ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ HDAC ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МИЕЛОМЫ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/4045 A61K45/00 A61K31/495 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к применению ингибиторов гистондеацетилазы (HDAC) для изготовления лекарственного средства для лечения миеломы, к способу лечения теплокровного животного, в особенности человека, страдающего миеломой, включающему введение таковому животному терапевтически эффективного количества ингибитора HDAC, в особенности соединения формулы (I), как оно определено в контексте, к комбинации, включающей ингибитор HDAC и соединение, вызывающее апоптоз клеток миеломы, предпочтительно бортезомиб, а также, необязательно, хотя бы один фармацевтически приемлемый носитель для одновременного, раздельного или последовательного применения, и к фармацевтической композиции и коммерческой упаковке, содержащей упомянутую комбинацию.

Термин "миелома", как он употребляется в контексте, относится к опухоли, состоящей из клеток, относящихся к типу, встречающемуся в нормальном случае в костном мозге. Термин "множественная миелома", как он употребляется в контексте, означает рассеянное злокачественное новообразование из плазматических клеток, характеризуемое множественными очагами опухоли костного мозга и секрецией М-компонента (фрагмента моноклонального иммуноглобулина), связанного с широко распространившимися остеолитическими поражениями, приводящими к болям в костях, патологическим переломам, гиперкальциемии и нормохромной нормоцитарной анемии. Множественная миелома не поддается лечению общепринятыми видами химиотерапии, а равно и химиотерапией в высоких дозах.

Соединения формулы (I), как они определены в контексте, являются ингибиторами гистондеацетилазы (ингибиторами HDAC). Обратимое ацетилирование гистонов является главным регулятором экспрессии генов, действующим путем изменения доступности транскрипционных факторов к ДНК. В нормальных клетках гистондеацетилаза (HDA) и гистонацетилтрансфераза совместно контролируют уровень ацетилирования гистонов с целью поддержания баланса. Ингибирование HDA приводит к накоплению сверхацетилированых гистонов, что вызывает разнообразные клеточные реакции.

Недавно было неожиданно обнаружено, что ингибиторы HDAC, в особенности соединения формулы (I), как они определены в контексте, непосредственно ингибируют пролиферацию клеточных линий миеломы и миеломных клеток у пациентов, экспрессирующих fms-подобную тирозинкиназу-1 (Flt-1). Кроме того, данные соединения ингибируют миграцию клеток миеломы, как следует из анализа межъячеечной миграции клеток в планшете. Более того, данные соединения могут ингибировать как пролиферацию клеток миеломы, связанных со стромальными клетками костного мозга (КСКМ), так и секрецию интерлейкина IL-6, вызванную связыванием клеток миеломы с КСКМ.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является применение ингибитора HDAC для изготовления лекарственного средства для лечения миеломы.

Соединения - ингибиторы HDAC

Представляющие особый интерес соединения - ингибиторы HDAC для применения в комбинации по настоящему изобретению являются гидроксаматными производными, описываемыми формулой (I)

в которых

R₁ является водородом, галоидом или неразветвленным (С₁-С₆)алкилом, в особенности метилом, этилом или н-пропилом, каковые метильный, этильный и н-пропильный заместители являются незамещенными или замещенными одним или более заместителями, описанными ниже для алкильных заместителей,

R₂ выбран из водорода, (С₁-С₁₀) алкила, предпочтительно (С₁-С₆)алкила, например метила, этила или -СН₂СН₂-ОН, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкилалкила, циклоалкилалкила, например циклопропилметила, арила, гетероарила, арилалкила, например бензила, гетероарилалкила, например пиридилметила, - (СН₂)_nC(O)R₆, -(СН₂)_nOC(O)R₆, аминоацила, HON-С(O)-СН=С(R₁)-арилалкила- и -(CH₂)_nR₇,

R₃ и R₄ являются одинаковыми или различными заместителями, независимо выбранными из водорода, (С₁-С₆)алкила, ацила или ациламиногруппы, или

R₃ и R₄ совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, представляют собой С=O, C=S или C=NR₈,

или

R₂ совместно с атомом азота, к которому он присоединен, и R₃ совместно с атомом углерода, к которому он присоединен, могут образовывать (С₄-С₉)гетероциклоалкил, гетероарил, полигетероарил, неароматический полигетероцикл или смешанное арильное и неарильное полигетероциклическое кольцо,

R₅ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила,

(С₄-С₉)гетероциклоалкила, ацила, арила, гетероарила, арилалкила, например бензила, гетероарилалкила, например пиридилметила, ароматических полициклических групп, неароматических полициклических групп, смешанных арильных и неарильных полициклических групп, полигетероарила, неароматических полигетероциклов и смешанных арильных и неарильных полигетероциклов,

n, n₁, n₂ и n₃ являются одинаковыми или различными числами, независимо выбранными из 0-6, причем в тех случаях, когда n₁ равняется 1-6, каждый атом углерода может быть независимо от прочих необязательно замещен R₃ и/или R₄,

Х и Y являются одинаковыми или различными заместителями, независимо выбранными из водорода, галоида, (С₁-С₄)алкила, такого как СН₃ и CF₃, NO₂, C(O)R₁, OR₉, SR₉, CN и NR₁₀R₁₁,

R₆ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, циклоалкилалкила, например циклопропилметила, арила, гетероарила, арилалкила, например бензила и 2-фенилэтенила, гетероарилалкила, например пиридилметила, OR₁₂ и NR₁₃ R₁₄,

R₇ выбран из OR₁₅, SR₁₅, S(O)R₁₆, SO₂R₁₇, NR₁₃R₁₄ и NR₁₂SO₂R₆,

R₈ выбран из водорода, OR₁₅, NR₁₃R₁₄, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила, например бензила, и гетероарилалкила, например пиридилметила,

R₉ выбран из (С₁-С₄)алкила, например СН₃ и CF₃, С(O)-алкила, например С(O)СН₃, и С(O)CF₃,

R₁₀ и R₁₁ являются одинаковыми или различными заместителями, независимо выбранными из водорода, (С₁-С₄)алкила и -С(O)-алкила,

R₁₂ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкилалкила, арила, смешанной арильной и неарильной полициклической группы, гетероарила, арилалкила, например бензила, и гетероарилалкила, например пиридилметила,

R₁₃ и R₁₄ являются одинаковыми или различными заместителями, независимо выбранными из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)пиклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила, например бензила, гетероарилалкила, например пиридилметила и аминоацила,

или

R₁₃ и R₁₄ совместно с атомом азота, к которому они присоединены, являются (С₄-С₉)гетероциклоалкилом, гетероарилом, полигетероарилом, неароматическим полигетероциклом или смешанным арильным и неарильным полигетероциклом,

R₁₅ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила и (CH₂)_mZR₁₂,

R₁₆ выбран из (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, полигетероарила, арилалкила, гетероарилалкила и (CH₂)_m, ZR₁₂,

R₁₇ выбран из (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, ароматических полициклических групп, гетероарила, полигетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, полигетероарила и NR₁₃R₁₄,

m является целым числом, выбранным среди 0-6, и

Z выбран среди О, NR₁₃, S и S(O),

или их фармацевтически приемлемой солью.

Как это является принятым, термин "незамещенный" означает, что заместители отсутствуют или же единственными заместителями являются атомы водорода.

Галоидные заместители выбраны из фтора, хлора, брома и иода, предпочтительно фтора или хлора.

Алкильные заместители включают неразветвленные и разветвленные (С₁-С₆)алкилы, если иное не оговорено специально. Примеры подходящих неразветвленных и разветвленных (С₁-С₆)алкильных заместителей включают метил, этил, н-пропил, 2-пропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил и им подобные. Если иное не оговорено специально, алкильные заместители включают как незамещенные алкильные группы, так и алкильные группы, замещенные одним или более подходящими заместителями, включающими ненасыщенность, т.е. наличие одной или более двойной или тройной С-С связи, ацил, циклоалкил, галоид, оксиалкил, алкиламиногруппу, аминоалкил, ациламиногруппу и OR₁₅, например алкоксигруппу. Предпочтительные заместители для алкильных групп включают галоид, гидроксигруппу, алкоксигруппу, оксиалкил, алкиламиногруппу и аминоалкил.

Циклоалкильные заместители включают (С₃-С₉) циклоалкильные группы, такие как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и им подобные, если иное не оговорено специально. Если иное не указано специально, циклоалкильные заместители включают как незамещенные циклоалкильные группы, так и циклоалкильные группы, замещенные одним или более подходящими заместителями, включающими (С₁-С₆)алкил, галоид, гидроксигруппу, аминоалкил, оксиалкил, алкиламиногруппу и группу OR₁₅, такую как алкоксигруппа. Предпочтительные заместители для циклоалкильных групп включают галоид, гидроксигруппу, алкоксигруппу, оксиалкил, алкиламиногруппу и аминоалкил.

Вышеприведенное обсуждение заместителей для алкила и циклоалкила относится также к алкильным фрагментам других заместителей, таких как, не ограничиваясь указанными, алкоксигруппа, алкиламиногруппы, алкилкетогруппы, арилалкил, гетероарилалкил, алкилсульфонильные и алкиловые сложноэфирные заместители и им подобные.

Гетероциклоалкильные заместители включают 3-9-членные алифатические циклы, такие как 4-7-членные алифатические циклы, содержащие от 1-3 гетероатомов, выбранных из азота, серы и кислорода. Примеры подходящих гетероциклоалкильных заместителей включают пирролидил, тетрагидрофурил, тетрагидротиофуранил, пиперидил, пиперазил, тетрагидропиранил, морфолиновую группу, 1,3-диазапан, 1,4-диазапан, 1,4-оксазепан и 1,4-оксатиапан. Если иное не оговорено специально, циклы являются незамещенными или же замещенными по атомам углерода одним или более подходящими заместителями, включающими (С₁-С₆)алкил, (С₄-С₉)циклоалкил, арил, гетероарил, арилалкил, например бензил, гетероарилалкил, например пиридилметил, галоид, аминогруппу, алкиламиногруппу и OR₁₅, например алкоксигрупу. Если иное не оговорено специально, гетероатомы азота являются незамещенными или же замещенными водородом, (С₁-С₄)алкилом, арилалкилом, например бензилом, гетероарилалкилом, например пиридилметилом, ацилом, аминоацилом, алкилсульфонильной группой и арилсульфонильной группой.

Циклоалкилалкильные заместители включают соединения формулы - (СН₂)_n5 - циклоалкил, где n5 является числом от 1 до 6. Подходящие алкилциклоалкильные заместители включают циклопентилметил, циклопентилэтил, циклогексилметил и им подобные. Подобные заместители являются незамещенными или же замещенными по алкильному фрагменту или по циклоалкильному фрагменту подходящим заместителем, включающим перечисленное выше для алкила и циклоалкила.

Арильные заместители включают незамещенный фенил и фенил, замещенный одним или более подходящими заместителями, включающими (С₁-С₆)алкил, циклоалкилалкил, например циклопропилметил, O(СО)алкил, оксиалкил, галоид, нитрогруппу, аминогруппу, алкиламиногруппу, аминоалкил, алкилкетогруппы, нитрил, карбоксиалкил, алкилсульфонильную группу, аминосульфонильную группу, арилсульфонильную группу и группу OR₁₅, такую как алкоксигруппа. Предпочтительные заместители включают (С₁-С₆)алкил, циклоалкил, например циклопропилметил, алкоксигруппу, оксиалкил, галоид, нитрогруппу, аминогруппу, алкиламиногруппу, аминоалкил, алкилкетогруппы, нитрил, карбоксиалкил, алкилсульфонильную группу, арилсульфонильную группу и аминосульфонильную группу. Примеры подходящих арильных групп включают (С₁-С₄)алкилфенил, (С₁-С₄)алкоксифенил, трифторметилфенил, метоксифенил, гидроксиэтилфенил, диметиламинофенил, аминопропилфенил, карбэтоксифенил, метансульфофенил и толилсульфофенил.

Ароматические полициклы включают нафтил, а также нафтил, замещенный одним или более подходящими заместителями, включающими (С₁-С₆)алкил, алкилциклоалкил, например, циклопропилметила, оксиалкил, галоид, нитрогруппу, аминогруппу, алкиламиногруппу, аминоалкил, алкилкетогруппы, нитрил, карбоксиалкил, алкилсульфонильную группу, арилсульфонильную группу, аминосульфонильную группу и группу OR₁₅, такую как алкоксигруппа.

Гетероарильные заместители включают соединения с 5-7-членным ароматическим циклом, содержащие один (или более) гетероатом, например от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из азота, кислорода и серы. Типичные гетероарильные заместители включают фурил, тиенил, пиррол, пиразол, триазол, тиазол, оксазол, пиридин, пиримидин, изоксазолил, пиразин и им подобные. Если иное не оговорено специально, гетероарильные заместители являются незамещенными или же замещенными по атомам углерода одним или более подходящими заместителями, включающими алкил, алкильные заместители, указанные выше, и другие гетероарильные заместители. Атомы азота являются незамещенными или же замещенными, например R₁₃. Наиболее полезные заместители по атому азота включают водород, (С₁-С₄)алкил, ацил, аминоацил и сульфонильную группу.

Арилалкильные заместители включают группы формулы -(СН₂)_n5-арил, -(СН₂)_n5-1-(СН-арил)-(СН₂)_n5-рил или -(СН₂)_n5-1СН(арил) (арил), где арил и n5 отвечают вышеприведенным определениям. Подобные арилалкильные заместители включают бензил, 2-фенилэтил, 1-фенилэтил, толил-3-пропил, 2-фенилпропил, дифенилметил, 2-дифенилэтил, 5,5-диметил-3-фенилпентил и им подобные. Арилалкильные заместители являются незамещенными или же замещенными по алкильному остатку, или по арильному остатку, или по ним обоим таким образом, как это описано выше для алкильных и арильных заместителей.

Гетероарилалкильные заместители включают группы формулы -(СН₂)_n5 - гетероарил, где гетероарил и n5 отвечают вышеприведенным определениям, а мостиковая группа связана с атомом углерода или азота гетероарильного фрагмента, такие как 2-, 3- или 4-пиридилметил, имидазолилметил, хинолилэтил и пирролилбутил. Гетероарилалкильные заместители являются незамещенными или же замещенными таким образом, как это обсуждено выше для гетероарильных и алкильных заместителей.

Аминоацильные заместители включают группы формулы -С(O)-(СН₂)_n-C(H)(NR₁₃R₁₄)-(CH₂)_n-R₅, где n, R₁₃, R₁₄ и R₅ отвечают вышеприведенным описаниям. Подходящие аминоацильные заместители включают природные и синтетические аминокислоты, такие как глицинил, D-триптофанил, L-лизинил, D- или L-гомосеринил, ацильный остаток 4-аминомасляной кислоты и ±-3-амин-4-гексеноил.

Неароматические полициклические заместители включают бициклические и трициклические конденсированные системы циклов, в которых каждый из циклов может являться 4-9-членным и каждый из циклов может содержать нуль, одну или более двойных и/или тройных связей. Подходящие примеры неароматических полициклов включают декалин, октагидроинден, пергидробензоциклогептен и пергидробензо-[f]-азулен. Подобные заместители являются незамещенными или же замещенными таким образом, как это описано выше для циклоалкильных групп.

Смешанные арильные и неарильные полициклические заместители включают бициклические и трициклические конденсированные системы циклов, в которых каждый из циклов может являться 4-9-членным, причем хотя бы один цикл является ароматическим. Подходящие примеры смешанных арильных и неарильных полициклов включают метилендиоксифенил, бис-метилендиоксифенил, 1,2,3,4-тетрагидронафталин, дибензоциклогептан, дигидроантрацен и 9H-флуорен. Подобные заместители являются незамещенными или же замещенными нитрогруппой или таким образом, как это описано выше для циклоалкильных групп.

Полигетероарильные заместители включают бициклические и трициклические конденсированные системы циклов, в которых каждый из циклов может независимо от остальных являться 5- или 6 - членным, и содержат один (или более) гетероатом, например 1, 2, 3 или 4 гетероатома, выбранных из кислорода, азота и серы, причем таковая конденсированная циклическая система является ароматической. Подходящие примеры полигетероарильных циклических систем включают хинолин, изохинолин, пиридопиразин, пирролопиридин, фуропиридин, индол, бензофуран, бензотиофуран, бензиндол, бензоксазол, пирролохинолин и им подобные. Если иное не оговорено специально, полигетероарильные заместители являются незамещенными или же замещенными по атомам углерода одним или более подходящими заместителями, включающими алкил, указанные выше алкильные заместители и заместитель формулы -O-(СН₂СН=СН(СН₃)(СН₂))_1-3Н. Атомы азота являются незамещенными или же замещенными, например, группой R₁₃. Наиболее полезные заместители по атому азота включают водород, (С₁-С₄)алкил, ацил, аминоацил и сульфонильную группу.

Неароматические полигетероциклические заместители включают бициклические и трициклические конденсированные системы циклов, в которых каждый из циклов может являться 4-9-членным, и содержат один или более гетероатом, например 1, 2, 3 или 4 гетероатома, выбранных из кислорода, азота и серы, а также содержат нуль, или одну, или более двойных или тройных С-С связей. Подходящие примеры неароматических полигетероциклов включают гекситол, цис-пергидроциклогепта[b]пиридинил, декагидробензо[f][1,4]оксазепинил, 2,8-диоксабицикло[3.3.0]октан, гексагидротиено[3,2-b]тиофен, пергидропирроло[3,2-b]пиррол, пергидронафтиридин, пергидро-1H-дициклопента[b,е]пиран. Если иное не оговорено специально, неароматические полигетероциклические заместители являются незамещенными или же замещенными по атомам углерода одним или более подходящими заместителями, включающими алкил и указанные выше алкильные заместители. Атомы азота являются незамещенными или же замещенными, например, группой R₁₃. Наиболее полезные заместители по атому азота включают водород, (С₁-С₄)алкил, ацил, аминоацил и сульфонильную группу.

Смешанные арильные и неарильные полигетероциклические заместители включают бициклические и трициклические конденсированные системы циклов, в которых каждый из циклов может являться 4-9-членным, и содержат один или более гетероатомов, например 1, 2, 3 или 4 гетероатома, выбранных из кислорода, азота и серы, причем хотя бы один из циклов должен являться ароматическим. Подходящие примеры смешанных арильных и неарильных полигетероциклов включают 2,3-дигидроиндол, 1,2,3,4-тетрагидрохинолин, 5,11-дигидро-10H-дибенз[b,е][1,4]диазепин, 5H-дибензо[b,е][1,4]диазепин, 1,2-дигидропирроло[3,4-6][1,5]бензодиазепин, 1,5-дигидропиридо[2,3-b][1,4]диазепин-4-он, 1,2,3,4,6,11-гексагидробензо[6]пиридо[2,3-е][1,4]диазепин-5-он. Если иное не оговорено специально, смешанные арильные и неарильные полигетероциклические заместители являются незамещенными или же замещенными по атомам углерода одним или более подходящими заместителями, включающими -N-OH,=N-OH, алкил и указанные выше алкильные заместители. Атомы азота являются незамещенными или же замещенными, например, группой R₁₃. Наиболее полезные заместители по атому азота включают водород, (С₁-С₄)алкил, ацил, аминоацил и сульфонильную группу.

Аминовые заместители включают первичные, вторичные и третичные амины, а также четвертичные амины в форме соли. Примеры аминовых заместителей включают моно- и диалкиламиногруппу, моно- и диариламиногруппу, моно- и диарилалкиламиногруппу, арил(арилалкил)аминогруппу, алкил(арил)аминогруппу, алкил(арилалкил)аминогруппу и им подобные.

Сульфонильные заместители включают алкилсульфонильную группу и арилсульфонильную группу, например метансульфогруппу, бензолсульфогруппу, тозил и им подобные.

Ацильные заместители включают группы формулы -C(O)-W, -OC(O)-W, -C(O)-O-W или -C(O)NR₁₃R₁₄, где W является R₁₆, водородом или циклоалкилалкилом.

Ациламиновые заместители включают заместители формулы -N(R₁₂)C(O)-W, -N(R₁₂)C(O)-O-W и -N(R₁₂)C(O)-NHOH, где R₁₂ и W отвечают вышеприведенным определениям.

Заместитель R₂ вида HON-С(O)-СН=С(R₁)-арилалкил- является группой формулы

Предпочтительные значения для каждого из заместителей включают нижеследующие:

R₁ является водородом, галоидом или неразветвленным (С₁-С₆)алкилом,

R₂ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, -(СН₂)_nC(O)R₆, аминоацила и -(CH₂)_nR_7,

R₃ и R₄ являются одинаковыми или различными заместителями, независимо выбранными из водорода и (С₁-С₆)алкила,

или

R₃ и R₄ совместно с атомом углерода, к которому они присоединены, представляют собой С=O, C=S или C=NR₈,

R₅ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, ароматической полициклической группы, неароматической полициклической группы, смешанной арильной и неарильной полициклической группы, полигетероарила, неароматического полигетероцикла и смешанного арильного и неарильного полигетероцикла,

n, n₁, n₂ и n₃ являются одинаковыми или различными числами, независимо выбранными из 0-6, причем в тех случаях, когда n₁ равняется 1-6, каждый атом углерода может быть независимо от прочих необязательно замещен R₃ и/или R₄,

Х и Y являются одинаковыми или различными заместителями, независимо выбранными из водорода, галоида, (С₁-С₄)алкила, CF₃, NO₂, C(O)R₁, OR₉, SR₉, CN и NR₁₀R₁₁,

R₆ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, алкилциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, OR₁₂ и NR₁₃R₁₄,

R₇ выбран из OR₁₅, SR₁₅, S(O)R₁₆, SO₂R₁₇, NR₁₃R₁₄ и NR₁₂SO₂R₆,

R₈ выбран из водорода, OR₁₅, NR₁₃R₁₄, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила и гетероарилалкила,

R₉ выбран из (С₁-С₄)алкила и С(O)-алкила,

R₁₀ и R₁₁ являются одинаковыми или различными заместителями, независимо выбранными из водорода, (С₁-С₄)алкила и -С(O)-алкила,

R₁₂ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила и гетероарилалкила,

R₁₃ и R₁₄ являются одинаковыми или различными заместителями, независимо выбранными из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила и аминоацила,

R₁₅ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила и (CH₂)_mZR₁₂,

R₁₆ выбран из (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила и (CH₂)_mZR₁₂,

R₁₇ выбран из (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, полигетероарила, арилалкила, гетероарилалкила и NR₁₃R₁₄,

m является целым числом, выбранным среди 0-6, и

Z выбран среди О, NR₁₃, S и S(O),

или фармацевтически приемлемую соль указанного.

Полезные соединения формулы (I) включают такие, в которых каждый из заместителей R₁, X, Y, R₃ и R₄ является водородом, включая такие, в которых одно из чисел n₂ и n₃ является 0, а другое является 1, в особенности же такие, в которых R₂ является водородом или -СН₂-СН₂-ОН.

Одним из подходящих видов гидроксаматных производных являются отвечающие формуле (Ia) О

в которых

n₄ является 0-3,

R₂ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, -(СН₂)_nC(O)R₆, аминоацила и -(CH₂)_nR₇, a

R₅′ является гетероарилом, гетероарилалкилом, например пиридилметилом, ароматическими полициклическими группами, неароматическими полициклическими группами, смешанными арильными и неарильными полициклическими группами, полигетероарилом и смешанными арильными и неарильными полигетероциклами, или их фармацевтически приемлемые соли.

Еще одним подходящим видом гидроксаматных производных являются отвечающие формуле (Ia)

в которых

n₄ является 0-3,

R₂ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, -(СН₂)_nC(O)R₆, аминоацила и -(CH₂)_nR₇,

R₅′ является арилом, арилалкилом, ароматическими полициклическими группами, неароматическими полициклическими группами и смешанными арильными и неарильными полициклическими группами, в особенности арилом, таким как n-фторфенил, n-хлорфенил, n-O-(С₁-С₄)алкилфенил, такой как n-метоксифенил, и n-(С₁-С₄)алкилфенил, и арилалкилом, таким как бензил, орто-, мета- или пара-фторбензил, орто-, мета- или пара-хлорбензил, орто-, мета- или пара-моно-, ди- или три-O-(C₁-С₄) алкилбензил, такой как орто-, мета- или пара-метоксибензил, м,n-диэтоксибензил, о,м,n-триметоксибензил, и орто, мета- или пара-моно-, ди- или три-(С₁-С₄)алкилфенил, такой как n-метил-м,м-диэтилфенил, или их фармацевтически приемлемые соли.

Еще одним интересным видом являются соединения формулы (Iб)

в которых

R₂ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₆) циклоалкила, циклоалкилалкила, например циклопропилметила и (CH₂)_2-4OR₂₁, где R₂₁ является водородом, метилом, этилом, припилом и изопропилом, а

R₅ является незамещенным 1H-индол-3-илом, бензофуран-3-илом или хинолин-3-илом или замещенным 1H-индол-3-илом, таким как 5-фтор-1H-индол-3-ил или 5-метокси-1H-индол-3-ил, бензофуран-3-илом или хинолин-3-илом,

или их фармацевтически приемлемые соли.

Еще одним интересным видом гидроксаматных производных являются соединения формулы (Iв)

в которых

цикл, содержащий Z₁, является ароматическим или неароматическим, причем таковые неароматические циклы являются насыщенными или ненасыщенными,

Z₁ является О, S или n-R₂₀,

R₁₈ является водородом, галоидом, (С₁-С₆)алкилом (метилом, этилом, трет-бутилом), (С₃-С₇) циклоалкилом, арилом, например незамещенным фенилом или фенилом, замещенным 4-ОСН₃ или 4-CF₃, или гетероарилом, таким как 2-фуранил, 2-тиофенил или 2-, 3- или 4-пиридил,

R₂₀ является водородом, (С₁-С₆)алкилом, (С₁-С₆)алкил-(С₃-С₉)циклоалкилом, например циклопропилметилом, арилом, гетероарилом, арилалкилом, например бензилом, гетероарилалкилом, например пиридилметилом, ацилом, например ацетилом, пропионилом и бензоилом, или сульфонильной группой, например метансульфогруппой, этансульфогруппой, бензолсульфогруппой и толуолсульфогруппой,

A₁ является 1, 2 или 3 заместителями, независимо друг от друга являющимися водородом, (С₁-С₆)алкилом, -OR₁₉, галоидом, алкиламиногруппой, аминоалкилом или гетероарилалкилом, например пиридилметилом,

R₁₉ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила, например бензила, гетероарилалкила, например пиридилметила, и -(СН₂СН=СН(СН₃)(СН₂))_1-3Н,

R₂ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, циклоалкилалкила, арила, гетероарила, арилалкила, гетероарилалкила, -(СН₂)_nC(O)Р₆, аминоацила и -(CH₂)_nR₇,

v является 0, 1 или 2,

р является 0-3 и

q является 1-5, а r является 0 или

q является 0, а r является 1-5,

или их фармацевтически приемлемые соли. Другие варьируемые заместители отвечают вышеприведенным определениям.

Особенно полезными соединениями формулы (Iв) являются такие, в которых R₂ является водородом или -(СН₂)_рСН₂ОН, где р является 1-3, в особенности же такие, в которых R₁ является водородом, такие как те, в которых R₁ является водородом и Х и Y оба являются водородом, в которых q является 1-3, а r является 0 или в которых q является 0, а r является 1-3, в особенности же такие, в которых Z₁ является N-R₂₀. Среди этих соединений R₂ предпочтительно является водородом или -СН₂-СН₂-ОН, а сумма q и r предпочтительно составляет 1.

Еще одним интересным видом гидроксаматных производных являются соединения формулы (Iг)

в которых

Z₁ является О, S или N-R₂₀,

R₁₈ является водородом, галоидом, (С₁-С₆)алкилом (метилом, этилом, трет-бутилом), (С₃-С₇) циклоалкилом, арилом, например незамещенным фенилом или фенилом, замещенным 4-ОСН₃ или 4-СР₃, или гетероарилом,

R₂₀ является водородом, (С₁-С₆)алкилом, (С₁-С₆)алкил-(С₃-С₉)циклоалкилом, например циклопропилметилом, арилом, гетероарилом, арилалкилом, например бензилом, гетероарилалкилом, например пиридилметилом, ацилом, например ацетилом, пропионилом и бензоилом, или сульфонильной группой, например метансульфогруппой, этансульфогруппой, бензолсульфогруппой и толуолсульфогруппой,

A₁ является 1, 2 или 3 заместителями, независимо друг от друга являющимися водородом, (С₁-С₆)алкилом, -OR₁₉ или галоидом,

R₁₉ выбран из водорода, (С₁-С₆)алкила, (С₄-С₉)циклоалкила, (С₄-С₉)гетероциклоалкила, арила, гетероарила, арилалкила, например бензила и гетероарилалкила, например пиридилметила,

р является 0-3 и

q является 1-5, а r является 0 или

q является 0, а r является 1-5,

или их фармацевтически приемлемые соли. Другие варьируемые заместители отвечают вышеприведенным определениям.

Особенно полезными соединениями формулы (Iг) являются такие, в которых R₂ является водородом или -(СН₂)_рСН₂ОН, где р является 1-3, в особенности же такие, в которых R₁ является водородом, такие как те, в которых R₁ является водородом и Х и Y оба являются водородом и в которых q является 1-3, а r является 0 или в которых q является 0, а r является 1-3. Среди этих соединений R₂ предпочтительно является водородом или -СН₂-СН₂-ОН, а сумма q и r предпочтительно составляет 1.

Объектом настоящего изобретения также являются соединения формулы (Iд)

или их фармацевтически приемлемые соли. Варьируемые заместители отвечают вышеприведенным определениям.

Особенно полезными соединениями формулы (Iд) являются такие, в которых R₁₈ является водородом, фтором, хлором, бромом, (С₁-С₄)алкильной группой, замещенной (С₁-С₄)алкильной группой, (С₃-С₇) циклоалкильной группой, незамещенным фенилом, фенилом, замещенным в пара-положение, или гетероарильным, например пиридильным, циклом.

Еще одной группой полезных соединений формулы (Iд) являются такие, в которых R₂ является водородом или -(CH₂)_рСН₂ОН, где р является 1-3, в особенности же такие, в которых R₁ является водородом, такие как те, в которых R₁ является водородом и Х и Y оба являются водородом, в которых q является 1-3, а r является 0 или в которых q является 0, а r является 1-3. Среди этих соединений R₂ предпочтительно является водородом или -CH₂-CH₂-OH, а сумма q и r предпочтительно составляет 1. Среди этих соединений р предпочтительно является 1, а R₃ и R₄ предпочтительно являются водородом.

Еще одной группой полезных соединений формулы (Iд) являются такие, в которых R₁₈ является водородом, метилом, этилом, трет-бутилом, трифторметилом, циклогексилом, фенилом, 4-метоксифенилом, 4-трифторметилфенилом, 2-фуранилом, 2-тиофенилом или 2-, 3- или 4-пиридилом, где 2-фуранильный, 2-тиофенильный и 2-, 3- или 4-пиридильный заместители являются незамещенными или же замещенными таким образом, как это описано выше для гетероарильных циклов, а R₂ является водородом или -(CH₂)_pCH₂OH, где р является 1-3, в особенности же такие, в которых R₁ является водородом, такие как те, в которых R₁ является водородом и Х и Y оба являются водородом и в которых q является 1-3, а r является 0 или в которых q является 0, а r является 1-3. Среди этих соединений R₂ предпочтительно является водородом или -СН₂-СН₂-ОН, а сумма q и r предпочтительно составляет 1.

Те соединения формулы (Iд), в которых R₂₀ является водородом или (С₁-С₆)алкилом, в особенности водородом, являются важными членами каждого из описанных выше подвидов соединений формулы (Iд).

N-гидрокси-3-[4-[[(2-гидроксиэтил) [2-(1H-индол-3-ил)этил]-амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамид, N-гидрокси-3-[4-[[[2-(1H-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид и N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1H-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид или их фармацевтически приемлемые соли являются важными соединениями формулы (Iд).

Объектом настоящего изобретения также являются соединения формулы (Ie)

или их фармацевтически приемлемые соли. Варьируемые заместители отвечают вышеприведенным определениям.

Полезные соединения формулы (Ie) включают такие, в которых R₂ является водородом или -(СН₂)_pCH₂OH, где р является 1-3, в особенности же такие, в которых R₁ является водородом, такие как те, в которых R₁ является водородом и Х и Y оба являются водородом и в которых q является 1-3, а r является 0 или в которых q является 0, а r является 1-3. Среди этих соединений R₂ предпочтительно является водородом или -СН₂-СН₂-ОН, а сумма q и r предпочтительно составляет 1.

N-гидрокси-3-[4-[[[2-(бензофур-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид или его фармацевтически приемлемая соль является важным соединением формулы (Ie).

Описанные выше соединения часто применяют в форме фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемые соли включают, в соответствующих случаях, фармацевически приемлемые соли с основаниями и кислотно-аддитивные соли, например, соли металлов, такие как соли щелочных и щелочноземельных металлов, соли аммония, соли с органическими аминами, а также соли с аминокислотами и соли сульфокислот. Кислотно-аддитивные соли включают кислотно-аддитивные соли неорганических кислот, такие как гидрохлорид, сульфат и фосфат, и кислотно-аддитивные соли органических кислот, такие как алкилсульфосоль, арилсульфосоль, ацетат, малеат, фумарат, тартрат, цитрат и лактат. Примерами солей металлов являются соли щелочных металлов, такие как соль лития, соль натрия и соль калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соль магния и соль кальция, соль алюминия и соль цинка. Примерами солей аммония являются соль аммония и соль тетраметиламмония. Примерами солей с органическими аминами являются соли с морфолином и пиперидином. Примерами солей с аминокислотами являются соли с глицином, фенилаланином, глутаминовой кислотой и лизином. Соли сульфоксилот включают мезилат, тозилат и соли бензолсульфокислоты.

Дополнительные соединения-ингибиторы HDAC, входящие в объем формулы (I), а также их синтез раскрываются в международной заявке на изобретение WO 02/22577, опубликованной 21 марта 2002 года, которая включена в настоящую заявку в качестве ссылки и составляет ее часть. Двумя предпочтительными соединениями, входящими в объем международной заявки на изобретение WO 02/22577, являются

N-гидрокси-3-[4-[(2-гидроксиэтил){2-(1H-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид или его фармацевтически приемлемая соль и

N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1H-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид или его фармацевтически приемлемые соли.

Объектом настоящего изобретения, в частности, является применение ингибиторов HDAC для приготовления лекарственного средства для лечения миеломы, резистентной к стандартной химиотерапии.

Ингибитор HDAC, как он применяется для настоящего изобретения, предпочтительно демонстрирует в вышеописанном анализе величину концентрации, обеспечивающей пятидесятипроцентное ингибирование (IC₅₀) между 50 и 2500 нМ, более предпочтительно - между 250 и 2000 нМ, наиболее же предпочтительно - между 500 и 1250 нМ.

Помимо этого, объектом настоящего изобретения является способ лечения миеломы, в особенности миеломы, резистентной к стандартной химиотерапии, включающий введение терапевтически эффективного количества ингибитора HDAC нуждающемуся в этом теплокровному животному, в частности человеку, предпочтительно введение терапевтически эффективного количества соединения формулы (I), как оно определено выше, или соли подобного соединения, содержащего хотя бы одну солеобразующую группу, нуждающемуся в этом теплокровному животному, в частности человеку.

Во всем настоящем описании и формуле изобретения под миеломой предпочтительно подразумевается множественная миелома (ММ).

Термин "лечение", как он употребляется в контексте, включает лечение страдающих миеломой или находящихся в начальной стадии данного заболевания пациентов, приводящее к задержке развития заболевания у таковых пациентов.

Бортезомиб является главным средством лечения ММ, вызывающим апоптоз клеток миеломы. Как было неожиданно обнаружено, ингибиторы HDAC по настоящему изобретению усиливают эффект бортезомиба в отношении клеток ММ.

Как следствие, объектом настоящего изобретения является также комбинация, включающая ингибитор HDAC, предпочтительно соединение формулы (I), как оно определено выше, и соединение, вызывающее апоптоз клеток миеломы, в каковой комбинации активные ингредиенты присутствуют в каждом случае в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, а также необязательно включающая хотя бы один фармацевтически приемлемый носитель для одновременного, раздельного или последовательного применения, в особенности, для применения в способе лечения миеломы. В подобной комбинации соединение, вызывающее апоптоз клеток миеломы, предпочтительно является бортезомибом.

Комбинация, включающая ингибитор HDAC, и соединение, вызывающее апоптоз клеток миеломы, в каковой комбинации активные ингредиенты присутствуют в каждом случае в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, а также необязательно включающая хотя бы один фармацевтически приемлемый носитель, будет именоваться здесь и далее комбинацией по настоящему изобретению.

Комбинация по настоящему изобретению может являться комбинированным препаратом или фармацевтической композицией.

Термин "комбинированный препарат", как он употребляется в контексте, главным образом определяет "набор составляющих" в том смысле, что активные ингредиенты, как они определены выше, могут дозироваться независимо или путем использования различных фиксированных комбинаций с различающимися количествами ингредиентов, т.е. одновременно или в различные моменты времени. Составляющие набора могут быть затем, например, введены одновременно или с разбросом по времени, т.е. в различные моменты времени, причем с одинаковыми или различными временными интервалами для любой из составляющих набора. Весьма предпочтителен выбор интервалов времени таким образом, чтобы воздействие на подвергаемое лечению заболевание при комбинированном применении составляющих было сильнее, чем то воздействие, которое было достигнуто при отдельном применении любого одного из активных ингредиентов. Соотношение общего количества активного ингредиента 1 и активного ингредиента 2, предназначенных к введению в виде комбинированного препарата, могло варьироваться с целью, например, соответствия нуждам подгруппы подвергаемых лечению пациентов или нуждам отдельного пациента, каковые различные нужды могут быть следствием пола, возраста и массы тела пациентов и т.п. Предпочтительно, имеет место хотя бы один благоприятный эффект, например взаимоусиление воздействия первого и второго активного ингредиента, в частности синергизм, например более чем аддитивный эффект, дополнительные благоприятные эффекты, сниженные побочные эффекты, комбинированный терапевтический эффект при неэффективной дозировке одного из первого и второго активных ингредиентов или их обоих, а также, в особенности, сильный синергизм первого и второго активных ингредиентов.

Кроме того, объектом настоящего изобретения является способ лечения миеломы, включающий введение комбинации по настоящему изобретению в совместно обладающем терапевтическим эффектом в отношении миеломы количестве нуждающемуся в том теплокровному животному.

Специалист в соответствующей области имеет все возможности для выбора адекватных моделей для испытаний, имеющих целью доказать выше- и нижеупомянутые благоприятные эффекты соединения, ингибирующего активность HDAC, или комбинации по настоящему изобретению в отношении миеломы. Фармакологическая активность соединения, ингибирующего активность HDAC, или комбинации по настоящему изобретению может быть, например, продемонстрирована в подходящем клиническом исследовании или посредством описанных ниже примеров. Подходящими клиническими исследованиями являются, например, открытые нерандомизированные исследования с наращиванием дозы у пациентов с прогрессирующей миеломой. Подобные исследования доказывают, в частности, синергизм, наблюдаемый для комбинаций по настоящему изобретению. Благоприятные эффекты в отношении миеломы могут быть непосредственно определены из результатов подобных исследований или с помощью изменений в организации исследований, которые известны как таковые специалисту в соответствующей области. Например, одна составляющая комбинации может вводиться в фиксированной дозе, а дозу второй составляющей комбинации наращивают до достижения максимальной переносимой дозы (МПД). Альтернативно, с целью доказательства полезности упоминаемой в контексте комбинации по настоящему изобретению может быть осуществлено исследование двойным слепым методом с контролем по плацебо.

Примеры

Ингибитор HDAC

N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1H-индол-3-ил1)этил]амино]аметил]фенил]-2Е-2-пропенамид, соединение (III) (Novartis Pharma, Basel, Switzerland), растворяют в деионизированной воде и хранят при температуре -20°С, после чего растапливают и разбавляют в среде для экспериментов с клеточными культурами. Для экспериментов на животных лекарство растворяют в стерильной воде, после чего осуществляют внутрибрюшную инъекцию.

Производные от ММ клеточные линии и клетки пациентов

Чувствительные к бортезомибу (MM. IS) и резистентные к бортезомибу (MM.1R) клеточные линии ММ человека, равно как и периферийные кровяные клетки миеломы человека RPMI-8226, резистентные к доксорубицину (Dox 40), митоксантрону (MR20) и мелфалану (LR5) культивируют в питательной среде RPMI-1640 (Cellgro, Mediatech, VA) с 10% околоплодной телячьей сыворотки, 2 ммоль/л L-глутамина (GIBCO, Grand Island, NY), 100 ед./мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина (GIBCO). Резистентные к лекарству клеточные линии культивируют с одним из препаратов из группы доксорубицина, митоксантрона, мелфалана и бортезомиба с целью подтверждения отсутствия чувствительности к лекарству. Клетки пациентов с ММ очищают (>95% CD138+) с помощью положительной селекции с микрогранулами с антителами CD 138 MACS (Miltenyi, SanDiego, CA). Образцы одноядерных клеток костного мозга (ВММС) и периферийных кровяных одноядерных клеток (РВМС) получают с помощью седиментации в градиенте плотности фиколл-гипак и инкубируют в 96-ячеечных планшетах в присутствии или в отсутствие соединения (III).

Культуры КСКМ

Образцы костного мозга получают от пациентов, страдающих ММ. Одноядерные клетки, выделенные с помощью седиментации в градиенте плотности фиколл-гипак, используют для получения долгоживущих культур костного мозга. После развития сросшегося с субстратом монослоя клеток клетки собирают в раствор Хэнкса (HBSS), содержащий 0,25% трипсина и 0,02% этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), промывают и собирают центрифугированием. После этого КСКМ помещают на ночь на 96-ячеечные планшеты с плоским дном, а затем добавляют 3×10⁴ клеток MM. 1S на 48 часов. Отделяют 150 мкл надосадочного раствора и встряхивают клетки с [3H]тимидином (0,5 мкКи на ячейку) в течение последних 8 часов 48-часовой культивации. Для измерения интерлейкина IL-6 в надосадочных растворах после 48-часовой культивации КСКМ в присутствии или в отсутствие клеток MM. 1S и в присутствии или в отсутствие соединения (III) используют систему Duoset ELISA (R&D System).

Синтез ДНК

Клетки ММ (3×10⁴ клеток на ячейку) инкубируют в 96-ячеечных планшетах для культур (Costar, Cambridge, MA) в присутствии среды, соединения (III), и/или бортезомиба или рекомбинантного IL-6 (Genetics Institute, Cambridge, MA) в течение 48 часов при температуре 37°С. Синтез ДНК отслеживают по поглощению 3H-тимидина (NEN Products, Boston, MA). Клетки встряхивают с [3H]тимидином (0,5 мкКи на ячейку) в течение последних 8 часов 48-часовой культивации. Все опыты осуществляют в трех параллельных сериях.

Анализ ингибирования роста

Ингибирующее воздействие соединения (III) на рост ММ и КСКМ анализируют посредством измерения поглощения в клетках бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2Н-тетразолия (MTS) (Promega, Madison, WI). Клетки, получаемые 24-, 48- или 72-часовой культивацией в 200 мкл среды в присутствии лекарства встряхивают с 40 мкл 5 мг/мл MTS в каждой ячейке в течение последних 4 часов культивации. Поглощение измеряют при длине волны 490 нм с помощью спектрофотометра (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA).

Анализ клеточного цикла

Клеточные линии ММ и клетки пациентов, страдающих ММ, культивируемые в течение 0, 8, 12, 18, 36 и 42 часов в соединении (III) (1 мкМ), соединении (III) совместно с ингибитором каспаз ZVAD-FMK (фторметилкетон карбобензокси-валил-аланил-аспарагиновой кислоты) (20 мкМ) (Calbiochem, San Diego, CA) или в контрольной среде, собирают, промывают забуференным фосфатом солевым раствором (PBS), фиксируют 70% этанолом и обрабатывают 10 мг/мл рибонуклеазы (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). После этого клетки окрашивают 5 мг/мл пропидий-иодида (Sigma) и определяют профиль клеточного цикла с помощью программы М на проточном цитометре Epics (Coulter Immunology, Hialeah, FL). Данные анализируют с помощью проточной системы Phoenix.

Детекция апоптоза

В дополнение к идентификации клеток, находящихся в фазах до G1 с помощью анализа клеточного цикла, как это описано выше, также подтверждают апоптоз с помощью окрашивания аннексином V. Клетки ММ культивируют или в чистых средах, или же в средах с добавкой 1 мкМ соединения (III) при температуре 37°С в течение 24 часов. После этого клетки дважды промывают ледяным PBS и заново суспендируют (1×10⁶ клеток/мл) в буферном растворе для связывания (10 ммоль/л 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислоты (HEPES), рН 7,4, 140 ммоль/л NaCl, 2,5 ммоль/л CaCl₂). Клетки MM (1×10⁵) инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре с аннексином V-FITC (изотиацианат флуоресцеина) (5 мкл, Pharmingen, San Diego, CA) и пропидий-иодидом (PI) (5 мг/мл). Число апоптотических клеток с аннексином V и PI определяют с помощью сортировщика клеток Epics (Coulter).

Иммуноблоттинг

Клетки MM пациента и клетки MM. IS культивируют с 0,01, 0,1 или 1 мкМ соединения (III), собирают, промывают и подвергают лизису с помощью буферного раствора для лизиса: буферный раствор RIPA (буфер для анализа радиоиммуноосаждения), 2 ммоль/л Na₃VO₄, 5 ммоль/л NaF, 1 ммоль/л фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 5 мг/мл лейпептина и 5 мг/мл апротинина. Клеточные лизаты переводят в SDS-ПААГ (додецилсульфат натрия-полиакриламидный гель), переносят на поливинилидендифторидную (PVDF) мембрану и подвергают иммуноблоттингу с антителом к ацетилированному гистону (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY), антителом анти-р21 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA), анти-PARP (антиполимераза поли-АДФ-рибозы), антикаспазой-8, антикаспазой-9 и антикаспазой-3 (Cell Signaling, MA), равно как и с антиполиубиквитиновыми конъюгатами, антителами анти-LMP7 (LMP-белок низкой молекулярной массы), анти-β5 (Affiniti, Mamhead, Exeter, Devon, UK). Мембраны отскабливают и тестируют заново антитубулином или анти-β-актином (Sigma, St Louis, МО), чтобы убедиться в эквивалентной емкости в отношении белка.

Анализ протеасомной активности

Протеасомную активность в цитозольных экстрактах измеряют с помощью флуоресцентного протеасомного субстрата Suc-LLVYAMC (Calbiochem, San Diego, CA). Вкратце, цитозольный экстракт (100 мкг белка в 5 мкл) инкубируют при комнатной температуре в течение 90 минут в 200 мкл реакционной среды, содержащей 20 мМ трис-HCl (рН 7,8), 0,5 мМ ЭДТК и 100 мкМ Suc-LLVY-AMC. Флуоресценцию измеряют с помощью флуориметра для планшетов для микротитрования (возбуждение при 360 нм, испускание при 460 нм).

EMSA

Получают ядерные экстракты для EMSAs. Двухнитевый NF -кВ консенсусный олигонуклеотидный зонд (5′-GGGGACTTTCCC-3′, Santa Cruz Biotechnology) помечают на конце [γ-32Р]АТФ (50 мкКи при 222 ТБк/мМ, NEN, Boston, MA). Реакции связывания в системе, содержащей 1 нг олигонуклеотида и 5 мкг ядерного белка, осуществляют при комнатной температуре в течение 20 минут в общем объеме буферного раствора для связывания 10 мл [10 мМ трис-HCl (рН 7,5), 50 мМ NaCl, 1 мМ MgCl₂, 0,5 мМ ЭДТК, 0,5 мМ дитиотреитола (DTT), 4% глицерина (об./об.) и 0,5 мг поли(dI.dC) (дезоксиинозин-дезоксицитозин) (Pharmacia, Peapack, NJ).

Модель на мышах с ксенотрансплантатом

Пяти-шестинедельных мышей породы Beige-Nude-Xid подкожно прививают в правый бок 3×10⁷ клеток ММ в 100 мкл среде RPMI 1640 вместе со 100 мкл основной мембранной матрицы Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA), как это было описано выше. Когда опухоли становятся измеримы, мышей определяют в группу, получающую соединение (III) в количестве 25 мг/кг в сутки внутрибрюшинно, или же в контрольную группу, получающую чистый носитель (0,9% хлорид натрия) по тому же расписанию. Лечение соединением (III) осуществляют в количестве 25 мг/кг. Кавернометрические измерения максимальных перпендикулярных диаметров опухоли осуществляют каждый второй день с целью оценки объема опухоли на основании следующей формулы:

4π/3 × (ширина/2)² × (длина/2),

описывающей трехмерный объем эллипса. Животных умерщвляют по достижении опухолью размера 2 см. Выживаемость измеряют от первого дня лечения до смерти. Рост опухоли измеряют с первого дня лечения до дня первого умерщвления (9 день).

Статистический анализ

Статистическую значимость различий, наблюдаемых между подвергнутыми обработке лекарством и контрольными культурами, определяют с помощью t-критерия Стьюдента. Минимальный уровень значимости составляет р<0,05. Анализ синергизма и антагонизма соединения (III) и дексаметазона осуществляют с помощью анализа средней эффективной дозы при посредстве коммерчески доступного программного обеспечения Calcusyn (Biosoft, Ferguson, МО, USA). Кривые выживаемости для мышей рассчитывают с помощью процедуры Каплана-Мейера. Различия во времени выживаемости между контрольной и подвергнутой лечению группами сравнивают с помощью логарифмического рангового критерия. Средние времена выживания сравнивают с помощью точного критерия Фишера. Для сравнения скорости роста опухоли в двух выборках используют аппроксимацию по модели линейного смешанного эффекта.

Примеры демонстрируют, что соединение (III) ингибирует рост клеток миеломы при средней ингибирующей концентрации менее 10 нМ для периода времени 48 часов как в клеточных линиях ММ, резистентных к стандартным видам терапии, так и в клетках пациентов с ММ, как это определяют с помощью анализа с красителем MTS и по поглощению меченого тритием тимидина. Пролиферация клеток миеломы MM. 1S также ингибируется при совместной культивации со стромальными клетками костного мозга, что демонстрирует способность к преодолению стимулирующего эффекта костномозгового микроокружения. Про-апоптотическое воздействие подтверждается вестерн-блоттингом. Существенное расщепление каспазы 8, каспазы 9, каспазы 3 и PARP наблюдают в присутствии 20 нМ соединения (III) в клетках MM. 1S, что указывает на участие как внутреннего, так и внешнего механизмов апоптоза при апоптозе, опосредованном соединением (III). Наблюдают также сопутствующую повышающую регуляцию гена р21 и понижающую регуляцию гена с-myc. Синергическую активность наблюдают в сочетании с протеасомным ингибитором бортезомибом. Стимулируемое соединением (III) ингибирование HDAC приводит к гиперацетилированию гистона при низких наномольных концентрациях. Ацетилирование α-тубулина является пост-трансляционной модификацией, которая состоит в присоединении ацетильной группы по лизину 40, которое может быть обращено HDAC6 или тубулиндеацетилазой (TDAC). Ацетилирование тубулина играет важную роль в дифференцировке структуры и функции микротрубочек. Более того, TDAC конститутивно связывает как полиубиквитинированные белки с неправильной конформацией, так и динеин, прикрепляя белки с неправильной конформацией к динеиновым моторам с целью их транспорта в агресомы вдоль микротрубочек, что является важным защитным механизмом против апоптоза в клетках ММ. Следует отметить, что зависимое от дозы ингибирование TDAC в клетках MM. 1S наблюдается при низких наномолярных концентрациях соединения (III).

Одной из целей настоящего изобретения является разработка фармацевтической композиции, включающей такое количество комбинации по настоящему изобретению, которое является в совокупности терапевтически эффективным в отношении миеломы. В данной композиции составляющие комбинации могут вводится совместно, один за другим или раздельно, в одной комбинированной стандартной дозировке или в двух отдельных стандартных дозировках. Стандартная дозировка также может являться фиксированной комбинацией.

Согласно настоящему изобретению фармацевтические композиции для раздельного введения составляющих комбинации и для введения в фиксированной комбинации, например единая галенова композиция, включающая хотя бы две составляющих комбинации, могут быть изготовлены с помощью способов, которые известны сами по себе. Это - композиции, являющиеся подходящими для энтерального, как-то перорального или перректального и парэнтерального введения млекопитающим (теплокровным животным), включая человека, и содержащие терапевтически эффективное количество хотя бы одной фармакологически активной составляющей комбинации, самой по себе или в комбинации с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, в особенности такими, которые пригодны для энтерального или парэнтерального применения.

Новая фармацевтическая композиция содержит, например, от, приблизительно, 10% до, приблизительно, 100%, предпочтительно, от, приблизительно, 20% до, приблизительно, 60% активных ингредиентов. Фармацевтические препараты для комбинированной терапии для энтерального или парэнтерального введения являются, например, препаратами в форме стандартной дозировки, например таблетками с сахарным покрытием, таблетками, капсулами или суппозиториями, а также ампулами. Если иное не оговорено специально, их изготавливают с помощью способов, которые известны сами по себе, например с помощью стандартных способов смешения, гранулирования, покрытия сахаром, растворения или лиофилизации. Следует понимать, что стандартное содержание составляющей комбинации, присутствующее в индивидуальной дозе каждой формы дозировки, не должно обязательно представлять собой эффективное количество, поскольку необходимое эффективное количество может быть достигнуто посредством введения многих единиц дозировки.

В частности, терапевтически эффективное количество каждой из составляющих комбинации по настоящему изобретению может быть введено одновременно или последовательно, причем в любом порядке, компоненты же могут быть введены раздельно или в фиксированной комбинации. Например, способ лечения миеломы согласно настоящему изобретению может включать:

(i) введение составляющей комбинации (а) в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли и

(ii) введение составляющей комбинации (б) в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, одновременно или последовательно, в произвольном порядке, в количествах, являющихся совместно терапевтически эффективными, предпочтительно, в синергически эффективных количествах, например в суточных дозировках, соответствующих описанным в контексте количествам.

Индивидуальные составляющие комбинации по настоящему изобретению могут быть введены раздельно, в разное время в ходе курса терапии или одновременно в формах единой или разделенной комбинации. Более того, термин «введение» также включает в свой объем применение пролекарства составляющей комбинации, которое преобразуется in vivo в составляющую комбинации как таковую. Следует, таким образом, понимать, что в объем настоящего изобретения входят все подобные режимы одновременного или чередующегося лечения, причем термин "введение" должен пониматься соответственно.

Эффективная дозировка соединений, применяемых для ингибирования активности HDAC и составляющих комбинации, вовлеченных в комбинацию по настоящему изобретению, может варьироваться в зависимости от конкретного применяемого соединения или фармацевтической композиции, режима введения, типа подвергаемой лечению миеломы и остроты подвергаемой лечению миеломы. Поэтому режим дозировки комбинации по настоящему изобретению выбирают в соответствии с множеством факторов, включающих путь введения и функцию почек и печени пациента. Врач, клиницист или ветеринар, обладающий стандартными знаниями в ответствующей области, сможет легко определить и прописать эффективное количество соединений, ингибирующих активность HDAC или отдельных активных ингредиентов комбинации по настоящему изобретению, необходимых для профилактики, противодействия или остановки развития состояния. Оптимальная точность в достижении концентрации активных ингредиентов в диапазоне, обеспечивающем эффективность в отсутствие токсичности, требует режима, основанного на кинетике доступности активных ингредиентов участкам-мишеням.

Помимо изложенного, объектом настоящего изобретения является коммерческая упаковка, содержащая в качестве активных ингредиентов комбинацию по настоящему изобретению совместно с инструкциями для одновременного, раздельного или последовательного применения таковой для лечения миеломы.

Объектом настоящего изобретения также является применение соединения формулы (I), как оно определено в контексте, и применение комбинации по настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения миеломы.

Предложено применение ингибитора гистондеацетилазы (HDAC) N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамида (формула (III)) для изготовления лекарственного средства для лечения миеломы и соответствующий способ лечения. Показано, что заявленное вещество проявляет активность в отношении клеточных линий миеломы в очень низком наномолекулярном диапазоне от 50 нМ в отличие от ранее известных ингибиторов HDAC. 2 н. и 5 з.п. ф-лы.

1. Применение ингибитора гистондеацетилазы (HDAC) для изготовления лекарственного средства для лечения миеломы, где ингибитор HDAC является N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамидом, отвечающим формуле (III)

или его фармацевтически приемлемой солью.

2. Применение по п.1, в котором миелома является резистентной к стандартным видам химиотерапии.

3. Применение по п.1 или 2, в котором теплокровное животное является человеком.

4. Применение по любому из пп.1-3, в котором заболевание является множественной миеломой.

5. Применение по п.1, в котором лекарственное средство представляет собой комбинацию, которая дополнительно содержит соединение, вызывающее апоптоз клеток миеломы, в которой активные ингредиенты в каждом случае присутствуют в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, а также необязательно включает по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель, для одновременного, раздельного или последовательного использования, где соединение, вызывающее апоптоз клеток миеломы, представляет собой бортезомиб.

6. Способ лечения миеломы, включающий введение терапевтически эффективного количества ингибитора HDAC нуждающемуся в этом пациенту, где ингибитор HDAC является N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамидом, отвечающим формуле (III)
,
или его фармацевтически приемлемой солью.

7. Способ по п.6, в котором миелома является множественной миеломой.