержанию остающихся в реакционной смеси негидролизованных высокомолекулярных белковых структур, что снижает выход получаемого продукта и приводит к снижению качества, повышению остаточной аллергенности гидролизата. Отклонение в большую сторону (свыше 55°C) также нежелательно, т.к. приводит к ускорению процесса термической инактивации ферментного препарата, что влечет за собой уменьшение выхода готового продукта. Кроме того, это приводит к перерасходу энергии на поддержание температуры в ходе процесса и последующее охлаждение готового продукта, что вызывает увеличение себестоимости продукта.

Экспериментально было установлено, что ультрафильтрация белкового раствора на мембранах с молекулярной массой отсекаемых компонентов от 1 до 5 кДа позволяет получить концентрат белков молочной сыворотки (ретентант) с максимальным выходом. Использование мембран с меньшей пористостью снижают выход как ретентата, так и конечного продукта (гидролизата).

Проведение гидролиза ретентата ферментным препаратом «Protamex» при установлении начального pH 7,0-7,2 ед., которое в течение гидролиза постепенно снижается, позволяет не проводить в дальнейшем pH-статирование, что уменьшает количество солей, поступающих в продукт, и, следовательно, улучшает его качество. Регулирование начального pH реакционной смеси осуществляют 20%-ным раствором щелочи (гидроксида натрия).

Пастеризация гидролизата необходима для улучшения его микробиологических показателей, а также термической инактивации ферментного препарата «Protamex». Уменьшение температуры пастеризации ниже заявленного диапазона значений приводит к возрастанию риска микробной контаминации гидролизата и продуктов на его основе при их последующем хранении.

Заявляемая совокупность признаков позволяет получить низкогидролизованные пептидные композиции белков молочной сыворотки с привлекательными органолептическими характеристиками, пониженной антигенностью, антиоксидантной и гипотензивной активностью. В заявляемом изобретении остаточная антигенность контролируется методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа и рассчитывается как отношение содержания аллергенов молочной сыворотки в гидролизате и ретентате.

Результаты определения содержания белков-аллергенов в ретентатах и гидролизатах молочной сыворотки представлены в таблице 1. Как видно из представленных данных остаточная антигенность гидролизатов по содержанию бычьего сывороточного альбумина не превышает 1,5%, α-лактальбумина - 11%, молочных белков, главным образом β-лактоглобулина - 85%.

Антиоксидантную емкость ретентата и гидролизатов белков молочной сыворотки определяли спектрофотометрическим методом TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) по отношению к катион-радикалу АБТС (диаммонийная соль 2-азинобис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты)) и спектрофлуориметрическим методом ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity) по отношению к пероксильному радикалу. Антиоксидантную емкость выражали концентрацией эквивалентов водорастворимого аналога витамина E - тролокса. Результаты определения антиоксидантной емкости в ретентатах и гидролизатах молочной сыворотки представлены в таблице 2. Показано, что в процессе ферментативного гидролиза антиоксидантная емкость гидролизатов увеличивалась в 1,8-2,0 раза по отношению к катион-радикалу АБТС и в 1,08-1,57 раза по отношению к пероксильному радикалу, что обусловлено образованием антиоксидантных пептидов и снятием стерических барьеров для взаимодействия остатков редокс-активных аминокислот с радикалами за счет разрушения третичной структуры белков молочной сыворотки. При этом увеличение дозы ферментного препарата «Protamex» с 2,5 до 4,0% от белка в ретентате приводит к увеличению антиоксидантной емкости получаемого гидролизата на 15-39% в зависимости от типа радикала (таблица 2).

Гипотензивную активность ретентата и гидролизатов белков молочной сыворотки определяли спектрофлуориметрическим методом по их способности ингибировать ангиотензин-1-превращающий фермент (АПФ), являющийся ключевым звеном реннин-ангиотензин-альдостероновой системы регуляции артериального давления. Для определения АПФ-ингибирующей активности гидролизатов и ретентата использовали субстрат с внутренним тушением флуоресценции трифторацетат o-аминобензоил-фенилаланил-аргинил-лизил(динитрофенил)-пролина. За величину гипотензивной активности принимали концентрацию гидролизатов и ретентата (мл/л), при которой наблюдалось 50% ингибирование активности АПФ. Результаты определения гипотензивной активности в ретентатах и гидролизатах молочной сыворотки представлены в таблице 2. Показано, что в процессе ферментативного гидролиза гипотензивная активность гидролизатов увеличивалась в 3,7-5,3 раза, что обусловлено образованием АПФ-ингибирующих пептидов. При этом увеличение дозы ферментного препарата «Protamex» с 2,5 до 4,0% от белка в ретентате приводит к увеличению гипотензивной активности получаемого гидролизата на 16% (таблица 2).

Идентификацию пептидов, присутствующих в гидролизатах молочной сыворотки, проводили путем их фракционирования методом препаративной гель-проникающей хроматографии с последующим хроматографическим анализом полученных фракций методом обращено-фазовой хроматографии с детекцией методом масс-спектрометрии ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье (FT-ICR-MS) и автоматическим поиском по базе данных белковых последовательностей UniProt KB_SwisProt sprot_v.57.9. В гидролизатах из белков молочной сыворотки идентифицировано 199 пептидов размером от 5 до 25 аминокислотных остатков (таблица 3), для которых основными белками предшественниками являлись бычий сывороточный альбумин, β-лактоглобулин, казеины. Среди идентифицированных пептидов 86 содержат остатки редокс-активных аминокислот (тирозина, триптофана, метионина, цистеина и гистидина), ответственных за антиоксидантные свойства соответствующих пептидов. Анализ последовательностей идентифицированных пептидов с помощью базы данных BioPep позволил установить наличие в составе пептидных композиций 2 пептидов VKEAMAPK и ЕАМАРК из β-казеина, обладающих антиоксидантной активностью, и 3 пептидов ALKAWSVAR (бычий сывороточный альбумин), AMKPWIQPK (αs₂-казеин) SAPLR (белок, взаимодействующий с белком, подобным фактору 6 АДФ-рибозилирования), обладающих АПФ-ингибирующей активностью.

Качественные преимущества получаемых гидролизатов заключаются в следующем:

- в пониженной антигенности за счет сниженного содержания аллергенов молочной сыворотки - α-лактальбумина, β-лактоглобулина, бычьего сывороточного альбумина;

- в наличии антиоксидантных и гипотензивных свойств;

- в привлекательных органолептических характеристиках, нейтральном вкусе без привкуса горечи;

- возможности использования при производстве функциональных пищевых продуктов массового спроса.

Благодаря этому гидролизаты в качестве белковых компонентов могут быть использованы для получения функциональных продуктов для профилактического питания детей и взрослых, предрасположенных к пищевой аллергии и непереносимости белков коровьего молока;

Способ получения пептидных композиций из белков молочной сыворотки осуществляется следующим образом.

Сухой концентрат сывороточных белков (КСБ) растворяют при постоянном перемешивании в питьевой воде с температурой (40-45)°C, охлаждают и оставляют набухать в течение 3,0-6,0 часов при перемешивании каждые 30 минут. Полученный раствор сывороточных белков пастеризуют при температуре 85°C с выдержкой 20 с, охлаждают и подают на ферментативный гидролиз.

Сухую молочную сыворотку растворяют при постоянном перемешивании в питьевой воде с температурой (40-45)°C, охлаждают и оставляют набухать в течение 3,0-6,0 часов при перемешивании каждые 30 минут. Полученный раствор сывороточных белков пастеризуют при температуре 85°C с выдержкой 20 с, охлаждают и подают на ультрафильтрацию.

Сыворотку подсырную нативную очищают, сепарируют на сепараторах-сливкоотделителях для обезжиривания, пастеризуют при температуре от 75 до 85°C с выдержкой 20-30 с, охлаждают и подают на ультрафильтрацию.

Раствор сывороточных белков разделяют на ультрафильтрационной установке с пропускной способностью мембран от 1 до 5 кДа, трансмембранном давлении 0,2-0,4 атм на ретентат (массовая доля сухих веществ 8-11% и фильтрат.

Ретентат или раствор КСБ подогревают до температуры 50-55°C, pH раствора доводят до 7,0-7,2 добавлением необходимого количества 20% водного раствора гидроксида натрия, псосле чего в реакционную смесь вносят ферментный препарат «Protamex» в дозировке 2,5-4,0% от количества белка в реакционной смеси.

Ферментативный гидролиз раствора сывороточных белков ведут с использованием ферментного препарата «Protamex» при температуре 50-55°C в течение 1,5 часов.

По окончании ферментации гидролизаты пастеризуют при температуре 80-85°C в течение 5-10 минут с последующим охлаждением до температуры 30±2°C. Полученные жидкие гидролизаты фасуют и направляют на хранение.

Следующие примеры иллюстрируют способ получения пептидных композиций из белков молочной сыворотки.

Пример 1

65 кг сухой сыворотки растворяют при перемешивании в питьевой воде (935 кг) с температурой 40°C до образования раствора с массовой долей сухих веществ (белок, жир, лактоза, соли) от 7%, охлаждают до 4°C и оставляют набухать в течение 3,0-6,0 часов при перемешивании каждые 30 мин. Полученный раствор сывороточных белков пастеризуют при температуре 85°C с выдержкой 20 с, затем охлаждают до температуры 40°C и подают на концентрирование на мембранах с пропускной способностью от 1 до 5 кДа. Используют полисульфоновые мембраны UF DHT 20-6338/30FF.

По окончании ультрафильтрации полученный ретентат с массовой долей сухих веществ 9% направляют на ферментативный гидролиз.

Ретентат подогревают до температуры 52-54°C, доводят его pH до 7,1 добавлением 3,2 л 20% раствора гидроксида натрия, после чего в реакционную смесь вносят 687.5 г ферментного препарата «Protamex» (2,5% от количества белка в реакционной смеси).

Ферментативный гидролиз ретентата ведут при температуре 52-54°C в течение 1,5 часов.

Гидролизаты пастеризуют при температуре 82-84°C в течение 10 минут с последующим охлаждением до температуры 30°C.

Получают 167 л пептидной композиции из белков молочной сыворотки с массовой долей сухих веществ 10,6%, массовой долей общего азота 0,43%, общим содержанием свободных аминокислот в эквивалентах глютаминовой кислоты 3,44±0,23 мг/мл, степенью гидролиза 4,91±0,26%, остаточной антигенностью по содержанию α-лактальбумина 4,6%, бычьего сывороточного альбумина 0,6%, β-лактоглобулина 72,1%, обладающей антиоксидантной и гипотензивной активностью (таблица 2).

Пример 2

Процесс проводят аналогично примеру 1. Отличается тем, что в реакционную смесь вносят 1100 г ферментного препарата «Protamex» (4,0% от количества белка в реакционной смеси).

Получают 160 л пептидной композиции из белков молочной сыворотки с массовой долей сухих веществ 9,9%, массовой долей общего азота 0,44%, общим содержанием свободных аминокислот в эквивалентах глютаминовой кислоты 3,78±0,25 мг/мл, степенью гидролиза 5,37±0,30%, остаточной антигенностью по содержанию α-лактальбумина 10,8%, бычьего сывороточного альбумина 1,3%, β-лактоглобулина 84,8%, обладающей антиоксидантной и гипотензивной активностью (таблица 2).

Таблица 1 Содержание белков-алергенов и остаточная аллергенность ретентатов и гидролизатов белков молочной сыворотки Образец C(молочного белка - αs₁-, αs₂-, β-, к-казеины и β-лактоглобулин), мг/мл, при иммуноанализе набором Ridascreen Fast Milk (R-Biopharm, Германия) Остаточная антигенность, % C(α-лактальбумина), мг/мл, при иммуноанализе набором E91018Bo (Life Science Inc., США) Остаточная антигенность, % C(бычьего сывороточного альбумина), мг/мл при иммуноанализе набором Bovine serum albumin (BSA) assay (Cygnus technologies Inc., США) Остаточная нтигенность,
% Получение пептидной композиции при E/S=2,5% УФ-ретентат молочной сыворотки 53,07±8,87 100,00 1,21±0,18 100,00 0,96±0,10 100,00 Гидролизат молочной сыворотки 38,24±7,60 72,06 0,055±0,001 4,55 0,006±0,002 0,63 Получение пептидной композиции при E/S=4,0% УФ-ретентат молочной сыворотки 53,42±7,78 100,00 0,87±0,13 100,00 0,98±0,07 100,00 Гидролизат молочной сыворотки 45,32±1,72 84,84 0,094±0,006 10,80 0,013±0,003 1,33

Таблица 2 Антиоксидантная емкость (мМ эквивалентов тролокса) и гипотензивная активность (IC50 мл/л) ретентатов и гидролизатов белков молочной сыворотки Образец Антиоксидантная емкость Гипотензивная активность (IC50) TEAC ORAC Получение пептидной композиции при E/S=2,5% УФ-ретентат молочной сыворотки 4,31±0,18 2,83±0,18 321,8 Гидролизат молочной сыворотки 7,77±0,19 3,07±0,19 86,8 Получение пептидной композиции при E/S=4,0% УФ-ретентат молочной сыворотки 4,47±0,15 2,72±0,14 395,0 Гидролизат молочной сыворотки E/S=4,0% 8,95±0,23 4,27±0,14 74,4

Таблица 3 Пептидный профиль гидролизатов белков молочной сыворотки Белок-предшественник Bos taurus Последовательность пептида Молекулярная масса, Да Acetyl-CoA carboxylase 1 LIAEK 572,3533 Sodium- and chloride-dependent glycine transporter ILEAK 572,3533 WDR12 LLEAK 572,3533 CE290 D1LQK 615,3592 Ras GTPase-activating protein 3 VFQSVK 706,4014 Beta-catenin-like protein 1 LLNKFTENDSEK 1436,715 Serum albumin DTHKSEIAHR 1192,595 K2CA LQDLK 615,3592 Structural maintenance of chromosomes protein 1A QESSR 605,2769 MKI67 FHA domain-interacting nucleolar phosphoprotein LLKCHFIPPEK 1323,737 Nuclear migration protein nudC INPENSK 800,4028 Adenylate cyclase type 1 LLNELFGK 932,5331

UPF0490 protein Clorf201 homolog AGFVSK 607,333 Complement C3 ADALVGK 672,3806 Protein KRI1 homolog KEILAK 700,4483 Thyroglobulin GQEIPGTR 856,4403 Mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM50 QMIIEPTSPCLLPDPLR 1922,001 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 (Fragments) XKNLLLNHMDVLK 1564,876 Endoplasmic reticulum protein ERp29 LIEKNK 743,4541 Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase SRAAVGNK 801,4457 Alpha-S2-casein ISQRYQK 921,5032 Cytochrome с oxidase subunit 8B, mitochondrial GWAVPK 656,3646 DnaJ homolog subfamily С member 14 EPKSAR 686,3711 Rho guanine nucleotide exchange factor 10-like protein LMRVK 661,3945 Pyruvate carboxylase, mitochondrial DTQAMK 692,3163 Selenium-binding protein 1 VIQVPPK 779,4905 Palmitoyl-protein thioesterase 1 KMVEKK 777,4418 Rab GTPase-binding effector protein 2 ASLPR 542,3176 Rho GDP-dissociation inhibitor 3 EIVSGLK 744,4381 ERP27 LVDNK 587,3279 Beta-2-microglobulin IVKWDRDL 1043,576 Serum albumin ALKAWSVAR 1000,582 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 LGREAASR 858,4671 Mitochondrial Rho GTPase 1 IDLQK 615,3592 Serum albumin YTRKVPQVSTPTLVEVSR 2059,143 STMN1 EVLQK 615,3592 Interleukin-12 subunit alpha LLMDPK 715,3938 Beta-casein VKEAMAPK 872,4789 Aconitate hydratase, mitochondrial NINIVRKR 1011,63 Seizure protein 6 homolog LISSPK 643,3905 GLNA KDPNK 600,3231 UPF0407 protein C2orf39 homolog FDEITVKWEEGK 1479,725 Hexokinase-1 GESAIS 562,2598 JSPR1 EPVSK 558,3013

Peroxisome assembly protein 12 OS=Bos taurus GN=PEX12 PE=2 SV=1 LAGVR 514,3227 ACTN4 EAMLK 590,3098 Protein THEMIS ILASEIR 800,4756 Myosin-2 VKQKLEK 871,5491 PAF VVASR 530,3176 ADP-ribosylation factor-like protein 6-interacting protein 6 SAPLR 542,3176 Fibrinogen gamma-B chain KTTMK 607,3363 Probable carboxypeptidase PM20D1 DGFIYGRGTLDNK 1454,715 Twinfilin-1 QLNYVQLEIDIK 1474,803 60S ribosomal protein L9 GTVQQADE 846,3719 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1B QEVIK 615,3592 Vacuolar protein-sorting-associated protein 36 LLLAEK 685,4374 N-terminal kinase-like protein GPMKLGTR 858,4745 TM223 ALQSLSARR 1000,578 Serum albumin SLGKVGTR 816,4818 Serum albumin AEFVEVTK 921,4807 Serum albumin AEFVEVTKLVTDLTK 1691,935 Serum albumin LSQKFPKAEFVEVTK 1749,967 ZNHI1 RVLDR 657,3922 Transmembrane protein 131-like QILSITK 801,496 Abnormal spindle-like microcephaly-associated protein homolog (Fragment) AGKHQR 695,3827 Uveal autoantigen with coiled-coil domains and ankyrin repeats protein DLLQK 615,3592 UPF0453 protein C12orf44 homolog VGEKLCEK 904,4688 Glucosamine-fructoses-phosphate aminotransferase [isomerizing] 2 NIENVK 715,3864 Tax 1-binding protein 1 homolog EIADKTEK 932,4814 Allergen Bos d 2 DKIVEGGPLR 1082,608 DCE1 ANFFR 653,3285 Beta-lactoglobulin LSFNPTQLEEQCHI 1657,777 Alpha-S2-casein LTEEEKNR 1017,509 Uncharacterized protein KIAA1539 homolog KGYSVPK 777,4385 WDR12 MPLFK 650,3462 Uncharacterized potential VYEDSGIPLPADSPK 1586,783

DNA-binding protein C17orf49 homolog     MYB TPAIK 528,3271 WD repeat-containing protein 92 DISMNK 706,332 DNA-directed RNA polymerases I, II, and III subunitRPABCl QSLVDMAPK 1003,501 LIGA QLDIK 615,3592 Protein ariadne-1 homolog VQDKYR 807,4239 Lethal(3)malignant brain tumor-like 2 protein GYLMK 626,3098 Complement C4 (Fragments) VLREDSR 873,4668 Protein FAM92A1 MKRDDLK 904,48 RNA-binding protein 5 EGSGLGRK 802,4297 Complement factor B VGSQYR 708,3555 MARCKS-related protein MGSQSSKAPR 1047,513 Acidic leucine-rich nuclear phosphoprotein 32 family member A KLENLK 743,4541 Semaphorin-3C ICPNDTGGLR 1101,524 cGMP-dependent 3',5'-cyclic phosphodiesterase MLDLMR 809,3775 Alpha-1-syntrophin MPILISK 816,4779 LysM and putative peptidoglycan-binding domain-containing protein 2 LDLQIK 728,4432 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 1-like 1 VDGSVRGEER 1102,537 Leucine-rich repeat-containing protein 41 KSEAK 561.3122 RAB6-interacting golgin TQAETMKLK 1048,559 COX assembly mitochondrial protein homolog TGIPTK 615,3592 Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 1 AVNQDK 673,3395 XPO2 LLAVSK 633,4197 Sodium-driven chloride bicarbonate exchanger EYGLSYLSLR 1201,623 Serum albumin DAFLGSFLYEYSR 1566,735 TT23L ASPIR 542,3176 Coiled-coil domain-containing protein 104 KDMKIK 761,4469   GTPIR 542,3176 E3 SUMO-protein ligase RanBP2 (Fragment) OS=Bos taurus GN=RANBP2 PE=2 SV=2 LVDTGR 659.3602

SDF2 EQVLK 615,3592 Flotillin-2 LKAEAYQK 949,5232 Myosin-Ic SELSDK 677,3232 Glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1 LPLSILKEK 1039,664 Cathelicidin-1 AVDQLNEQSSEPNIYR 1861,881 Alpha-1B-glycoprotein VLSPAGPEAQFELR 1512,794 Alpha-1B-glycoprotein SLLSELSDPVELRVAGS 1770,936 Ubiquitin-like domain-containing CTD phosphatase 1 DKELLK 744,4381 ERP27 QLDLK 615,3592 Leucine zipper putative tumor suppressor 2 LIPVSGKLEK 1082,67 RNA-binding protein 5 AAERREK 858,4671 Folate receptor alpha FYAENPTSGSTPQGI 1567,715 Zinc-alpha-2-glycoprotein RKWEAEAVYVQR 1533,805 Zinc-alpha-2-glycoprotein SLTRPLTVPWDPRQQAE 1993,038 Zinc-alpha-2-glycoprotein AEPLAPWSQVEGMEDWEKESALQR 2785,302 Zinc-alpha-2-glycoprotein RAEPLAPWSQVEGMEDWEKESALQR 2941,403 1 -phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase beta-4 (Fragment) IVAQYDK 835,444 Phosphatidylcholine transfer protein SGVIRVK 757,481 Glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1 SLFSHAFEVVKT 1363,714 LETM1 domain-containing protein 1 ALQMKALCR 1048,552 Polymeric immunoglobulin receptor AQDFQGR 820,3828 Polymeric immunoglobulin receptor KAQDFQGR 948,4777 Serum albumin IETMREK 905,464 Serum albumin FKDLGEEHFK 1248,614 Serum albumin LSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTK 2520,42 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(O) subunit gamma-11 GSCIIS 578,2734 Dynamin-l-like protein KEAADMLK 920,4637 UPF0609 protein C4orf27 homolog MVGGGAKR 790,412 Alpha-1-acid glycoprotein HAEDKLITR 1081,588 Monoacylglycerol lipase ABHD6 ELQESAAVEK 1102,551 KTEL motif-containing protein 1 MMAEVVRR 990,5103 Calcium-transporting ATPase type 2C member 1 YLSMLR 797,4105

Drebrin-like protein SV=1 LKSPFLQK 959,5804 Uncharacterized protein C14orf38 homolog KVKQELK 871,5491 Zinc-alpha-2-glycoprotein KWEAEAVYVQR 1377,704 Beta-casein INKKIEK 871,5491 GA-binding protein subunit beta-2 DMLKMTALHWATEHHHRDVVELLIK 3022,563 Aldehyde dehydrogenase family 3 member B1 IVMTAAAK 819,4524 Ropporin-1 ERSERVALSNWAELTPELLK 2340,244 Alpha-Si-casein EKVNELSK 945,5131 RL10A KLNKNKK 871,5603 Glycosylation-dependent cell adhesion molecule 1 SSRQPQSQNPK 1255,627 Nicotinate phosphoribosyltransferase LIAGPDK 712,4119 CDKN2AIP N-terminal-like protein MVGGEAAAAVEELISGVR 1757,898 28S ribosomal protein S34, mitochondrial LIAELARRVR 1195,751 Dynein intermediate chain 1, axonemal LLNLVREVK 1082,681 Protein kintoun QMLDATALEAVEK 1417,712 39S ribosomal protein L47, mitochondrial MAAASLAVFCR 1138,563 Brain acid soluble protein 1 DAQDTTKPEDK 1246,568 Histone-binding protein RBBP7 EGKIVDAK 858,4811 Nuclear factor 1B-type GIPLESTDGER 1172,567 Beta-casein EAMAPK 645,3156 3-oxoacyl-[acy1-carrier-protein] synthase, mitochondrial VSPFFVPK 919,5168 Transforming growth factor-beta receptor-associated protein 1 RNIPK 626,3864 NADH dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein 3, mitochondrial QSPPK 555,3017 UPF0534 protein C4orf43 homolog LNLIGEK 785,4647 F-actin-capping protein subunit beta DIVNGLR 785,4395 Melanocyte-stimulating hormone receptor MPALGSQRR 1014,539 Protein argonaute-2 VKFTK 621,385 S-adenosylmethionine synthetase isoform type-1 RSGQLPWLQPDSK 1510,789 Zinc finger CCHC domain-containing protein 12 TSIIARMSNSR 1250,64

COQ5 LLSQEK 716,4068 Uroplakin-3-like protein FLVMSDR 866,432 Folliculin FTKVDSRPKEDTQK 1677,869 Trichohyalin-like protein 1 QLPTKK 713,4436 Protein FAM92B LKDIQK 743,4541 UDP-glucose 6-dehydrogenase IAILGFAFK 978,5902 Transmembrane and coiled-coil domain-containing protein C6orf 129 homolog RSLEKEKSSLMNK 1564,824 General transcription factor II-I ALQSPKRPR 1051,625 Kinetochore protein Spc25 KENLLK 743,4541 Coiled-coil domain-containing protein 105 HSWVNISR 997,5094 Sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-2 AQDILAR 785,4395 GNAT2 EAKTVK 674,3963 Alpha-S2-casein AMKPWIQPK 1097,606 Electron transfer flavoprotein subunit beta LAEKEK 716,4068 ASAP1 KPFDK 633,3486 Fibroblast growth factor 5 LHASAK 625,3547 Sterol-4-alpha-carboxylate 3-dehydrogenase, decarboxylating MKFMIGNGK 1040,515 CO038 KFDPK 633,3486 SELT YPDIR 662,3388 Galactose-3-O-sulfotransferase 3 LQQATK 687,3915 Factor Xlla inhibitor VYDPKG 677,3384 Zinc finger protein 350 SPQSSVVLQEK 1200,635 SUCB1 LQGTR 573,3235 GMFB VFEIR 662,3752 Cleavage and polyadenylation specificity factor subunit 2 QVLLR 627,4068 Nucleotide exchange factor SIL1 LQQYR 706,3762 DNA nucleotidylexotransferase KMGTTR 708,3589 Heat shock factor-binding protein 1 IDDMSSR 822,3542 Dynamin-1 DEMLR 678,3007 LisH domain-containing protein ARMC9 SMTYLK 741,3731 Uncharacterized protein KIAA1462 homolog LDGAVPAPDPR 1106,572 DnaJ homolog subfamily C NEFYK 699,3228

member 27     Calcyclin-binding protein MQQKSQRK 1048,545 Leucine-rich repeat-containing protein 28 HKNLFLNYR 1203,651

Группа изобретений относится к молочной промышленности. Белковый раствор с содержанием жира не более 0,05% получают из сухого концентрата сывороточного белка, сухой молочной сыворотки или нативной подсырной сыворотки. Белковый раствор пастеризуют, ультрафильтруют при 8-12°C на ультрафильтрационных мембранах с молекулярной массой отсекаемых компонентов от 1 до 5 кДа до массовой доли сухих веществ в ретентате 8-18%. Температуру ретентата молочной сыворотки доводят до 50-55°C, а его начальное значение pH - до 7,0-7,2 добавлением 20%-ного водного раствора гидроксида натрия. Осуществляют ферментативный гидролиз препаратом «Protamex» 2,5-4,0% от массы белка в ретентате при 50-55°C 1,5 ч без pH-статирования и пастеризуют полученный гидролизат при 80-85°C 5-10 мин. Пептидная композиция имеет степень гидролиза не более 6%, суммарное содержание свободных аминокислот в эквивалентах глютаминовой кислоты не более 4 мг/мл, пониженное содержание аллергенов молочной сыворотки α-лактальбумина, β-лактоглобулина и бычьего сывороточного альбумина и обладает антиоксидантной и гипотензивной активностью. Группа изобретений направлена на получение продукта с привлекательными органолептическими характеристиками (нейтральный вкус без горечи), с антиоксидантной и гипотензивной активностью и пониженным содержанием белков аллергенов молочной сыворотки. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Способ получения низкогидролизованной пептидной композиции из белков молочной сыворотки, включающий получение белкового раствора, его пастеризацию, ультрафильтрацию, ферментативный гидролиз и пастеризацию полученного гидролизата, отличающийся тем, что белковый раствор с содержанием жира не более 0,05% получают из сухого концентрата сывороточного белка, сухой молочной сыворотки или нативной подсырной сыворотки, ультрафильтрацию белкового раствора проводят при температуре 8-12°C на ультрафильтрационных мембранах с молекулярной массой отсекаемых компонентов от 1 до 5 кДа до массовой доли сухих веществ в ретентате 8-18%, перед внесением ферментного препарата температуру ретентата молочной сыворотки доводят до 50-55°C, а его начальное значение pH - до 7,0-7,2 добавлением 20%-ного водного раствора гидроксида натрия, ферментативный гидролиз ведут препаратом «Protamex» в дозировке 2,5-4,0% от массы белка в ретентате при температуре 50-55°C в течение 1,5 ч без pH-статирования, а полученный гидролизат пастеризуют при температуре 80-85°C в течение 5-10 мин.

2. Пептидная композиция, полученная указанным выше способом, со степенью гидролиза не более 6%, суммарным содержанием свободных аминокислот в эквивалентах глютаминовой кислоты не более 4 мг/мл, пониженным содержанием аллергенов молочной сыворотки α-лактальбумина, β-лактоглобулина и бычьего сывороточного альбумина, и обладающая антиоксидантной и гипотензивной активностью.