Способ определения антиоксидантной активности химических соединений Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, в частности к медицинской биофизике, клинической фармакологии, биохимии, патофизиологии, онкологии и иммунологии, и может быть использовано для медикобиологических исследований с целью определения про- и антиоксидант- ной активности различных химических соединений.

Цель изобретения - повышение точности и селективности способа при одновременном расширении его функциональных возможностей.

Способ осуществляют следующим образом.

Силиконизированные стеклянные флаконы с буфером, состоящим из физиологических концентраций NaCl, KC1, KHjjPO.,., NazHP04, HEPES, L-глутамина и глюкозы и применяемым для выделения клеток, добавляют 1 мл раствор а, содержащего 50 мкг люминола, 0,1 мл нейтрофилов ( /мл), исследуемые химические соединения. Регистрацию хемилюминесценции (ХМ) осуществляют сразу после добавления препаратов в течение 1-4 мин на жидкостном сцинтилляционном счетчике LS-1800 (Весктап). Для индукции ХЛ добавляют в среду инкубации 0,01 мл латекса (диаметр частиц - 1,7 мкм) и вновь

регистрируют ХЛ нейтрофилов. При этом вещество, снижающее спонтанную ХЛ относят к антиоксидантам, а повышающее - к прооксидантам. В случае снижения ХЛ активированных нейтрофилов при неизменной или увеличенной ХЛ интактных нейтрофилов устанавливают, что анти- оксидантная активность связана q подавлением фагоцитоза.

Пример 1. Гепгаринизир ованную венозную кровь отстаивали в течение 30 мин при 37°С, плазму наслаивали на двойной градиент фиколлверографи- на (q - 1,077, q 1,093). Поспе 30 мин центрифугирования при 1500 об/ /мин на границе двух градиентов образовалось кольцо нейтрофилов, которые удаляли, отмывали дважды в буфере, содержащем физиологические концентра- ции NaCl, KC1, KKgPO, , HEPES, L-глутамин и глюкозу (рН 7,4); центрифугировали с ускорением 1500 g в течение 10 мин. Затем клетки ресус- лендировали, доводили до концентрации 106 /мл и использовали для определения ХЛ. Жизнеспособность нейтрофилов оценивали по эксклюзии трипанового (синего и во всех экспериментах она составляла 99-100%.

В качестве прооксидантов использовали известные соединения: мкМ НгОг(0,01 мл 3% раствора), 1 мМ НАДФ-Нг В качестве антиоксидантов использовали глутатион (I мМ) и среднемолеку- лярные пептиды (СМП) крови в количестве 20-40 мкг/мл. Кроме того, исследовали химические соединения с неизвестной ранее оксидантной активностью: акридиновый оранжевый (0,002 мг/мл), солкосерил (200 мкг/мл) и спиртовый экстракт плазмы крови (200 мкг/мл). Для выявления оптимальных режимов индуцированной ХЛ использованы различные активаторы - полистирольные моно- дисперсные латексы 00,5; 1,0; 1,7; 2,11; 2,65 мкм, латекс 0 1,7 мкм с сорбированным IgG, ревматоидный диаг- ностикум, (латекс с сорбированным у- глобулином и опсонизированный зимозан (Sigma).

ХЛ измеряли в имп/мин. Интенсивность вспышки оценивали как отношение к ХЛ интактных нейтрофилов в условных единицах, общую сумму вспышки оце нивали за все время исследования, среднее значение интенсивности вспышки оценивали в условных единицах.

5 0 5 0

5

50

Полученные результаты свидетельствуют о том, что полистирольный латекс {ф,1 мкм) является наиболее оптимальным стимулятором ХЛ нейтрофилов, так как максимальная вспышка ХЛ отмечается в 1-2 мин регистрации и амплитуда вспышки на него является наибольшей по сравнению с другими активаторами.

л .

Ионы Fe существенно стимулируют спонтанную и индуцированную ХЛ в 5,7 и 1,6 раз соответственно: НАДФН в 1,35 и 1,6 раз; НгОе в 13,6 раз стимулирует спонтанную ХЛ, несколько снижая индуцированную ХЛ; глутатион снижает спонтанную и индуцированную ХЛ в 3 раза; акридиновый оранжевый в 4 и 6 раз соответственно; СПМ крови в 6 и 7 раз; солкосерил в 1,5 и 3 раза; спиртовый экстракт крови в Зи80 раз.

Пример 2. В таблице приведены данные о влиянии различных химических соединений на спонтанную и индуцированную латексом ХЛ нейтрофилов, выделенных из другой пробы крови,

Оценивали светосумму свечения как средний результат интенсивности ХЛ за период наблюдения (имп/мин).

Про- или антиоксидантная активность химических соединений оценивалась в процентах как отношение свето- суммы свечения нейтрофилов в присутствии исследуемых химических соединений к светосумме свечения интактных или активированных латексом нейтрофилов.

Предложенное техническое решение расширяет функциональные возможности способа путем определения не только антиоксидантной, но и прооксидантной активности (действие ионов Fe14, Н20г, СМП крови от обо.жженных животных). Расширение функциональных возможностей способа и повышение его селективности также демонстрируется возможностью дифференцированного подхода к изучению влияния химических соединений на спонтанную ХЛ интактных нейтрофилов и ХЛ, индуцированную латексом, т.е. сопряженную с фагоцитозом.

Возможность выявлять химические соединения, антиоксидантная активность которых связана с подавлением фагоцитоза (путем исследования уровней спонтанной и индуцированной латексом ХЛ нейтрофилов человека, в случае снижения ХЛ активированных нейтрофилов при неизменной или увеличенной ХЛ интактных нейтрофилов) является существенным преимуществом данного способа. Это дает возможность отбирать лекарственные средства с противовоспалительным действием, в частности препараты, влияющие на фа- гоцитоз.

Формула изобретения

1.Способ определения антиокси- дантной активности химических соединений путем введения исследуемого химического соединения в биологический объект, индукции свободнорадикаль ного окисления и оценки антиоксидант- ной активности по разнице интенсивности хемилюминесценции в присутствии

и Отсутствие исследуемого соединения, отличающийся тем, что, с целью повышения точности при одновременном расширении функциональных возможностей способа за счет одновременного определения прооксидантной активности, в качестве биологического объекта используют нейтрофилы человека, измеряют хемилюминесценцию нейтрофилов и при снижении хемилюминесценции в присутствии исследуемого Соединения определяют антиоксидантную активность, при повышении - проокси- дантную активность.

2.Способ по п.1, отличающий с я тем, что, с целью повышения селективности способа, используют нейтрофилы человека, активированные латексом, и в случае снижения хемилюминесценции активированных нейтрофилов на фоне неизменной или увеличенной хемилюминесценции интактных неитрофилов устанавливают, что антиокси- дантная активность химических соединений связана с подавлением фагоцитоза.

Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине, в частности к медицинской биофизике, клинической фармакологии, биохимии, патофизиологии, и может быть использовано для определения про- и антиоксидантной активности химических соединений. С целью повышения точности при одновременном расширении функциональных возможностей способа за счет одновременного определения прооксидантной активности определяют уровни спонтанной и индуцированной латексом диаметром 1,7 мкм хемилюминесценции нейтрофилов в присутствии исследуемых соединений и без них (сходный уровень), и при снижении уровней хемилюминесценции нейтрофилов в присутствии химических соединений относительно исходного определяют антиоксидантную активность исследуемых химических соединений, а при повышении уровней хемилюминесценции нейтрофилов в присутствии исследуемых соединений относительно исходного - прооксидантную активность. табл.1.

Редактор О.Спесивых

Составитель И.Гуляева

Техред Л.Олийнык Корректор Э.Лончакова

Заказ 8094/S1

Тираж 789

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное