СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВА Российский патент 2011 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к области медицины и фармакологии и может быть использовано для оценки антиокислительных свойств природных минеральных материалов, а также различных медицинских препаратов и пищевых продуктов.

Известна система для испытания антиокислительной активности полимерных алкиларилполиэфирспиртов, в качестве молекулы-мишени окислителей применяют салицилат. Гидроксильный радикал реагирует с салициловой кислотой (2-оксибензойной кислотой) с образованием двух диоксибензойных кислот, в частности 2,3- и 2,5-диоксибензойной кислоты. Эти гидроксилированные продукты являются доказательством образования OH. Определение 2,3- и 2,5-диоксибензойных кислот осуществляют при помощи жидкостной хроматографии высокого разрешения с электрохимическим детектором. Для образования и обнаружения ОН используют суспензии 10 мкМ FeCl₃, 1,0 мМ H₂O₂, 1,0 мМ аскорбата и 10,0 мкМ салициловой кислоты. Добавляют 0,1 мл нормального солевого раствора или тилоксапола (конечные концентрации от 0,0 до 10 мг/мл). Реакционные смеси выдерживают при 45°C в течение 30 мин и центрифугируют в течение 10 мин при 1200 g. Надосадочную жидкость центрифугируют (Beckman Microfuge E) через трубчатый фильтр (0,22 микрона) (PGC Scientific N 352-118) при 15000 g 100 мкл образца элюата подают в колонку ЖХВР 018 RP (250×4,7 мм. Beckman N 235329). Гидроксилированные продукты салицилата определяют количественно при помощи электрохимического детектора Coulochem (ESA модель 5100А), причем восстановительный потенциал детектора устанавливают равным 0,40 B (постоянный ток). Окислительный потенциал предохранительной ячейки (используемой в качестве экрана) устанавливают на +0,40 B (постоянный ток). Измерения проводятся дважды (RU 2147235, 10.04.2000).

Известна также другая методика, предназначенная для анализа пептидов, состоящая в определении физического показателя пептидов, имеющих сшивки 3-гидроксипиридиния. Один из подобных физических показателей основывается на электрохимическом детектировании. Метод заключается в инъектировании аликвоты биологической жидкости, например мочи, в электрохимический детектор, основанный на окислительно-восстановительном потенциале. Рекомендовано использовать амперометрический или кулонометрический детектор. Кулонометрический детектор более чувствителен в данной системе, поскольку достигается полное окисление или восстановление анализируемой молекулы в колоночном элюенте. Отсеивающие или охранные электроды могут быть помещены в восходящем направлении от аналитического электрода с селективным окислением или восстановлением мешающих веществ, значительным улучшением в результате селективности. Для разрушения мешающих веществ устанавливают одну или несколько ячеек предварительной обработки (RU 2139541, 10.10.1999).

Известен количественный способ определения альфа-токоферола, являющегося антиоксидантом, в котором осуществляют электрохимическое определение токоферола методом циклической вольтамперометрии. Данный метод основывается на способности токоферолов к 1-электронному окислению и реализуется с помощью системы для электрохимических измерений, состоящей из программатора ПР-8, потенциостата ПИ-50 и прибора двухкоординатного регистрирующего ПДА-1. Измерения вели в электрохимической ячейке, сопряженной с системой для электрохимических измерений. Рабочий объем ячейки 3 мл. В качестве рабочего электрода использовали платиновый стационарный дисковый электрод (d 2 мм). Электрод сравнения хлорсеребряный с водонепроницаемой диафрагмой. Вспомогательный электрод - платиновая спираль. Так как электрохимические измерения проводились в неводных средах, предусматривалась аналоговая компенсация омических потерь с помощью потенциостата ПИ-50 (RU 2102747, 20.01.1998).

Однако все вышеописанные технические решения пригодны только для анализа индивидуальных веществ.

Известен также способ определения антиоксидантной активности вещества, включающий введение оцениваемого вещества в организм опытных животных, забой опытных и контрольных животных, приготовление биопрепаратов из тканей и органов обеих групп животных и выявление, и количественную оценку веществ-индикаторов обменных процессов в организме названных животных (пат. США №4615877), (пат. США №4615877). Однако известный способ построен на выявлении только одного параметра, варьирующего достаточно широко в зависимости от ряда факторов, оказывающих влияние на него, что снижает достоверность оценки антиоксидантной активности вещества, кроме того, заявленный способ не позволяет оценить антиоксидантную активность цеолитов.

Цеолиты - нестехиометрические соединения, их составы изменяются в широких пределах, образуя ряды твердых растворов. Известно более 40 минеральных видов природных цеолитов.

Природные цеолиты являются молекулярными ситами, т.е. микропористыми телами, способными избирательно поглощать вещества, размеры молекул которых меньше размеров микропор (для проникания в адсорбционную полость молекула адсорбата должна иметь критический диаметр меньше размера входного окна). Кристаллохимические особенности, способность к катионному обмену, потере и поглощению воды и иных молекул без разрушения структурного каркаса обусловливают и другие свойства цеолитов, которые служат также ионитами и катализаторами.

Природный цеолит в дыхательном тракте не всасывается, не попадает в кровь сам, как кристалл, а проходит транзитом, взаимодействуя только на уровне селективного ионного обмена и избирательной сорбции при контакте с кровеносными и лимфатическими сосудами, отдавая или забирая микромакроэлементы, катализируя биохимические реакции.

Задача, на решение которой направлено заявленное решение, выражается в обеспечении возможности достоверной оценки антиоксидантной активности вещества, в том числе и цеолитов.

Технический результат, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в обеспечении возможности получения достоверной оценки антиоксидантной активности цеолитов и других природных и синтетических материалов, при обеспечении возможности сравнительной оценки веществ по этому параметру.

Для решения поставленной задачи, способ определения антиоксидантной активности вещества, включающий введение оцениваемого вещества в организм опытных животных, забой опытных и контрольных животных, приготовление биопрепаратов из тканей и органов обеих групп животных и выявление, и количественную оценку веществ-индикаторов обменных процессов в организме названных животных, отличается тем, что введение оцениваемого вещества в организм опытных животных выполняют ингаляционным путем, при этом в обеих группах определяют содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких, в плазме крови, в эритроцитах и тромбоцитах, которые переводят в баллы, и суммируют по выражению:

Паа=Л+Кп+Э+Т,

где Паа - показатель антиоксидантной активности вещества, балл (от 0 до 4); Л - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких, балл; Кп - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в плазме крови, балл; Э - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в эритроцитах, балл; Т - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в тромбоцитах, балл, кроме того, большее значение суммы баллов соответствует большей антиоксидантной активности вещества, при этом оценку антиоксидантной активности вещества производят относительно нормальных значений содержания продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов (N), которые определяют как среднее арифметическое соответствующих показателей, полученных на животных контрольной группы, причем, значение показателя Л принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям Церулоплазмина (Ц, мг/100 г), Малонового диальдегида (МД, нмоль/г), Гидроперекиси (ГП, нмоль/г), Диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и Витамина Е (BE, мкг/г) в ткани легких, составляет от 3 до 6, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Л принимают равным 0 баллов, при этом, если содержание церулоплазмина отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то Ц=1, если превышает значение N+10%, то Ц=2, если меньше значения N-10%, то Ц=0, при этом, если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то МД=1, если превышает значение N+10%, то МД=2, если меньше значения N-10%, то МД=0, при этом, если содержание гидроперекиси отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ГП=1, если превышает значение N+10%, то ГП=2, если меньше значения N-10%, то ГП=0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ДК=1, если превышает значение N+10%, то ДК=2, если меньше значения N - 10%, то ДК=0, при этом, если содержание витамина E отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ВЕ=1, если превышает значение N+10%, то ВЕ=2, если меньше значения N-10%, то BE=0, причем значение показателя Кп принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям Церулоплазмина (Ц, мг/100 г), Малонового диальдегида (МД, нмоль/г), Гидроперекиси (ГП, нмоль/г), Диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и Витамина E (BE, мкг/г) в плазме крови, составляет от 3 до 6, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Кп принимают равным 0 баллов, при этом, если содержание церулоплазмина отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то Ц=1, если превышает значение N+10%, то Ц=2, если меньше значения N-10%, то Ц=0, при этом, если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то МД=1, если превышает значение N+10%, то МД=2, если меньше значения N - 10%, то МД=0, при этом, если содержание гидроперекиси отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ГП=1, если превышает значение N+10%, то ГП=2, если меньше значения N - 10%, то ГП=0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ДК=1, если превышает значение N+10%, то ДК=2, если меньше значения N-10%, то ДК=0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то BE=1, если превышает значение N+10%, то BE=2, если меньше значения N-10%, то BE=0, причем, значение показателя Э принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям Малонового диальдегида (МД, нмоль/г), Диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и Витамина E (BE, нмоль/мл) в эритроцитах, находится в пределах от 1 до 4, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Э принимают равным 0 баллов, при этом, если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то МД=1, если превышает значение N+10%, то МД=2, если меньше значения N-10%, то МД=0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ДК=1, если превышает значение N+10%, то ДК=2, если меньше значения N-10%, то ДК=0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то BE=1, если превышает значение N+10%, то ВЕ=2, если меньше значения N-10%, то BE=0, причем значение показателя Т принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям Малонового диальдегида (МД, нмоль/г), Диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и Витамина E (BE, нмоль/мл) в тромбоцитах, находится в пределах от 1 до 4, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Т принимают равным 0 баллов, при этом, если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то МД=1, если превышает значение N+10%, то МД=2, если меньше значения N-10%, то МД=0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ДК=1, если превышает значение N+10%, то ДК=2, если меньше значения N - 10%, то ДК=0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то BE=1, если превышает значение N+10%, то ВЕ=2, если меньше значения N - 10%, то BE=0, кроме того, ввод веществ в организм животного выполняют через его дыхательные пути.

Сравнение признаков заявленного решения с признаками аналогов и прототипа свидетельствует о его соответствии критерию "новизна".

Признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.

Признаки, указывающие, что «введение оцениваемого вещества в организм опытных животных выполняют ингаляционным путем», обеспечивают возможность точного дозирования оцениваемого вещества, получаемого опытными животными.

Признаки, указывающие, что в обеих группах животных (контрольной и опытной) «определяют содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких, в плазме крови, в эритроцитах и тромбоцитах», позволяют повысить достоверность оценки, поскольку последняя производится в количественной форме, на основе учета «работы» нескольких систем организма, при учете широкого спектра естественных антиоксидантов, отражающих реакцию этих систем на воздействие испытуемым материалом, величина которой зачастую не зависит или наоборот существенно зависит от параллельно контролируемых параметров.

Признаки, указывающие, что содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких, в плазме крови, в эритроцитах и тромбоцитах «переводят в баллы, и суммируют по выражению Паа=Л+Кп+Э+Т,

где Паа - показатель антиоксидантной активности вещества, балл (от 0 до 4); Л - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких, балл; Кп - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в плазме крови, балл; Э - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в эритроцитах, балл; Т - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в тромбоцитах, балл» позволяют выполнить количественную оценку антиоксидантной активности любого вещества и тем самым сравнить и ранжировать их по этому показателю.

Признак «большее значение суммы баллов соответствует большей антиоксидантной активности вещества» позволяет сопоставлять вещества по их антиоксидантной активности.

Признаки «оценку антиоксидантной активности вещества производят относительно нормальных значений содержания продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов (N), которые определяют как среднее арифметическое соответствующих показателей, полученных на животных контрольной группы» позволяют сформировать базу для количественной оценки показателей содержания продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в исследуемых тканях животного и соответствующей их оценки в баллах.

Признаки «значение показателя Л принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям Церулоплазмина (Ц, мг/100 г), Малонового диальдегида (МД, нмоль/г), Гидроперекиси (ГП, нмоль/г), Диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и Витамина E (BE, мкг/г) в ткани легких, составляет от 3 до 6, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Л принимают равным 0 баллов» позволяют однозначно, с позиций заявленного способа, оценить в баллах параметры антиоксидантного воздействия на основе исследований тканей легких.

Признаки «если содержание церулоплазмина отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то Ц=1, если превышает значение N+10%, то Ц=2, если меньше значения N-10%, то Ц=0, при этом, если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то МД=1, если превышает значение N+10%, то МД=2, если меньше значения N - 10%, то МД=0, при этом, если содержание гидроперекиси отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ГП=1, если превышает значение N+10%, то ГП=2, если меньше значения N-10%, то ГП=0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ДК=1, если превышает значение N+10%, то ДК=2, если меньше значения N-10%, то ДК=0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то BE=1, если превышает значение N+10%, то BE=2, если меньше значения N-10%, то ВЕ=0» обеспечивают оценку содержания продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов, в тканях легких и их бальную оценку в рамках определения параметра Л.

Признаки «значение показателя Кп принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям Церулоплазмина (Ц, мг/100 г), Малонового диальдегида (МД, нмоль/г), Гидроперекиси (ГП, нмоль/г), Диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и Витамина E (BE, мкг/г) в плазме крови, составляет от 3 до 6, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Кп принимают равным 0 баллов» позволяют однозначно, с позиций заявленного способа, оценить в баллах параметры антиоксидантного воздействия на основе исследований плазмы крови.

Признаки «если содержание церулоплазмина отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то Ц=1, если превышает значение N+10%, то Ц=2, если меньше значения N-10%, то Ц=0, при этом, если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то МД=1, если превышает значение N+10%, то МД=2, если меньше значения N-10%, то МД=0, при этом, если содержание гидроперекиси отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ГП=1, если превышает значение N+10%, то ГП=2, если меньше значения N-10%, то ГП=0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на±10%, то ДК=1, если превышает значение N+10%, то ДК=2, если меньше значения N-10%, то ДК=0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ВЕ=1, если превышает значение N+10%, то ВЕ=2, если меньше значения N -10%, то ВЕ=0» обеспечивают оценку содержания продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов, в плазме крови и их балльную оценку в рамках определения параметра Кп.

Признаки «значение показателя Э принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям Малонового диальдегида (МД, нмоль/г), Диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и Витамина Е (BE, нмоль/мл) в эритроцитах, находится в пределах от 1 до 4, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Э принимают равным 0 баллов» позволяют однозначно, с позиций заявленного способа, оценить в баллах параметры антиоксидантного воздействия на основе исследований эритроцитов.

Признаки «если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то МД=1, если превышает значение N+10%, то МД=2, если меньше значения N - 10%, то МД=0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ДК=1, если превышает значение N+10%, то ДК=2, если меньше значения N-10%, то ДК=0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ВЕ=1, если превышает значение N+10%, то ВЕ=2, если меньше значения N-10%, то ВЕ=0» обеспечивают оценку содержания продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов, в эритроцитах крови и их балльную оценку в рамках определения параметра Э.

Признаки «значение показателя Т принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям Малонового диальдегида (МД, нмоль/г), Диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и Витамина Е (BE, нмоль/мл) в тромбоцитах, находится в пределах от 1 до 4, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Т принимают равным 0 баллов» позволяют однозначно, с позиций заявленного способа, оценить в баллах параметры антиоксидантного воздействия на основе исследований тромбоцитов.

Признаки «если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то МД=1, если превышает значение N+10%, то МД=2, если меньше значения N-10%, то МД=0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ДК=1, если превышает значение N+10%, то ДК=2, если меньше значения N-10%, то ДК=0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на ±10%, то ВЕ=1, если превышает значение N+10%, то ВЕ=2, если меньше значения N-10%, то ВЕ=0» обеспечивают оценку содержания продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов, в тромбоцитах крови и их балльную оценку в рамках определения параметра Т.

Признаки «ввод веществ в организм животного выполняют через его дыхательные пути» упрощают реализацию способа с позиций дозирования воздействия.

Пример конкретного исполнения.

Исследования проводились на белых беспородных крысах. Для экспериментальной активации перекисного окисления липидов животные облучались низкоэнергетическим лазерным излучением. Низкоэнергетическое лазерное облучение было выбрано как фактор, в определенных дозировках подавляющий функциональную активность клеток системы местного иммунитета. Для облучения применялся импульсный инфракрасный лазер «Agnis-L01» с длиной волны 850 нм, энергией импульса 3,7·10^-7 Дж, частотой повторения импульса 240-1400 Гц и модуляции 8-69 Гц. Облучалась грудная клетка в 6 зонах (субаксилярной, скапулярной и субскапулярной, справа и слева) по 10 сек 1 раз в день на протяжении 15 дней.

Часть животных до облучения подвергалась ингаляции с применением цеолитсодержащих (морденитовых и клиноптилолитовых) туфов из двух месторождений (Куликовское и Вангинское) Амурской области. Цеолиты измельчались с помощью ультразвукового дезинтегратора Bandelin Sonopulse 3400. Степень измельчения цеолитов составляла около 1-5 мкм. Ингаляционный ввод в легкие цеолитов выполняли ультразвуковым ингалятором УРСА-0,25П (Россия). Количество тонкодисперсного цеолита и продолжительность пребывания животного в клетке 1 принимают из расчета получения животным дозы цеолита от 100 до 1000 мг/кг веса (1 раз в день по 40 мин).

Животные были разделены на 4 группы по 20 особей: Контроль - интактные животные; Лазер - животные, облучавшиеся низкоэнергетическим лазером; Куликовское+лазер и Вангинское+лазер - животные, которым ингаляционно вводились цеолиты Куликовского и Вангинского месторождений (соответственно) при облучении низкоэнергетическим лазером.

Для оценки антиоксидантных свойств цеолита определяют уровень содержания продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови и в ткани легких крыс. При этом используют известные биохимические методы, включающие: приготовление гомогенатов легких; выделение и отмывку цельных эритроцитов для опытов in vitro; выделение и отмывку тромбоцитов для постановки опытов in vitro; экстракцию липидов из плазмы крови и гомогенатов легких; определение церулоплазмина в плазме крови, определение содержания малонового диальдегида; определение диеновых конъюгатов; определение гидроперекисей липидов; определение содержания витамина Е.

Приготовление гомогенатов легких.

После забоя животных, вскрывали грудную и брюшную полости, легкие перфузировали 0,15 М раствором КСl, содержащим 5 мМ трис-HCl буфер, pH 7,4. Легкие измельчали ножницами, взвешивали и гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса с тем же буфером в соотношении 1:5 в течение 1 мин. Приготовленный гомогенат использовали для определения содержания в нем продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и естественных антиоксидантов.

Выделение и отмывку цельных эритроцитов для опытов in vitro проводят согласно описаниям, приведенным в книге Ашкинази И.Я. Эритроциты и внутреннее тромбопластообразование. - Л.: Наука, 1977, 155 с.

Выделение и отмывку тромбоцитов для постановки опытов in vitro проводят согласно описаниям, приведенным в книге «Агрегация тромбоцитов: методы изучения и механизмы» / Самаль А.Б., Черенкевич С.Н., Хмара Н.Ф. - Мн.: Университетское, 1990. - 104 с.

Экстракция липидов из плазмы крови и гомогенатов легких осуществляется по методу Блайя-Дайера (см. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. - М.: Мир, 1975. - 322 с.).

Определение церулоплазмина в плазме крови. Метод основан на окислении р-фенилендиамина при участии церулоплазмина (см. Колб В.Г., Камышников B.C. Клиническая биохимия. Минск, 1976. - 312 с.).

Определение содержания малонового диальдегида. МД определяли в плазме крови и гомогенатах легких по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (см. Бородин Е.А. Стабилизация и реактивация цитохрома Р-450 фосфатидилхолином при перекисном окислении липидов / Е.А.Бородин, А.И.Арчаков // Биологические мембраны. - 1987. - №7. - С.719-728).

Определение диеновых конъюгатов. 0,1 мл спиртового раствора липидов вносили в кювету спектрофотометра СФ-16, в которой находились 2,9 мл абсолютного спирта. Оптическую плотность измеряли при длине волны 233 нм с ходом луча 10 мм. Для пересчета использовали коэффициент мольной экстинкции 2,2·10^-5 М^-5 см^-5 (см. Стальная Е.А. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С.63-64). Величину диеновых конъюгат выражали в нмолях на г ткани или мл крови.

Определение гидроперекисей липидов. Количество гидроперекисей липидов определяли на основе их способности окислять ионы Fe²⁺ с последующей реакцией на Fe³⁺ с тиоцианатом аммония (см. Романова Л.А. Метод определения гидроперекисей липидов с помощью тиоционата аммония / Л.А.Романова, И.Д.Стальная // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С.64-66).

Определение содержания витамина Е. Содержание витамина Е определяли в липидных экстрактах из плазмы крови и тканей по цветной реакции с дипиридилом и FeCl₃ (см. Кисилевич Р.Ж. Определение витамина Е в сыворотке крови / Р.Ж.Кисилевич, С.И.Скварко // Лаб. дело. - 1972. - №8. - С.473-475) в модификации М.А.Штарберга (см. Штарберг М.А. Антиокислительные свойства комбинированных препаратов фосфолипидов с производными малоновой и тиобарбитуровой кислот: Дисс. канд. мед. наук / М.А.Штарберг. - Благовещенск, 1996. - 178 с.).

Данные биохимических исследований сведены в таблицы 1 и 2.

Таблица 1 Содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких и плазме крови в экспериментальных группах ГРУППЫ Церулоплазмин, мг/100 г Диеновые конъюгаты, нмоль/г МД, нмоль/г Гидроперекиси, нмоль/г Витамин Е, мкг/г ткани легких Контроль 39,02±2,54 р<0,001 221,76±14,86 р<0,001 8,84±1,22 р<0,002 90,58±4,4 р<0,001 205,44±7,38 р<0,01 Лазер 33,43±1,34 р<0,001 299,34±18,67 р<0,001 13,54±1,1 р<0,001 102,21±6,7 р<0,001 200,35±8,51 р<0,001 Вангинское+лазер 38,3±1,94 р<0,001 237,24±12,29 р<0,001 12,44±1,38 р<0,001 92,0±3,96 р<0,001 198,26±9,83 р<0,001 Куликовское+лазер 38,98±2,56 р<0,001 259,58±15,25 р<0,001 11,32±1,35 р<0,002 92,14±5,93 р<0,001 197,5±8,60 р<0,001 плазма крови Контроль 21,44±1,27 р<0,001 51,82±5,15 р<0,001 4,92±1,15 р<0,02 20,18±1,21 р<0,001 27,16±1,69 р<0,001 Лазер 19,12±0,89 р<0,001 68,23±5,6 р<0,001 5,3±1,32 р<0,001 29,89±2,05 р<0,001 26,34±1,82 р<0,001 Вангинское+лазер 11,58±4,82 р<0,1 35,0±7,35 р<0,001 4,96±0,8 р<0,005 24,88±0,87 р<0,001 29,08±2,16 р<0,001 Куликовское+лазер 21,18±0,55 р<0,1 52,72±6,1 р<0,01 4,44±0,54 р<0,002 27,24±2,28 р<0,001 21,94±1,28 р<0,001

Таблица 2 Биохимические показатели продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах и тромбоцитах Показатель
Группа Диеновые конъюгаты (нмоль/г) МД (нмоль/г) Витамин Е (мкг/г)   Эритроциты Тромбоциты Эритроциты Тромбоциты Эритроциты Тромбоциты Контроль 56,6±3,3 61,6±3,5 5,5±0,3 6,1±0,5 2,0±0,1 5,1±1,0 Вангинское 43,4±2,3 54,0±1,4 4,1±0,2 5,1±0,2 4,1±0,1 5,6±0,1 Куликовское 47,8±2,5 56,2±2,0 4,3±0,2 5,3±0,3 3,7±0,1 5,3±0,3

Далее, используя приведенные табличные данные, определяем по формуле Паа=Л+Кп+Э+Т величину показателя Паа.

Для Вангинского месторождения

А. Определение продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких (Л).

1) Церулоплазмин, мг/100 г. Содержание церулоплазмина 35,66±2,41 мг/100 г, что соответствует N±10% (39,02±2,54 мг/100 г), значит Ц=1.

2) Малоновый диальдегид (МД), нмоль/г. Содержание МД 8,88±0,98 нмоль/г, что соответствует N±10% (8,84±1,22), значит МД=1.

3) Гидроперекиси, нмоль/г. Содержание гидроперекисей 89,4±4,8 нмоль/г, что соответствует N±10%) (90,6±4,4 нмоль/г), значит ГП=1.

4) Диеновые конъюгаты (ДК), нмоль/г. Содержание диеновых конъюгат 235,5±9,9 нмоль/г, что соответствует N±10%) (221,7±14,8 нмоль/г), т.е. ДК=1.

5) Витамин Е, мкг/г. Содержание витамина Е 190,1±5,5 мкг/г, что больше N±10% (205,4±7,4 мкг/г), значит ВЕ=0.

Таким образом, Л=1, так как Ц(1)+МД(1)+ГП(1)+ДК(1)+ВЕ(0)=4

Б. Определение продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в плазме крови (Кп).

1) Церулоплазмин, мг/100 г. Содержание церулоплазмина 20,28±3,24 мг/100 г, что соответствует N±10% (21,44±1,27 мг/100 г), значит Ц=1.

2) Малоновый диальдегид (МД), нмоль/г. Содержание МД 3,72±0,39 нмоль/г, что меньше N±10% (4,92±0,45 нмоль/г), значит МД=0.

3) Гидроперекиси, нмоль/г. Содержание гидроперекисей 24,58±4,52 нмоль/г, что соответствует N±10% (20,18±1,21 нмоль/г), значит ГП=1.

4) Диеновые конъюгаты (ДК), нмоль/г. Содержание диеновых конъюгат 23,62±4,4 нмоль/г, что меньше N±10% (51,82±5,15 нмоль/г), значит ДК=0.

5) Витамин Е, мкг/г. Содержание витамина Е 28,42±2,10 мкг/г, что соответствует N±10% (27,16±1,69), значит ВЕ=1.

Таким образом, КП=1, Ц(1)+МД(0)+ГП(1)+ДК(0)+ВЕ(1)=3

В. Определение продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в эритроцитах (Э).

1) Малоновый диальдегид (МД), нмоль/г. Содержание МД 4,1±0,2 нмоль/г, что меньше N±10% (5,5±0,3 нмоль/г), значит МД=0.

2) Диеновые конъюгаты (ДК), нмоль/г. Содержание диеновых конъюгат 43,4±2,3 нмоль/г, что меньше N±10% (56,6±3,3 нмоль/г), значит ДК=0.

3) Витамин Е, нмоль/мл. Содержание витамина Е 4,1±0,1 мкг/г, что больше N±10% (4,1±0,1 мкг/г), значит ВЕ=2.

Таким образом, Э=1, так как МД(0)+ДК(0)+ВЕ(2)=2

Г. Определение продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в тромбоцитах (Т).

1) Малоновый диальдегид (МД), нмоль/г. Содержание МД 5,1±0,2 нмоль/г, что меньше N±10% (6,1±0,5 нмоль/г), значит МД=0.

2) Диеновые конъюгаты (ДК), нмоль/г. Содержание диеновых конъюгат 54,0±1,4 нмоль/г, что меньше N±10% (61,6±3,5), значит ДК=0.

3) Витамин Е, нмоль/мл. Содержание витамина Е 5,6±0,1 мкг/г, что соответствует N±10% (5,1±1,0), значит ВЕ=1.

Таким образом, Т=1, так как МД(0)+ДК(0)+ВЕ(1)=1

ИТОГО: Величина показателя Паа для Вангинского месторождения

Паа=Л+Кп+Э+Т=1+1+1+1=4

Для Куликовского месторождения

А. Определение продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких (Л).

1) Церулоплазмин, мг/100 г. Содержание церулоплазмина 32,27±1,0 мг/100 г, что меньше N±10% (39,02±2,54 мг/100 г), значит Ц=0.

2) Малоновый диальдегид (МДА), нмоль/г. Содержание МД 10,56±0,92 нмоль/г, что больше N±10% (8,84±1,22), значит МД=2.

3) Гидроперекиси, нмоль/г. Содержание гидроперекисей 110,6±10,9 нмоль/г, что больше N±10% (90,6±4,4 нмоль/г), значит ГП=2.

4) Диеновые конъюгаты (ДК), нмоль/г. Содержание диеновых конъюгат 261,6±13 нмоль/г, что больше N±10% (221,7±14,8 нмоль/г), значит ДК=2.

5) Витамин Е, мкг/г. Содержание витамина Е 189,4±4,2 мкг/г, что меньше N±10% (205,4±7,4 мкг/г), значит ВЕ=0.

Таким образом, Л=1, так как Ц(0)+МД(2)+ГП(2)+ДК(2)+ВЕ(0)=6

Б. Определение продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в плазме крови (Кп).

1) Церулоплазмин, мг/100 г. Содержание церулоплазмина 19,25±1,43 мг/100 г, что соответствует N±10% (21,44±1,27 мг/100 г), значит Ц=1.

2) Малоновый диальдегид (МДА), нмоль/г. Содержание МДА 7,15±0,63 нмоль/г, что больше N±10% (4,92±0,45 нмоль/г), значит МД=2.

3) Гидроперекиси, нмоль/г. Содержание гидроперекисей 29,47±1,92 нмоль/г, что больше N±10% (20,18±1,21 нмоль/г), значит ГП=2.

4) Диеновые конъюгаты (ДК), нмоль/г. Содержание диеновых конъюгат 59,85±5,63 нмоль/г, что больше N±10% (51,82±5,15 нмоль/г), значит ДК=2.

5) Витамин Е, мкг/г. Содержание витамина Е 24,33±1,88 мкг/г, что меньше N±10% (27,16±1,69), значит ВЕ=0.

Таким образом, КП=0, Ц(1)+МД(2)+ГП(2)+ДК(2)+ВЕ(0)=7

В. Определение продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в эритроцитах (Э)

1) Малоновый диальдегид (МДА), нмоль/г. Содержание МДА 4,3±0,2 нмоль/г, что меньше N±10% (5,5±0,3 нмоль/г), значит МД=0.

2) Диеновые конъюгаты (ДК), нмоль/г. Содержание диеновых конъюгат 47,8±2,5 нмоль/г, что меньше N±10% (56,6±3,3 нмоль/г), значит ДК=0.

3) Витамин Е, нмоль/мл. Содержание витамина Е 3,7±0,1 мкг/г, что меньше N±10%) (4,1±0,1 мкг/г), значит ВЕ=0.

Таким образом, Э=0, так как Мд(0)+ДК(0)+ВЕ(0)=0

Г. Определение продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в тромбоцитах (Т).

1) Малоновый диальдегид (МДА), нмоль/г. Содержание МДА 5,3±0,3 нмоль/г, что меньше N±10% (6,1±0,5 нмоль/г), значит МД=0.

2) Диеновые конъюгаты (ДК), нмоль/г. Содержание диеновых конъюгат 56,2±2,0 нмоль/г, что меньше N±10% (61,6±3,5), значит ДК=0.

3) Витамин Е, нмоль/мл. Содержание витамина Е 5,3±0,3 мкг/г, что соответствует N±10% (5,1±1,0), значит ВЕ=1.

Таким образом, Т=1, так как МД(0)+ДК(0)+ВЕ(1)=1

ИТОГО: Величина показателя Паа для Куликовского месторождения

Паа=Л+Кп+Э+Т=1+0+0+1=2

Низкоэнергетическое лазерное излучение в использованной дозировке обладает прооксидантным действием. Как следует из данных таблиц 1, 2 в группе Куликовское+лазер, по сравнению с группой «Контроль» в ткани легких и в плазме крови было выявлено достоверное повышение содержания диеновых конъюгат и МД в гомогенате легких, увеличение содержания гидроперекисей, снижение концентрации церулоплазмина и витамина Е. Это говорит о функциональном снижении активности антиоксидантной системы при ингаляции цеолитов Куликовского месторождения в сочетании с низкоэнергетическим лазерным излучением. Это может быть обусловлено небольшим повреждением легочной ткани цеолитом Куликовского месторождения и стимуляцией воспаления лазерным излучением. Результаты в группе Вангинское+цеолит были следующие: обнаружено повышения МД в гомогенате легких и снижение церулоплазмина, повышение гидроперекисей и МД в плазме крови. С другой стороны наблюдается статистически достоверное снижение диеновых конъюгатов и статистически значимое увеличение концентрации витамина Е в плазме крови.

Таким образом, при лазерном излучении, индуцирующем перекисное окисление липидов (ПОЛ), цеолиты Вангинского месторождения проявляют себя как вещества с выраженными антиоксидантными свойствами (Паа=4). Цеолиты Куликовского месторождения, являясь по типу кристаллической решетки преимущественно морденитом (игольчатая структура), наоборот частично стимулируют ПОЛ, что приводит к снижению показателя Паа (Паа=2), до уровня существенно меньшего аналогичного показателя для цеолитов Вангинского месторождения.

Изобретение относится к области медицины и фармакологии и может быть использовано для оценки антиоксидантных свойств природных материальных объектов. Для определения антиоксидантной активности цеолитов вводят оцениваемое вещество в организм опытных животных. Готовят биопрепараты из тканей и органов опытных и контрольных групп животных. Проводят количественную оценку веществ-индикаторов обменных процессов. Определяют содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких, в плазме крови, в эритроцитах и тромбоцитах, которые переводят в баллы, и суммируют. Оценку антиоксидантной активности цеолита производят относительно нормальных значений содержания продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов, которые определяют как среднее арифметическое соответствующих показателей, полученных на животных контрольной группы. Использование изобретения обеспечивает возможность получения достоверной оценки антиоксидантной активности цеолитов при обеспечении возможности сравнительной оценки веществ по этому параметру. 2 табл.

Способ определения антиоксидантной активности цеолитов, включающий их введение в организм опытных животных, забой опытных и контрольных животных, приготовление биопрепаратов из тканей и органов обеих групп животных, выявление и количественную оценку веществ-индикаторов обменных процессов в организме названных животных, причем на животных оказывают воздействие, подавляющее функциональную активность клеток системы местного иммунитета легких, для этого облучают грудную клетку животных в субаксилярной, скапулярной и субскапулярной зонах, справа и слева, посредством импульсного инфракрасного лазера с длиной волны 850 нм, энергией импульса 3,7·10^-7 Дж, частотой повторения импульса 240-1400 Гц и модуляции 8-69 Гц, при этом оцениваемый цеолит в организм опытных животных вводят ингаляционным путем, причем в обеих группах определяют содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких, в плазме крови, в эритроцитах и тромбоцитах, которые переводят в баллы, и суммируют по выражению:
Паа=Л+Кп+Э+Т,
где Паа - показатель антиоксидантной активности цеолита, балл (от 0 до 4);
Л - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в ткани легких, балл;
Кп - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в плазме крови, балл;
Э - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в эритроцитах, балл;
Т - показатель, отражающий содержание продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов в тромбоцитах, балл,
при этом оценку антиоксидантной активности цеолита производят относительно нормальных значений содержания продуктов перекисного окисления липидов и естественных антиоксидантов (N), которые определяют как среднее арифметическое соответствующих показателей, полученных на животных контрольной группы, причем значение показателя Л принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям церулоплазмина (Ц, мг/100 г), малонового диальдегида (МД, нмоль/г), гидроперекиси (ГП, нмоль/г), диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и витамина Е (BE, мкг/г) в ткани легких, составляет от 3 до 6, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Л принимают равным 0 баллов, при этом, если содержание церулоплазмина отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то Ц равно 1, если превышает значение N на 10%, то Ц равно 2, если меньше значения N на 10%, то Ц равно 0, при этом, если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то МД равно 1, если превышает значение N на 10%, то МД равно 2, если меньше значения N на 10%, то МД равно 0, при этом, если содержание гидроперекиси отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то ГП равно 1, если превышает значение N на 10%, то ГП равно 2, если меньше значения N на 10%, то ГП равно 0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то ДК равно 1, если превышает значение N на 10%, то ДК равно 2, если меньше значения N на 10%, то ДК равно 0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то BE равно 1, если превышает значение N на 10%, то BE равно 2, если меньше значения N на 10%, то BE равно 0, причем значение показателя Кп принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям церулоплазмина (Ц, мг/100 г), малонового диальдегида (МД, нмоль/г), гидроперекиси (ГП, нмоль/г), диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и Витамина Е (BE, мкг/г) в плазме крови, составляет от 3 до 6, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Кп принимают равным 0 баллов, при этом, если содержание церулоплазмина отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то Ц равно 1, если превышает значение N на 10%, то Ц равно 2, если меньше значения N на 10%, то Ц равно 0, при этом, если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то МД равно 1, если превышает значение N на 10%, то МД равно 2, если меньше значения N на 10%, то МД равно 0, при этом, если содержание гидроперекиси отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то ГП равно 1, если превышает значение N на 10%, то ГП равно 2, если меньше значения N на 10%, то ГП равно 0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то ДК равно 1, если превышает значение N на 10%, то ДК равно 2, если меньше значения N на 10%, то ДК равно 0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то BE равно 1, если превышает значение N на 10%, то BE равно 2, если меньше значения N на 10%, то BE равно 0, причем значение показателя Э принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям малонового диальдегида (МД, нмоль/г), диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и витамина Е (BE, нмоль/мл) в эритроцитах, находится в пределах от 1 до 4, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Э принимают равным 0 баллов, при этом, если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то МД равно 1, если превышает значение N на 10%, то МД равно 2, если меньше значения N на 10%, то МД равно 0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то ДК равно 1, если превышает значение N на 10%, то ДК равно 2, если меньше значения N на 10%, то ДК равно 0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то BE равно 1, если превышает значение N на 10%, то BE равно 2, если меньше значения N на 10%, то BE равно 0, причем значение показателя Т принимают равным 1 баллу, если суммарное значение баллов, соответствующих содержаниям малонового диальдегида (МД, нмоль/г), диеновых конъюгатов (ДК, нмоль/г) и витамина Е (BE, нмоль/мл) в тромбоцитах, находится в пределах от 1 до 4, а при значениях, меньших или больших названного предела, значение показателя Т принимают равным 0 баллов, при этом, если содержание малонового диальдегида отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то МД равно 1, если превышает значение N на 10%, то МД равно 2, если меньше значения N на 10%, то МД равно 0, при этом, если содержание диеновых конъюгатов отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то ДК равно 1, если превышает значение N на 10%, то ДК равно 2, если меньше значения N на 10%, то ДК равно 0, при этом, если содержание витамина Е отклоняется от нормальных значений не более чем на 10%, то BE равно 1, если превышает значение N на 10%, то BE равно 2, если меньше значения N на 10%, то BE равно 0.