КОМБИНАЦИЯ ИНГИБИТОРОВ ГИСТОНДЕАЦЕТИЛАЗЫ И ИЗЛУЧЕНИЯ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/165 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к органическим соединениям, прежде всего к фармацевтическим композициям, предназначенным для применения в сочетании с ионизирующим излучением (ИИ) с целью замедления развития или лечения пролиферативного заболевания, прежде всего заболевания, связанного с плотной опухолью.

Краткое изложение сущности изобретения

При создании изобретения было установлено, что определенные ингибиторы гистондеацетилазы, т.е. ингибиторы HDAC, обладают эффективностью при их применении в сочетании с ионизирующим излучением для замедления развития или лечения пролиферативного заболевания, прежде всего заболевания, связанного с плотной опухолью.

Подробное описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг.1 - средняя величина доли выживших клеток и стандартная ошибка для каждого варианта обработки с применением LBH589 и дозы излучения 0-6 Гр, полученные при клоногенном анализе с использованием линий клеток Н460;

на фиг.2 - результаты анализа методом проточной цитометрии с использованием Annexin V-ФИТЦ/РI апоптозного действия, обусловленного ингибированием HDAC с помощью LBH589;

на фиг.3 - средний процент количества пикнотических ядер и стандартная ошибка, установленные с помощью DAPI-окрашивания с целью подтверждения способности LBH589 сенсибилизировать линии клеток рака легкого человека;

на фиг.4 - иммуноблоты расщепленной каспазы-3 и актина, полученные методом Вестерн-блоттинга. Индуцированное LBH589 расщепление каспазы-3 подтверждает его роль в апоптозе клеток, обработанных LBH589 и излучением;

на фиг.5 - кратность увеличения объема опухоли (А) и замедление развития роста опухоли (Б) для каждой группы, обработанной LBH589;

на фиг.6А - репрезентативные фотографии линии клеток Н23, обработанной комбинациями LBH589 и ИИ;

на фиг.6Б - количество очагов γ-Н2АХ, присутствующих через 24 ч после обработки ИИ;

на фиг.7 - репрезентативные фотографии линии клеток Н460, которые зондировали с помощью антител к HDAC4 и вторичных меченных с помощью родамина антител и затем подвергали контрастному окрашиванию с помощью DAPI (дигидрохлорид 4',6-диамидино-2-фенилиндола).

Подробное описание изобретения

Таким образом, в изобретении предложен способ замедления развития или лечения пролиферативного заболевания, прежде всего заболевания, связанного с плотной опухолью, у индивидуума, нуждающегося в таком лечении, заключающийся в том, что индивидууму вводят в эффективном количестве ингибитор HDAC формулы (I):

в которой R₁ обозначает H; галоген; или C₁-С₆алкил с прямой цепью, прежде всего метил, этил или н-пропил, где метальные, этильные и н-пропильные заместители являются незамещенными или замещены одним или несколькими заместителями, описанными ниже для алкильных заместителей;

R₂ выбран из группы, включающей Н; С₁-С₁₀алкил, предпочтительно С₁-С₆алкил, например метил, этил или -СН₂СН₂-ОН; С₄-С₉циклоалкил; С4-С₉гетероциклоалкил; С₄-С₉ гетероциклоалкилалкил; циклоалкилалкил, например циклопропилметил; арил; гетероарил; арилалкил, например бензил; гетероарилалкил, например пиридилметил; -(CH₂)_nC(O)R₆; -(CH₂)_nOC(O)R₆; аминоацил; НОN-С(O)-СН=С(R₁)-арилалкил-; и

-(CH₂)_nR₇;

R₃ и R₄ имеют одинаковые или различные значения и обозначают независимо друг от друга Н; C₁-С₆алкил; ацил; или ациламиногруппу, или

R₃ и R₄ вместе с атомом углерода, с которым они связаны, обозначают С=O, C=S или C=NR₈; или

R₂ вместе с атомом азота, с которым он связан, и R₃ вместе с атомом углерода, с которым он связан, могут образовывать С₄-С₉гетероциклоалкил; гетероарил; полигетероарил; неароматические полигетероциклы; или смешанное арильное и неарильное полигетероциклическое кольцо;

R₅ выбран из группы, включающей Н; C₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; С₄-С₉гетероциклоалкил; ацил; арил; гетероарил; арилалкил, например бензил; гетероарилалкил, например пиридилметил; ароматические полициклы; неароматические полициклы; смешанные арильные и неарильные полициклы; полигетероарил; неароматические полигетероциклы; и смешанные арильные и неарильные полигетероциклы;

n, n₁, n₂ и n₃ имеют одинаковые или различные значения и независимо друг от друга выбраны из чисел от 0 до -6, где n₁ обозначает число от 1 до 6, каждый атом углерода может быть необязательно и независимо замещен R₃ и/или R₄;

X и Y имеют одинаковые или различные значения и независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н; галоген; C₁-C₄алкил, такой как CH₃

и CF₃; NO₂; C(O)R₁; OR₉; SR₉; CN; и NR₁₀R₁₁;

R₆ выбран из группы, включающей Н; C₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; С₄-С₉гетероциклоалкил; циклоалкилалкил, например циклопропилметил;

арил; гетероарил; арилалкил, например бензил и 2-фенилэтенил;

гетероарилалкил, например пиридилметил; OR₁₂; и NR₁₃R₁₄;

R₇ выбран из группы, включающей OR₁₅; SR₁₅; S(O)R₁₆; SO₂R₁₇; NR₁₃R₁₄; и NR₁₂SO₂R₆;

R₈ выбран из группы, включающей Н; OR₁₅; NR₁₃R₁₄; С₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; С₄-С₉гетероциклоалкил; арил; гетероарил; арилалкил, например, бензил; и гетероарилалкил, например пиридилметил;

R₉ выбран из группы, включающей С₁-С₄алкил, например СН₃ и CF₃; С(О)-алкил, например С(O)СН₃; и С(O)СF₃;

R₁₀ и R₁₁ имеют одинаковые или различные значения и независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н; С_1-С₆алкил; и -С(O)-алкил;

R₁₂ выбран из группы, включающей Н; C₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; С₄-С₉гетероциклоалкил; С₄-С₉ гетероциклоалкилалкил; арил; смешанный арильный и неарильный полицикл; гетероарил; арилалкил, например бензил; и гетероарилалкил, например пиридилметил;

R₁₃ и R₁₄ имеют одинаковые или различные значения и независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н; C₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; С₄-С₉гетероциклоалкил; арил; гетероарил; арилалкил, например бензил; гетероарилалкил, например пиридилметил; аминоацил, или

R₁₃ и R₁₄, вместе с атомом азота, с которым они связаны, обозначают

С₄-С₉гетероциклоалкил; гетероарил; полигетероарил; неароматический полигетероцикл; или смешанный арильный и неарильный полигетероцикл;

R₁₅ выбран из группы, включающей Н; С₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; С₄-С₉гетероциклоалкил; арил; гетероарил; арилалкил; гетероарилалкил; и (CH₂)_mZR₁₂;

R₁₆ выбран из группы, включающей С₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; С₄-С₉гетероциклоалкил; арил; гетероарил; полигетероарил; арилалкил; гетероарилалкил; и (CH₂)_mZR₁₂;

R₁₇ выбран из группы, включающей C₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; С₄-С₉гетероциклоалкил; арил; ароматические полициклы; гетероарил; арилалкил; гетероарилалкил; полигетероарил и NR₁₃R₁₄;

m обозначает целое число, выбранное из 0-6; и

Z выбран из группы, включающей О; NR₁₃; S; и S(O),

или его фармацевтически приемлемую соль.

В соответствии с конкретным случаем понятие «незамещенный» означает, что заместители отсутствуют или что заместителями являются только атомы водорода.

Галогеновые заместители выбирают из группы, включающей фтор, хлор, бром и йод, предпочтительно они представляют собой фтор или хлор.

К алкильным заместителям относятся C₁-С₆алкил с прямой и разветвленной цепью, если не указано иное. Примерами пригодных C₁-С₆алкильных заместителей с прямой и разветвленной цепью являются метил, этил, н-пропил, 2-пропил, н-бутил, втор-бутил, трет-бутил и т.п. Если не указано иное, к алкильным заместителям относятся как ненасыщенные алкильные группы, так и алкильные группы, имеющие один или несколько пригодных заместителей, включая ненасыщенные группы, т.е. имеющие одну или несколько двойных или тройных С-С-связей; ацил; циклоалкил; галоген; оксиалкил; алкиламиногруппа; аминоалкил; ациламиногруппа; и OR₁₅, например алкоксигруппа. Предпочтительными заместителями для алкильных групп являются галоген, гидроксигруппа, алкоксигруппа, оксиалкил, алкиламиногруппа и аминоалкил.

К циклоалкильным заместителям относятся С₃-С₉циклоалкильные группы, такие как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п., если не указано иное. Если не указано иное, к циклоалкильным заместителям относятся как незамещенные циклоалкильные группы, так и циклоалкильные группы, имеющие один или несколько пригодных заместителей, включая С₁-С₆алкил, галоген, гидроксигруппу, аминоалкил, оксиалкил, алкиламиногруппу и OR₁₅, такую как алкоксигруппа. Предпочтительными заместителями для циклоалкильных групп являются галоген, гидроксигруппа, алкоксигруппа, оксиалкил, алкиламиногруппа и аминоалкил.

Приведенное выше описание алкильных и циклоалкильных заместителей применимо также к алкильным фрагментам других заместителей, таких как (но не ограничиваясь только ими) заместители, представляющие собой алкоксигруппу, алкиламины, алкилкетоны, арилалкил, гетероарилалкил, алкилсульфонил и сложный алкиловый эфир и т.п.

К гетероциклоалкильным заместителям относятся 3-9-членные алифатические кольца, такие как 4-7-членные алифатические кольца, содержащие 1-3 гетероатома, выбранных из азота, серы и кислорода. Примерами пригодных гетероциклоалкильных заместителей являются пирролидил, тетрагидрофурил, тетрагидротиофуранил, пиперидил, пиперазил, тетрагидропиранил, морфилиногруппа, 1,3-диазапан, 1,4-диазапан, 1,4-оксазепан и 1,4-оксатиапан. Если не указано иное, кольца являются незамещенными или они замещены на атомах углерода одним или несколькими пригодными заместителями, включая С₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; арил; гетероарил; арилалкил, например бензил; гетероарилалкил, например пиридилметил; галоген; аминогруппу; алкиламиногруппу и OR₁₅, например алкоксигруппу. Если не указано иное, гетероатомы, представляющие собой атомы азота, являются незамещенными или они замещены Н, С₁-С₄алкилом; арилалкилом, например бензилом; гетероарилалкилом, например пиридилметилом; ацилом; аминоацилом; алкилсульфонилом и арилсульфонилом.

К циклоалкилалкильным заместителям относятся соединения формулы -(СН₂)_n5-циклоалкил, в которой n5 обозначает число от 1 до 6. Пригодными алкилциклоалкильными заместителями являются циклопентилметил, циклопентилэтил, циклогексилметил и т.п. Указанные заместители являются незамещенными или могут быть замещены в алкильном фрагменте или циклоалкильном фрагменте соответствующим заместителем из числа заместителей, перечисленных выше для алкила и циклоалкила.

К арильным заместителям относятся незамещенный фенил и фенил, замещенный одним или несколькими пригодными заместителями, включая C₁-С₆алкил; циклоалкилалкил, например циклопропилметил; O(СО)алкил; оксиалкил; галоген; нитрогруппу; аминогруппу; алкиламиногруппу; аминоалкил; алкилкетоны; нитрил; карбоксиалкил; алкилсульфонил; аминосульфонил; арилсульфонил и группу OR₁₅, такую как алкоксигруппа. Предпочтительными заместителями являются C₁-С₆алкил; циклоалкил, например циклопропилметил; алкоксигруппа; оксиалкил; галоген; нитрогруппа; аминогруппа; алкиламиногруппа; аминоалкил; алкилкетоны; нитрил; карбоксиалкил; алкилсульфонил; арилсульфонил и аминосульфонил. Примерами пригодных арильных групп являются С₁-С₄алкилфенил, С₁-С₄алкоксифенил, трифторметилфенил, метоксифенил, гидроксиэтилфенил, диметиламинофенил, аминопропилфенил, карбэтоксифенил, метансульфонилфенил и толилсульфонилфенил.

К ароматическим полициклам относятся нафтил и нафтил, замещенный одним или несколькими пригодными заместителями, включая C₁-С₆алкил; алкилциклоалкил, например циклопропилметил; оксиалкил; галоген; нитрогруппу; аминогруппу; алкиламиногруппу; аминоалкил; алкилкетоны; нитрил; карбоксиалкил; алкилсульфонил; арилсульфонил; аминосульфонил и группу OR₁₅, такую как алкоксигруппа.

К гетероарильным заместителям относятся соединения, имеющие 5-7-членное ароматическое кольцо, которое содержит один или несколько гетероатомов, например от 1 до 4 гетероатомов, выбранных из N, О и S. Типичными гетероарильными заместителями являются фурил, тиенил, пиррол, пиразол, триазол, тиазол, оксазол, пиридин, пиримидин, изоксазолил, пиразин и т.п. Если не указано иное, гетероарильные заместители являются незамещенными или могут быть замещены на атоме углерода одним или несколькими пригодными заместителями, включая алкил, указанные выше алкильные заместители и другие гетероарильные заместители. Атомы азота являются незамещенными или могут быть замещены, например, группой R₁₃; наиболее предпочтительными заместителями атома азота являются Н, C₁-С₄алкил, ацил, аминоацил и сульфонил.

К арилалкильным заместителям относятся группы формул -(СН₂)_n5-арил, -(СН₂)_n5-1-(СН-арил)-(СН₂)_n5-арил или -(СН₂)_n5-1СН(арил)(арил), в которых арил и n5 имеют указанные выше значения. Такими арилалкильными заместителями являются бензил, 2-фенилэтил, 1-фенилэтил, толил-3-пропил, 2-фенилпропил, дифенилметил, 2-дифенилэтил, 5,5-диметил-3-фенилпентил и т.п.

Арилалкильные заместители являются незамещенными или могут быть замещены в алкильном фрагменте или арильном фрагменте или в обоих фрагментах, как указано выше для алкильных и арильных заместителей.

К гетероарилалкильным заместителям относятся группы формулы -(СН₂)_n5-гетероарил, в которой гетероарил и n5 имеют указанные выше значения и мостиковая группа связана с атомом углерода или азота гетероарильного фрагмента, такого как 2-, 3- или 4-пиридилметил, имидазолилметил, хинолилэтил и пирролилбутил. Гетероарильные заместители являются незамещенными или могут быть замещены, как указано выше для гетероарильных и алкильных заместителей.

К аминоацильным заместителям относятся группы формулы -С(O)-(СН₂)_n-C(H)(NR₁₃R₁₄)-(CH₂)_n-R₅, в которой n, R₁₃, R₁₄ и R₅ имеют указанные выше значения. Пригодными аминоацильными заместителями являются встречающиеся в естественных условиях и не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты, такие как глицинил, D-триптофанил, L-лизинил, D- или L-гомосеринил, 4-аминомасляный ацил и ± -3-амин-4-гексеноил.

К неароматическим полициклическим заместителям относятся бициклические и трициклические слитые кольцевые системы, в которых каждое кольцо может иметь от 4 до 9 членов и каждое кольцо не содержит ни одной или может содержать одну или несколько двойных и/или тройных связей. Примерами пригодных неароматических полициклов являются декаин, октагидроинден, пергидробензоциклогептен и пергидробензо-[f]-азулен. Указанные заместители являются незамещенными или могут быть замещены, как описано выше для циклоалкильных групп.

К смешанным арильным и неарильным полициклическим заместителям относятся бициклические и трициклические слитые кольцевые системы, в которых каждое кольцо может иметь от 4 до 9 членов и по меньшей мере одно кольцо является ароматическим. Примерами пригодных смешанных арильных и неарильных полициклов являются метилендиоксифенил, бисметилендиоксифенил, 1,2,3,4-тетрагидронафталин, дибензосуберан, дигидроантрацен и 9H-флуорен. Указанные заместители являются незамещенными или могут быть замещены нитрогрупой или как указано выше для циклоалкильных групп.

К полигетероарильным заместителям относятся бициклические и трициклические слитые кольцевые системы, в которых каждое кольцо независимо может быть 5- или 6-членным и содержит один или несколько гетероатомов, например 1, 2, 3 или 4 гетероатомов, выбранных из О, N или S, так что слитая кольцевая система является ароматической. Примерами пригодных полигетероарильных кольцевых систем являются хинолин, изохинолин, пиридопиразин, пирролопиридин, фуропиридин, индол, бензофуран, бензотиофуран, бензиндол, бензоксазол, пирролохинолин и т.п. Если не указано иное, полигетероарильные заместители являются незамещенными или могут быть замещены на атоме углерода одним или несколькими пригодными заместителями, включая алкил, указанные выше алкильные заместители и заместитель формулы -O-(СН₂СН=СН(СН₃)(СН₂))_1-3Н. Атомы азота являются незамещенными или могут быть замещены, например, группой R₁₃, наиболее предпочтительными заместителями атома азота являются Н, С₁-С₄алкил, ацил, аминоацил и сульфонил.

К неароматическим полигетероциклическим заместителям относятся бициклические и трициклические слитые кольцевые системы, в которых каждое кольцо может иметь от 4 до 9 членов и содержит один или несколько гетероатомов, например 1, 2, 3 или 4 гетероатомов, выбранных из О, N или S, и не содержит ни одной или может содержать одну или несколько двойных и/или тройных С-С-связей. Примерами пригодных неароматических полигетероциклов являются гекситол, цис-пергидроциклогепта[b]пиридинил, декагидробензо [f][1,4]оксазепинил, 2,8-диоксабицикло[3.3.0]октан, гексагидротиено[3,2-b]тиофен, пергидропирроло[3,2-b]пиррол, пергидронафтиридин, пергидро-1H-дициклопента[b,е]пиран. Если не указано иное, неароматические полигетероциклические заместители являются незамещенными или могут быть замещены на атоме углерода одним или несколькими заместителями, включая алкил и указанные выше алкильные заместители. Атомы азота являются незамещенными или могут быть замещены, например, группой R₁₃, наиболее предпочтительными заместителями на атоме азота являются Н, С₁-С₄алкил, ацил, аминоацил и сульфонил.

К смешанным арильным и неарильным полигетероциклическим заместителям относятся бициклические и трициклические слитые кольцевые системы, в которых каждое кольцо может иметь от 4 до 9 членов и содержит один или несколько гетероатомов, выбранных из О, N или S, и при этом по меньшей мере одно из колец должно быть ароматическим. Примерами пригодных смешанных арильных и неарильных полигетероциклов являются 2,3-дигидроиндол, 1,2,3,4-тетрагидрохинолин, 5,11-дигидро-10H-дибенз[b,е][1,4]диазепин, 5H-дибензо[b,е][1,4]диазепин, 1,2-дигидропирроло[3,4-b][1,5]бензодиазепин, 1,5-дигидропиридо[2,3-b][1,4]диазепин-4-он, 1,2,3,4,6,11-гексагидробензо[b]пиридо[2,3-е][1,4]диазепин-5-он. Если не указано иное, смешанные арильные и неарильные полигетероциклические заместители являются незамещенными или могут быть замещены на атоме углерода одним или несколькими пригодными заместителями, включая -N-OH, =N-OH, алкил и указанные выше алкильные заместители. Атомы азота являются незамещенными или могут быть замещены, например, группой R₁₃; наиболее предпочтительными заместителями на атоме азота являются Н, С₁-С₄алкил, ацил, аминоацил и сульфонил.

К аминозаместителям относятся первичные, вторичные и третичные амины и их соли, четвертичные амины. Примерами аминозаместителей являются моно- и диалкиламиногруппа, моно- и диариламиногруппа, моно- и диарилалкиламиногруппа, ариларилалкиламиногруппа, алкилариламиногруппа, алкиларилалкиламиногруппа и т.п.

К сульфонильным заместителям относятся алкилсульфонил и арилсульфонил, например метансульфонил, бензолсульфонил, тозил и т.п.

К ацильным заместителям относятся группы формул -C(O)-W, -OC(O)-W, -C(O)-O-W или -C(O)NR₁₃R₁₄, в которых W обозначает R₁₆, Н или циклоалкилалкил.

К ациламинозаместителям относятся заместители формул -N(R₁₂)C(O)-W, -N(R₁₂)C(O)-O-W и -N(R₁₂)C(O)-NHOH, в которых R₁₂ и W имеют указанные выше значения.

Когда заместителем R₂ является НОN-С(О)-СН=С(R₁)-арилалкил-, то он представляет собой группу формулы

Для каждого из заместителей предпочтительными являются следующие значения:

R₁ обозначает Н, галоген или С₁-С₄алкил с прямой цепью;

R₂ выбран из группы, включающей Н, C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, арил, гетероарил, арилалкил, гетероарилалкил, -(CH₂)_nC(O)R₆, аминоацил и -(СН₂)_nR₇;

R₃ и R₄ имеют одинаковые или различные значения и независимо друг от друга выбраны из Н и C₁-С₆алкила, или

R₃ и R₄, вместе с атомом углерода, с которым они связаны, обозначают С=O, C=S или C=NR₈;

R₅ выбран из группы, включающей Н, C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, арил, гетероарил, арилалкил, гетероарилалкил, ароматический полицикл, неароматический полицикл, смешанный арильный и неарильный полицикл, полигетероарил, неароматический полигетероцикл и смешанный арильный и неарильный полигетероцикл;

n, n₁ n₂ и n₃ имеют одинаковые или различные значения и независимо друг от друга выбраны из чисел от 0 до 6, где n₁ обозначает число от 1 до -6, каждый атом углерода является незамещенным или может быть независимо замещен R₃ и/или R₄;

X и Y имеют одинаковые или различные значения и независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, галоген, С₁-С₄алкил, CF₃, NO₂, C(O)R₁ OR₉, SR₉, CN и NR₁₀R₁₁;

R₆ выбран из группы, включающей Н, C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, алкилциклоалкил, арил, гетероарил, арилалкил, гетероарилалкил, OR₁₂ и NR₁₃R₁₄;

R₇ выбран из группы, включающей OR₁₅, SR₁₅, S(O)R₁₆, SO₂R₁₇, NR₁₃R₁₄ и NR₁₂SO₂R₆;

R₈ выбран из группы, включающей Н, OR₁₅, NR₁₃R₁₄, C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, арил, гетероарил, арилалкил и гетероарилалкил;

R₉ выбран из группы, включающей С₁-С₄алкил и С(O)-алкил;

R₁₀ и R₁₁ имеют одинаковые или различные значения и независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, С₁-С₄алкил и -С(O)-алкил;

R₁₂ выбран из группы, включающей Н, C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, арил, гетероарил, арилалкил и гетероарилалкил;

R₁₃ и R₁₄ имеют одинаковые или различные значения и независимо друг от друга выбраны из группы, включающей Н, C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, арил, гетероарил, арилалкил, гетероарилалкил и аминоацил;

R₁₅ выбран из группы, включающей Н, C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, арил, гетероарил, арилалкил, гетероарилалкил и (CH₂)_mZR₁₂;

R₁₆ выбран из группы, включающей C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, арил, гетероарил, арилалкил, гетероарилалкил и (CH₂)_mZR₁₂;

R₁₇ выбран из группы, включающей C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, арил, гетероарил, арилалкил, гетероарилалкил и NR₁₃R₁₄;

m обозначает целое число, выбранное из 0-6; и

Z выбран из группы, включающей О, NR₁₃, S и S(O);

или его фармацевтически приемлемая соль.

К предпочтительным соединениям формулы (I) относятся соединения, в которых R₁, X, Y, R₃ и R₄ каждый обозначает Н, включая те соединения, в которых один из символов n₂ и n₃ обозначает 0 и другой обозначает 1, прежде всего соединения, в которых R₂ обозначает Н или -СН₂-СН₂-ОН.

Одним из пригодных классов гидроксаматных производных являются соединения формулы (Iа):

в которой

n₄ обозначает число от 0 до 3;

R₂ выбран из группы, включающей Н, C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, арил, гетероарил, арилалкил, гетероарилалкил, -(CH₂)_nC(O)R₆, аминоацил и -(CH₂)_nR₇; и

обозначает гетероарил; гетероарилалкил, например пиридилметил; ароматические полициклы; неароматические полициклы; смешанные арильные и неарильные полициклы; полигетероарил или смешанный арил; и неарильные полигетероциклы; или их фармацевтически приемлемые соли.

Другим пригодным классом гидроксаматных соединений являются соединения формулы (Iа):

в которой

n₄ обозначает число от 0 до 3;

R₂ выбран из группы, включающей Н, C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, арил, гетероарил, арилалкил, гетероарилалкил, -(CH₂)_nC(O)R₆, аминоацил и -(CH₂)_nR₇;

обозначает арил; арилалкил; ароматические полициклы; неароматические полициклы и смешанный арил; и неароматические полициклы, прежде всего арил, такой как пара-фторфенил, пара-хлорфенил, пара-O-С₁-С₄алкилфенил, такой как пара-метоксифенил, и пара-С₁-С₄алкилфенил; и арилалкил, такой как бензил, орто-, мета- или пара-фторбензил, орто-, мета- или пара-хлорбензил, орто-, мета- или пара-моно-, ди- или три- O-С₁-С₄алкилбензил, такой как орто-, мета- или пара-метоксибензил, м,п-диэтоксибензил, о,м,п-триметоксибензил и орто-, мета- или пара-моно-, ди- или три-С₁-С₄алкилфенил, такой как пара-метил, м,м-диэтилфенил; или их фармацевтически приемлемые соли.

Следующим представляющим интерес классом являются соединения формулы (Ib):

в которой

выбран из группы, включающей Н; C₁-С₆алкил; С₄-С₆циклоалкил;

циклоалкилалкил, например циклопропилметил; (CH₂)_2-4OR₂₁, где R₂₁ обозначает Н, метил, этил, пропил и изо-пропил; и

обозначает незамещенный 1H-индол-3-ил, бензофуран-3-ил или хинолин-3-ил, или замещенный 1H-индол-3-ил, такой как 5-фтор-1H-индол-3-ил или 5-метокси-1H-индол-3-ил, бензофуран-3-ил или хинолин-3-ил; или их фармацевтически приемлемые соли.

Следующим представляющим интерес классом гидроксаматных производных являются соединения формулы (Iс):

в которой

кольцо, содержащее Z₁, является ароматическим или неароматическим, причем неароматические кольца являются насыщенными или ненасыщенными,

Z₁ обозначает О, S или N-R₂₀;

R₁₈ обозначает H; галоген; C₁-С₆алкил (метил, этил, трет-бутил); С₃-С₇циклоалкил; арил, например незамещенный фенил или фенил, замещенный 4-ОСН₃ или 4-CF₃; или гетероарил, такой как 2-фуранил, 2-тиофенил или 2-, 3- или 4-пиридил;

R₂₀ обозначает Н; C₁-С₆алкил; С₁-С₆алкил-С₃-С₉циклоалкил, например циклопропилметил; арил; гетероарил; арилалкил, например бензил; гетероарилалкил, например пиридилметил; ацил, например ацетил, пропионил и бензоил; или сульфонил, например метансульфонил, этансульфонил, бензолсульфонил и

толуолсульфонил;

А₁ обозначает 1, 2 или 3 заместителя, которые независимо друг от друга обозначают Н; C₁-С₆алкил; -OR₁₉; галоген; алкиламиногруппу; аминоалкил; или гетероарилалкил, например пиридилметил;

R₁₉ выбран из группы, включающей Н; C₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; С₄-С₉ гетероциклоалкил; арил; гетероарил; арилалкил, например бензил; гетероарилалкил, например пиридилметил и -(СН₂СН=СН(СН₃)(СН₂))_1-3Н;

R₂ выбран из группы, включающей Н, C₁-С₆алкил, С₄-С₉циклоалкил, С₄-С₉гетероциклоалкил, циклоалкилалкил, арил, гетероарил, арилалкил, гетероарилалкил, -(CH₂)_nC(O)R₆, аминоацил и -(CH₂)_nR₇;

v обозначает 0, 1 или 2;

р обозначает 0-3; и

q обозначает 1-5 и r обозначает 0, или

q обозначает 0 и r обозначает 1-5;

или их фармацевтические соли. Другие вариабельные заместители имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительными соединениями формулы (Iс) являются соединения, в которых R₂ обозначает Н, или -(СН₂)_pСН₂ОН, где р обозначает число от 1 до 3, прежде всего соединения, в которых R₁ обозначает Н; такие как соединения, в которых R₁ обозначает Н и X и Y каждый обозначают Н, и где q обозначает число от 1 до 3 и r обозначает 0 или где q обозначает 0 и r обозначает число от 1 до 3, прежде всего соединения, в которых Z₁ обозначает N-R₂₀. В этих соединениях R₂ предпочтительно обозначает Н или -СН₂-СН₂-ОН и сумма q и r предпочтительно равна 1.

Еще одним представляющим интерес классом гидроксаматных производных являются соединения формулы (Id):

в которой

Z₁ обозначает О, S или N-R₂₀;

R₁₈ обозначает Н; галоген; C₁-С₆алкил (метил, этил, трет-бутил); С₃-С₇циклоалкил; арил, например незамещенный фенил или фенил, замещенный 4-ОСН₃ или 4-CF₃; или гетероарил;

R₂₀ обозначает Н; C₁-С₆алкил, С₁-С₆алкил-С₃-С₉циклоалкил, например циклопропилметил; арил; гетероарил; арилалкил, например бензил; гетероарилалкил, например пиридилметил; ацил, например ацетил, пропионил и бензоил; или сульфонил, например метансульфонил, этансульфонил, бензолсульфонил, толуолсульфонил;

А₁ обозначает один, два или три заместителя, которые независимо друг от друга обозначают Н, C₁-С₆алкил, -OR₁₉ или галоген;

R₁₉ выбран из группы, включающей Н; C₁-С₆алкил; С₄-С₉циклоалкил; С₄-С₉гетероциклоалкил; арил; гетероарил; арилалкил, например бензил; и гетероарилалкил, например пиридилметил;

р обозначает число от 0 до 3; и

q обозначает число от 1-5 и r обозначает 0, или

q обозначает 0 и r обозначает число от 1 до 5;

или их фармацевтически приемлемые соли. Другие вариабельные заместители имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительными соединениями формулы (Id) являются соединения, в которых R₂ обозначает Н или -(СН₂)_pСН₂OН, где р обозначает число от 1 до 3, прежде всего соединения, в которых R₁ обозначает Н; такие как соединения, в которых R₁ обозначает Н и X и Y каждый обозначает Н, и где q обозначает число от 1 до 3 и r обозначает 0 или где q обозначает 0 и r обозначает число от 1 до 3. В этих соединениях R₂ предпочтительно обозначает Н или -СН₂-СН₂-ОН и сумма q и r предпочтительно равна 1.

Кроме того, настоящее изобретение относится к соединениям формулы (Iе):

или их фармацевтически приемлемым солям. Вариабельные заместители имеют указанные выше значения.

Наиболее предпочтительными соединениями формулы (Iе) являются соединения, в которых R₁₈ обозначает Н, фтор, хлор, бром, С₁-С₄алкильную группу, замещенную С₁-С₄алкильную группу, С₃-С₇циклоалкильную группу, незамещенный фенил, фенил, замещенный в пара-положении, или гетероарильное, например пиридильное кольцо.

Еще одной группой предпочтительных соединений формулы (Iе) являются соединения, в которых R₂ обозначает Н или -(СН₂)_pСН₂ОН, где р обозначает число от 1 до 3, прежде всего соединения, в которых R₁ обозначает Н; такие как соединения, в которых R1 обозначает Н и X и Y каждый обозначают Н, и где q обозначает число от 1 до 3 и r обозначает 0 или где q обозначает 0 и r обозначает число от 1 до 3. В этих соединениях R₂ предпочтительно обозначает Н или -СН₂-СН₂-ОН и сумма q и r предпочтительно равна 1. В этих соединениях р предпочтительно равно 1 и R₃ и R₄ предпочтительно обозначают Н.

Другую группу предпочтительных соединений формулы (Iе) составляют соединения, в которых R₁₈ обозначает Н, метил, этил, трет-бутил, трифторметил, циклогексил, фенил, 4-метоксифенил, 4-трифторметилфенил, 2-фуранил, 2-тиофенил, или 2-, 3- или 4-пиридил, где 2-фуранильные, 2-тиофенильные и 2-, 3- или 4-пиридильные заместители являются незамещенными или могут быть замещены, как указано выше для гетероарильных колец; R₂ обозначает Н или -(СН₂)_pСН₂ОН, где р обозначает число от 1 до 3; прежде всего соединения, в которых R₁ обозначает Н и X и Y каждый обозначают Н, и где q обозначает число от 1 до 3 и r равно 0 или где q равно 0 и r обозначает число от 1 до 3. В этих соединениях R₂ предпочтительно обозначает Н или -СН₂-СН₂-ОН и сумма q и r предпочтительно равна 1.

Важными представителями каждого из описанных выше подклассов соединений формулы (Iе) являются соединения формулы (Iе), в которой R₂₀ обозначает Н или С₁-С₆алкил, прежде всего Н.

Важными соединениями формулы (Ie) являются N-гидрокси-3-[4-[[(2-гидроксиэтил)[2-(1H-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид, N-гидрокси-3-[4-[[[2-(1H-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид и N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1H-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид или их фармацевтически приемлемые соли.

Настоящее изобретение относится также к соединениям формулы (If):

или ее фармацевтически приемлемым солям. Вариабельные заместители имеют указанные выше значения.

Предпочтительными соединениями формулы (If) являются соединения, в которых R₂ обозначает Н или -(СН₂)_pСН₂OН, где р обозначает число от 1 до 3, прежде всего соединения, в которых R₁ обозначает Н; такие как соединения, в которых R₁ обозначает Н и X и Y каждый обозначают Н, и где q обозначает число от 1 до 3 и r равно 0 или где q равно 0 и r обозначает число от 1 до 3. В этих соединениях R₂ предпочтительно обозначает Н или -СН₂-СН₂-ОН и сумма q и r предпочтительно равна 1.

Важным соединением формулы (If) является N-гидрокси-3-[4-[[[2-(бензофур-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид или его фармацевтически приемлемая соль.

Описанные выше соединения часто применяют в форме фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемыми солями в зависимости от конкретного случая могут служить фармацевтически приемлемые соли присоединения оснований и кислотно-аддитивные соли, например соли металлов, такие как соли щелочных и щелочно-земельных металлов, аммониевые соли, соли присоединения органических аминов и кислотно-аддитивные соли аминокислот и сульфонатные соли. К кислотно-аддитивным солям относятся кислотно-аддитивные соли неорганических кислот, такие как гдирохлорид, сульфат и фосфат; и кислотно-аддитивные соли органических кислот, такие как алкилсульфонат, арилсульфонат, ацетат, малеат, фумарат, тартрат, цитрат и лактат. Примерами солей металлов являются соли щелочных металлов, такие как литиевая соль, натриевая соль и калиевая соль; соли щелочно-земельных металлов, такие как магниевая соль и кальциевая соль, алюминиевая соль и цинковая соль. Примерами аммониевых солей являются соль аммония и соль тетраметиламмония. Примерами солей присоединения органических аминов являются морфолин и пиперидин. Примерами кислотно-аддитивных солей аминокислот являются соли глицина, фенилаланина и глутамовой кислоты и лизина. К сульфонатным солям относятся мезилат, тозилат и соли бензолсульфоновой кислоты.

Дополнительные соединения, представляющие собой ингибиторы HADC (HDAI), которые подпадают под объем формулы (I), и их синтез описаны в WO 02/22577, опубликованной 21 марта 2002 г., которая полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки. Два предпочтительных соединения, описанные в WO 02/22577, представляют собой N-гидрокси-3-[4-[(2-гидроксиэтил){2-(1H-индол-3-ил)этил] амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид формулы (II):

или его фармацевтически приемлемую соль и

N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1H-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид (LBH589) формулы (III):

или его фармацевтически приемлемую соль.

Кроме того, в изобретении предложено применение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, представляющего собой пролекарство, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для применения в сочетании с ионизирующим излучением для лечения пролиферативного заболевания.

Другим объектом изобретения является применение ингибитора HDAC формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, представляющего собой пролекарство, в сочетании с ионизирующим излучением для лечения пролиферативного заболевания, прежде всего плотной опухоли.

Следующим объектом изобретения является применение ингибитора HDAC формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира, представляющего собой пролекарство, в качестве действующего вещества для применения в сочетании с ионизирующим излучением для лечения пролиферативного заболевания, прежде всего плотной опухоли.

Еще одним объектом изобретения является упаковка, содержащая ингибитор HDAC формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир, представляющий собой пролекарство, вместе с инструкциями для применения в сочетании с ионизирующим излучением для лечения пролиферативного заболевания, прежде всего плотной опухоли.

В контексте настоящего описания понятие «замедление развития» означает введение комбинации пациентам, находящимся на ранней стадии пролиферативного заболевания, подлежащего лечению.

В контексте настоящего описания понятие «заболевание, связанное с плотной опухолью» включает (но не ограничиваясь только ими) глиому, рак щитовидной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак ободочной кишки и в целом рак ЖК-тракта, рак шейки матки, рак легкого, прежде всего мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого, рак головы и шеи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы или саркому Капоши. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения подлежащее лечению заболевание, связанное с опухолью, представляет собой глиому, рак предстательной железы или рак щитовидной железы. Комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, ингибирует рост плотных опухолей, но также и жидких опухолей. Кроме того, в зависимости от типа опухоли и конкретной используемой комбинации, можно достигать уменьшения объема опухоли. Комбинации, представленные в настоящем описании, можно применять также для предупреждения метастатического распространения опухолей и роста или развития микрометастазов.

Понятие «комбинация» относится к введению определенного количества ингибитора HDAC формулы (I) в сочетании с воздействием определенной дозы ионизирующего излучения таким образом, что имеет место синергетическое действие, которое не может быть достигнуто, если ингибитор HDAC формулы (I) вводят без раздельного, одновременного или последовательного применения ионизирующего излучения (при этом применение ионизирующего излучения может быть непрерывным, последовательным или спорадическим), или действие, которое не может быть достигнуто, если применяют ионизирующее излучение без раздельного, одновременного или последовательного введения производного ингибитора HDAC формулы (I), которое можно осуществлять непрерывно, последовательно или спорадически.

Предпочтительно понятие «комбинация» относится к введению определенного количества ингибитора HDAC формулы (I) в сочетании с применением определенной дозы ионизирующего излучения, в результате чего имеет место синергетическое антипролиферативное действие и/или уничтожающее действие в отношении клоногенных клеток, которое не может быть достигнуто, если:

1) ингибитор HDAC формулы (I) вводят, не применяя до этого, одновременно или последовательно с этим ионизирующее излучение, причем введение может быть непрерывным, последовательным или спорадическим;

2) ионизирующее излучение применяют, не вводя до этого, одновременно или последовательно с этим ингибитор HDAC формулы (I), причем введение может быть непрерывным, последовательным или спорадическим.

Понятие «ионизирующее излучение (ИИ)», как оно используется выше и ниже в настоящем описании, обозначает ионизирующее излучение в виде электромагнитных лучей (таких как рентгеновские лучи и гамма-лучи) или частиц (таких как альфа- или бета-частицы). Ионизирующее излучение применяют (но не ограничиваясь только этим) в лучевой терапии и оно известно в данной области [см. Hellman, Principles of Radiation Therapy, Cancer, в Principles и Practice of Oncology, под ред., Devita и др., 4-е изд., том 1, 1993, сс.248-275].

Комбинация, включающая:

(а) ингибитор HDAC формулы (I), который может присутствовать в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, и необязательно по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель; и

(б) ионизирующее излучение, обозначена ниже в настоящем описании как КОМБИНАЦИЯ, ПРЕДЛАГАЕМАЯ В ИЗОБРЕТЕНИИ.

Природа пролиферативных заболеваний, таких как заболевания, связанные с плотной опухолью, является многофакторной. В определенных обстоятельствах можно объединять лекарственные средства с различными механизмами действия. Однако использование произвольной комбинации лекарственных средств с различными механизмами действия не обязательно приводит к получению комбинаций, обладающих наиболее благоприятными действиями.

В комбинации, предлагаемой в изобретении, ингибитор HDAC формулы (I) и фармацевтически приемлемые соли и производные, представляющие собой пролекарства, предпочтительно применяют в форме фармацевтических препаратов, которые содержат соответствующее действующее вещество в терапевтически эффективном количестве необязательно в сочетании или в смеси с неорганическими или органическими твердыми или жидкими фармацевтически приемлемыми носителями, пригодными для введения.

В альтернативном варианте осуществления изобретения ионизирующее излучение применяют в качестве предварительной обработки, т.е. перед осуществлением лечения с помощью КОМБИНАЦИИ, ПРЕДЛАГАЕМОЙ В ИЗОБРЕТЕНИИ; пациента подвергают действию только ионизирующего излучения в течение определенного периода времени, например, путем ежедневного применения только ионизирующего излучения в течение двух или трех дней или недель.

Фармацевтические композиции, содержащие ингибитор HDAC, могут представлять собой, например, композиции для энтерального введения, такого как оральное, ректальное, осуществляемое с помощью аэрозоля ингаляционное или назальное введение, композиции для парентерального введения, такого как внутривенное или подкожное введение, или композиции для трансдермального введения (например, пассивного или ионтофоретического), или композиции для местного введения.

Предпочтительно содержащие ингибитор HDAC фармацевтические композиции адаптируют для орального введения.

Фармацевтические композиции, предлагаемые в изобретении, можно приготавливать хорошо известным методом, и они представляют собой композиции, пригодные для энтерального, такого как оральное или ректальное, и парентерального введения млекопитающим (теплокровным животным), включая человека, которые содержат в терапевтически эффективном количестве по меньшей мере один фармакологически активный компонент комбинации индивидуально или в сочетании с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями, прежде всего пригодными для энтерального или парентерального введения.

Новая фармацевтическая композиция содержит действующее вещество в количестве, составляющем, например, от примерно 10 до примерно 100%, предпочтительно от примерно 20 до примерно 60%. Фармацевтические препараты, предназначенные для применения в комбинированной терапии путем энтерального или парентерального введения, представляют собой, например, препараты в виде стандартных доз лекарственного средства, таких как таблетки с сахарным покрытием, таблетки, капсулы или суппозитории, и также ампулы. Если не указано иное, их приготавливают хорошо известным методом, например, с помощью общепринятых процессов смешения, грануляции, нанесения сахарного покрытия, растворения или лиофилизации. Следует иметь ввиду, что не требуется, чтобы содержание конкретного компонента композиции в индивидуальной дозе каждой лекарственной формы само по себе представляло собой эффективное количество, поскольку эффективное количество можно обеспечивать путем введения нескольких стандартных доз.

Для приготовления композиций для оральных лекарственных форм можно применять любые общепринятые фармацевтические среды, такие, например, как вода, гликоли, масла, спирты, корригенты, консерванты, красители; или носители, такие как крахмалы, сахара, микрокристаллическая целлюлоза, разбавители, агенты для улучшения грануляции, замасливатели, связующие вещества, разрыхлители и т.п., в случае твердых оральных препаратов, таких как порошки, капсулы и таблетки, причем твердые оральные препараты более предпочтительны по сравнению с жидкими препаратами. Благодаря простоте их применения таблетки и капсулы являются наиболее предпочтительными оральными стандартными дозами лекарственных средств, в которых как очевидно используют твердые фармацевтические носители.

В частности, терапевтически эффективное количество каждого компонента комбинации, входящего в КОМБИНАЦИЮ, ПРЕДЛАГАЕМУЮ В ИЗОБРЕТЕНИИ, можно вводить одновременно или последовательно и в любом порядке, и компоненты можно вводить раздельно или в виде фиксированной комбинации. Например, способ замедления развития или лечения пролиферативного заболевания, предлагаемый в изобретении, может заключаться в том, что:

(I) вводят первый компонент комбинации; и

(II) вводят второй компонент комбинации,

причем введение компонентов комбинации можно осуществлять одновременно или последовательно в любом порядке, в количествах, которые в совокупности представляют собой терапевтически эффективные количества, предпочтительно в синергетически эффективных количествах, например, в виде суточных или еженедельных доз, которые соответствуют указанным в настоящем описании количествам. Индивидуальные компоненты комбинации, входящие в КОМБИНАЦИЮ, ПРЕДЛАГАЕМУЮ В ИЗОБРЕТЕНИИ, можно вводить по отдельности в различные моменты времени в процессе терапевтического лечения или одновременно. Кроме того, понятие «введение» включает также применение пролекарства ингибитора HDAC формулы (I), которое превращается in vivo в соответствующий компонент комбинации. Таким образом, следует иметь ввиду, что под объем настоящего изобретения подпадают все режимы одновременного или чередующегося лечения и понятие «введение» следует истолковывать соответствующим образом.

Дозы ионизирующего излучения и ингибитора HDAC формулы (I) следует применять в таком взаимном соотношении, чтобы оно обладало синергетическим действием.

Если теплокровное животное представляет собой человека, то доза соединения формулы (I) предпочтительно представляет собой соответствующую дозу в диапазоне от 100 до 1500 мг/день, например 200-1000 мг/день, например 200, 400, 500, 600, 800, 900 или 1000 мг/день, которую вводят ежедневно в виде одной или двух доз. Соответствующие дозы и частота введения лиганда рецептора смерти должны зависеть от таких факторов, как природа и степень серьезности показания, подлежащего лечению, требуемого ответа, состояния пациента и т.п.

Штатный врач может выбрать конкретный путь введения и дозу соединения формулы (I), принимая во внимание индивидуальные особенности пациента, прежде всего возраст, вес, стиль жизни, уровень активности и т.д.

Доза ингибитора HDAC формулы (I) может зависеть от различных факторов, таких как эффективность и продолжительность действия действующего вещества, путь введения, эффективность и продолжительность воздействия ионизирующего излучения и/или пол, возраст, вес и индивидуальное состояние индивидуума, подлежащего лечению.

Доза ионизирующего излучения может зависеть от различных факторов, таких как эффективность и продолжительность воздействия ионизирующего излучения, путь применения, место применения, эффективность и продолжительность действия ингибитора HDAC формулы (I) и/или пол, возраст, вес и индивидуальное состояние индивидуума, подлежащего лечению. Дозу ионизирующего излучения, как правило, определяют в терминах радиационной поглощенной дозы, продолжительности и величины фракции, и в обязанности штатного врача входит тщательное ее определение.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения комбинация включает ионизирующее излучение и гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1H-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамид указанной выше формулы (III) или его фармацевтически приемлемую соль.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способу лечения теплокровного животного, страдающего пролиферативным заболеванием, который заключается в том, что животному вводят КОМБИНАЦИЮ, ПРЕДЛАГАЕМУЮ В ИЗОБРЕТЕНИИ, таким путем, чтобы она в совокупности обладала терапевтической эффективностью в отношении пролиферативного заболевания, и в которой компоненты комбинации могут присутствовать также в форме их фармацевтически приемлемых солей.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению КОМБИНАЦИИ, ПРЕДЛАГАЕМОЙ В ИЗОБРЕТЕНИИ, для замедления развития или лечения пролиферативного заболевания и для приготовления лекарственного средства, предназначенного для замедления развития или лечения пролиферативного заболевания.

Приведенные ниже примеры служат только для иллюстрации и никоим образом не направлены на ограничение объема настоящего изобретения.

Пример 1

Модель опухоли. Линии клеток LLC, Н450 и Н23 получают из АТТС. После подкожной (s.c.) инъекции в любую заднюю конечность у бестимусных мышей из этих клеток формируются опухоли. Клетки обрабатывают трипсином и подсчитывают с помощью гемоцитометра. Клетки отмывают в полной среде, и 10⁶ клеток вводят путем s.c. инъекции в заднюю конечность или в окно дорсальной кожной складки.

Вестерн-иммуноблоты. Клетки линий LLC, Н450 и Н23 выдерживают в течение ночи в бессывороточных средах DMEM/F-12 (фирма Gibco). Затем клетки обрабатывают 10мкМ Соединения III в течение 1 ч и/или облучают дозой 3 Гр. Клетки отмывают дважды ЗФР и добавляют буфер для лизиса (20 нМ Трис, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТК, 1% Тритон Х-100, 2,5 мМ Na РР, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и 1 мкг/мл леупептина). Концентрацию белка оценивают количественно по методу фирмы Bio-Rad. В каждую лунку вносят по двадцать (20) мкг общего белка и осуществляют разделение на 7 или 10%-ном ДСН-ПААГ-геле в зависимости от размера подлежащего исследованию белка-мишени. Белки переносят на нитроцеллюлозные мембраны (типа Hybond ECL; фирма Amersham, Арлингтон Хейтс, шт.Иллинойс) и зондируют с использованием первичных антител к каспазе 3, расщепленной каспазе 3, фосфо-Akt, Akt, PDGFR α и β (фирма Cell Signaling; 1:1000). Блоты отмывают и зондируют вторичным козьим антикроличьим антителом (фирма Sigma; 1:1000).

Количественная оценка степени апоптоза. Морфологический анализ апоптоза в клетках линии LLC осуществляют с помощью микроскопа с использованием окрашивания йодидом пропидия (PI). Апоптозные клетки идентифицируют на основе их ядерной конденсации и фрагментации. В целом метод заключается в следующем. Клетки линии LLC обрабатывают дозой излучения, составляющей 3 Гр, и N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1H-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2E-2-пропенамидом (LBH589) (100 нМ) или обоими агентами. Через 24 ч клетки отмывают несколько раз ЗФР, повышают проницаемость с помощью 30% метанола и окрашивают йодидом пропидия в ЗФР. Подсчитывают апоптозные и неапоптозные клетки в нескольких произвольно выбранных полях и данные представляют в виде процента апоптозных клеток. Апоптоз проверяют с помощью анализа методом Вестерн-блоттинга с использованием общей и расщепленной каспазы-3.

Оценка объема опухоли. Клетки линий LLC, Н450 и Н23 имплантируют в организм мышей линии C57BL6 и бестимусных мышей соответственно. 10⁶ жизнеспособных клеток, суспендированных в 0,1 мл среды для клеток, вводят путем s.c. инъекции в заднюю конечность. Каждую группу мышей, состоящую из 12 животных, разделяют на две группы с примерно одинаковым средним объемом опухоли. Средний объем опухоли у мышей к моменту обработки излучением (день 0) в контрольной группе, в группах, обрабатываемых только облучением, только LBH589 и в группе, которую обрабатывают LBH589 перед облучением, составляет примерно 200 мм³. Для осуществления облучения мышей иммобилизуют с помощью 140 мкл кетамина и закрывают свинцом все тело за исключением задней конечности, в которой находится опухоль. Общую дозу, составляющую 21 Гр, вводят в виде семи фракционированных (дробных) доз в дни 0-4, 7 и 8. Животным в группе, предназначенной для обработки LBH589, вводят LBH589 путем р.о. инъекции в пищевод в дни -1 и 6.

Группы обработки

LBH589 Облучение 10 мг/кг 5 ×/неделю 3 Гр×7 40 мг/кг 1 ×/неделю 3 Гр×7 0 3 Гр×7 10 мг/кг 5 × /неделю 0 40 мг/кг 1 ×/неделю 0 0 0

Двенадцати бестимусным мышам имплантируют клетки линий Н450 и Н23 с помощью той же самой процедуры, которая описана выше для клеток линии LLC. Средний объем опухолей у мышей к моменту обработки (день 0) излучением в контрольной группе, в группах, обрабатываемых облучением, только LBH589 и в группе, обрабатываемой LBH589 в сочетании с облучением, составляет 200 мм³.

Объемы опухолей измеряют в дни 0, 2, 4, 7, 9, 11, 14, 16, 18, 20 и 22 с помощью кожных штангенциркулей. Объемы опухолей рассчитывают по формуле (а×b×с/2), выведенной из формулы для объема эллипсоида (πd³/6). Данные рассчитывают в виде процента от исходного (день 0) объема опухоли и изображают графически в виде относительного объема опухоли ±С.К.О. для каждой группы обработки.

Гистологические срезы опухоли. Мышам линии C57BL6 вводят путем s.c. инъекции 10⁶ клеток линии LLC, суспендированных в 0,1 мл среды для клеток, в правую заднюю конечность. Опухолям дают вырасти в течение периода времени, составляющего 14 дней. Трех мышей обрабатывают LBH589 и трех мышей оставляют без обработки в качестве контроля. Через 1 ч после обработки мышей умерщвляют и опухоли изымают, фиксируют в формальдегиде и приготавливают срезы. Затем срезы, полученные из организма обработанных LBH589 мышей и контролей, зондируют с помощью антитела фосфо-Akt (фирма Cell Signaling, 1:1000). Осуществляют окрашивание TUNEL согласно описанной процедуре.

Статистический анализ. Статистический анализ проводят с помощью программы SPSS и R для расчета величин р с использованием t-критерия Стьюдента и стандартного отклонения для индивидуальных данных.

Результаты. LBH589 сенсибилизирует клетки немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) к цитотоксическим воздействиям ионизирующего излучения. Клоногенный анализ клеток линии Н460 осуществляют с применением LBH589 и дозы излучения 0-6 Гр. На фиг.1 представлены средние относительные величины выживаемости и стандартные отклонения для каждой группы обработки (n=3). Клетки суспендируют, подсчитывают с помощью гемоцитометра и высевают с определенными плотностями клеток. После прикрепления клетки обрабатывают с помощью LBH589 в течение 1 ч или 18 ч, после чего подвергают действию ионизирующего излучения (ИИ) в дозе 0, 2, 4 или 6 Гр. После обработки ИИ среды заменяют и клеткам дают размножаться в течение 10 дней. Приведенные данные представляют собой средние величины и стандартные отклонения относительных размеров колоний (n=3).

Необработанные контрольные клетки обладают выраженной радиорезистентностью, доза 6 Гр приводит к уменьшению выживаемости всего лишь на одну log-единицу. Обработка с помощью LBH589 в течение 1 ч и 18 ч перед ИИ приводит к синергетическому уменьшению выживаемости колоний по сравнению с необработанными клетками, о чем свидетельствует увеличение отрицательного наклона кривой доза-ответ. Обработка только LBH589 в течение 18 ч приводит к выраженному уменьшению эффективности роста, в то время как обработка в течение 1 ч не вызывает уменьшения эффективности роста по сравнению с контролем. Эти данные свидетельствуют о том, что LBH589 усиливает цитотоксическое действие ионизирующего излучения на NSCLC-клетки.

LBH589 усиливает индуцируемый излучением апоптоз. Для изучения воздействия вызываемого LBH589 ингибирования HDAC на апоптоз проводят три эксперимента in vitro. На фиг.2 представлены результаты анализа апоптоза методом проточной цитометрии с использованием Annexin V-ФИТЦ/РI. Линии клеток Н23 и Н460 обрабатывают 25 нМ LBH589 в течение 18 ч, после чего подвергают действию ионизирующего излучения в дозе 3 Гр. Через двадцать (20) ч клетки собирают, окрашивают Annexin-ФИТЦ и PI и анализируют методом проточной цитометрии. Приведены количество апоптозных клеток и стандартная ошибка (n=3) для каждого варианта обработки. *Р<0,05 при сравнении с контролем.

Применение 25 нМ LBH589 перед обработкой ионизирующим излучением с интенсивностью 3 Гр приводит к достоверному повышению количества апоптозных клеток с 7 до 30% для линии клеток Н23 (Р<0,001) и с 6 до 25% для линии клеток Н460 (Р=0,003) по сравнению с контролем. Применение только ИИ или только LBH589 приводит лишь к минимальному увеличению, а воздействие комбинированной обработки превышает ожидаемое аддитивное воздействие.

Для подтверждения способности LBH589 сенсибилизировать линии клеток рака легкого человека к индуцируемому излучением апоптозу проводят изучение морфологии ядра. На фиг.3 представлены средний процент пикнотических ядер и стандартная ошибка, определенные с помощью окрашивания с использованием DAPI. Окрашивание клеток, обработанных LBH589 и ИИ, осуществляют с помощью DAPI. Клетки субкультивируют на покровных стеклах и обрабатывают 25 нМ LBH589 в течение 18 ч, после чего подвергают воздействию ионизирующего излучения в дозе 3 Гр. Через восемнадцать (18) ч клетки фиксируют и окрашивают с помощью DAPI. Представлены средний процент пикнотических ядер и стандартная ошибка, определенные путем подсчета вручную с помощью микроскопа. *Р<0,05 при сравнении с контролем.

Применение 25 нМ LBH589 за 18 ч до обработки ионизирующим излучением в дозе 3 Гр приводит к достоверному увеличению процента пикнотических ядер до уровня, превышающего 10% для линий клеток Н23 (Р<0,001) и Н460 (Р=0,042). В необработанных клетках линий Н23 и Н460 выявлено менее 1% апоптозных ядер, в клетках линий Н23 и Н460, обработанных только ионизирующим излучением в дозе 3 Гр, выявлено 3 и 2% апоптозных ядер и в клетках линий Н23 и Н460, обработанных только LBH589, выявлено 4 и 2% апоптозных ядер соответственно.

Для подтверждения роли апоптоза в клетках, обработанных LBH589 и излучением, анализируют расщепление каспазы-3. Анализ методом Вестерн-блоттинга проводят на лизатах целых клеток линий Н23 и Н460. На фиг.4 приведены Вестерн-иммуноблоты расщепленной каспазы-3 и актина. LBH589 индуцирует расщепление каспазы 3. Клетки линий Н23 и Н460 обрабатывают 25 нМ LBH589 в течение 18 ч, после чего подвергают воздействию ионизирующего излучения с интенсивностью 3 Гр. Через шесть часов белок экстрагируют, производят количественную оценку, разгоняют в 12%-ном ДСН-ПААГ, переносят и зондируют антителами к расщепленной каспазе 3 и актину. Приведены иммуноблоты каспазы-3, расщепленной каспазы-3 и актина из линий клеток Н23 и Н460.

Видно, что после обработки с помощью LBH589 в обеих линиях клеток Н23 и Н460 происходит усиление расщепления каспазы-3. Обработка с помощью LBH589 перед обработкой ИИ повышает уровни расщепления каспазы-3 в клетках линии Н460. Однако это повышение более выражено для линии клеток Н23.

LBH589 повышает замедление роста опухоли in vivo. Клетки линии Н460 вводят путем инъекции в заднюю конечность мышей. После образования опухоли мышей обрабатывают перорально двумя дозами по 40 мг LBH589 и/или пятью фракциями ИИ в дозе 3 Гр в течение семи дней. На фиг.5 представлены кратность увеличения объема опухоли (А) и замедление роста опухоли (Б) для каждой группы обработки. Применение только LBH589 приводит к умеренному, но достоверному замедлению роста опухоли на два дня (Р<0,001). Применение только ИИ замедляет рост опухоли примерно на 4 дня (Р<0,001). Комбинированная обработка приводит к достоверному замедлению роста опухоли примерно на 20 дней (Р<0,001), это свидетельствует о том, что ингибирование HDAC усиливает воздействие ИИ на рост NSCLC-опухоли. Кроме того, у мышей, которых обрабатывают LBH589, наблюдаются минимальные признаки токсичности в процессе исследования, оцениваемые по потере веса и подвижности.

На фиг.5Б представлено воздействие LBH589 и ионизирующего излучения, полученное на модели с использованием ксенотрансплантата опухоли. Клетки линии Н460 вводят путем инъекции в заднюю конечность бестимусных мышей и дают расти в течение одной недели. Мышей разделяют на четыре группы: контроль, 3 Гр, LBH589 40 мг, LBH589 40 мг+3 Гр. LBH589 вводят через рот с помощью желудочного зонда за 1 ч перед обработкой ИИ. Мышей обрабатывают двумя дозами LBH589 и 5 фракциями ИИ в дозе 3 Гр в течение первых семи дней. На фиг.5А представлена средняя кратность увеличения объема опухоли и стандартная ошибка для каждой группы обработки (n=5). На фиг.5Б представлено среднее замедление роста опухоли и стандартная ошибка, рассчитанные с использованием 10-кратного увеличения объема опухоли в качестве стандарта.

LBH589 увеличивает продолжительность индуцируемых излучением локусов γ-Н2АХ. Для изучения локусов γ-Н2АХ, присутствующих в разрывах двухцепочечной ДНК, осуществляют иммуноокрашивание. На фиг.6А представлены репрезентативные фотографии линии клеток Н23, обработанных комбинацией LBH589 и ИИ. Можно видеть окрашенные красным цветом локусы γ-Н2АХ и окрашенный синим цветом контрастный краситель DAPI. Облучение в дозе 3 Гр индуцирует локусы γ-Н2АХ уже через 30 мин после обработки. Эти локусы исчезают через 6 ч в линиях клеток, обработанных только ИИ. Использование только LBH589 в течение 20 ч приводит к умеренному увеличению количества локусов γ-Н2АХ. По сравнению с этим в случае применения LBH589 за 18 ч до ИИ происходит увеличение продолжительности существования локусов γ-Н2АХ вплоть до 24 ч после ИИ (через 42 ч после введения LBH589). Кроме того, локусы γ-Н2АХ видны через 18 и 24 ч после ИИ в клетках, подвергающихся апоптозу (указаны стрелками). Интересно отметить, что локусы γ-Н2АХ отсутствуют в клетках, подвергающихся апоптозу после обработки излучением без осуществления ингибирования HDAC. Сходные результаты получены для линии клеток Н460 (дополнительная фиг.S1).

На фиг.6Б представлено количество локусов γ-Н2АХ, присутствующих через 24 ч после ИИ. LBH589 увеличивает продолжительность существования локусов γ-Н2АХ в подвергнутых воздействию излучения клетках рака легкого. Клетки линии Н23 обрабатывают указанной дозой 25 нМ LBH589 и/или 3 Гр. Для иммуноокрашивания с использованием меченного с помощью родамина вторичного антитела (красный цвет) применяют антитело к γ-Н2АХ. Клетки подвергают контрастному окрашиванию с помощью DAPI (синий цвет). Представлены репрезентативные фотографии линии клеток Н23 (А) в указанные моменты времени после ИИ. Стрелками указаны апоптозные клетки. На фиг.6Б приведены средние величины и С.К.О. для количества клеток с ядерными локусами γ-Н2АХ (*Р<0,05 при сравнении с контролем). Обработка только ионизирующим излучением в дозе 3 Гр и только LBH589 приводит к быстрому исчезновению γ-Н2АХ (<5% через 24 ч). Применение LBH589 перед осуществлением обработки с помощью ИИ достоверно замедляет исчезновение локусов γ-Н2АХ, при этом через 24 ч сохраняется 60% локусов в обеих клеточных линиях (Р<0,001). Увеличение продолжительности существования локусов γ-Н2АХ после обработки LBH589 и ИИ свидетельствует о том, что ингибирование HDAC нарушает процесс репарации ДНК и что этот механизм, по-видимому, повышает чувствительность NSCLC к цитотоксическому воздействию излучения.

Ядерная транслокация HDAC4 в линиях клеток рака легкого, подвергнутых облучению

Для выявления воздействия LBH589 на компартментализацию HDAC4 осуществляют иммуноокрашивание HDAC4 на линиях клеток Н23 и Н460. На фиг.7 представлены репрезентативные фотографии линии клеток Н460, которые зондируют антителами к HDAC4 и вторичными антителами, меченными с помощью родамина (красный цвет), и затем подвергают контрастному окрашиванию с помощью DAPI (синий цвет). Для необработанных клеток и клеток, обработанных только LBH589, характерно фоновое окрашивание HDAC4 в цитоплазме и ядре. Когда клетки линии Н460 обрабатывают ионизирующим излучением в дозе 3 Гр, то через 2 ч HDAC4 локализуется в ядре и в цитоплазме присутствует минимальное количество HDAC4. Однако когда LBH589 вводят перед обработкой ИИ, то это заметно ограничивает ядерную локализацию HDAC4. Сходное действие имеет место и для линии клеток Н23. Эти результаты для линии клеток Н460 подтверждаются результатами анализа цитоплазматических и ядерных белков методом Вестерн-блоттинга с использованием антител к HDAC4.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использована для лечения опухолей. Предложено применение N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамида (соединение формулы III) для приготовления лекарственного средства, предназначенного для использования в сочетании с ионизирующим излучением. Набор по изобретению включает соединение формулы III в фармацевтически приемлемой форме вместе с инструкциями по применению в сочетании с ионизирующим излучением. Использование изобретений позволяет повысить эффективность лечения солидных опухолей за счет синергического действия соединения формулы III и ионизирующего излучения, усиления индуцируемого излучением апоптоза и замедления роста опухоли. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 7 ил.

1. Применение ингибитора HDAC, представляющего собой N-гидрокси-3-[4-[[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]-2Е-2-пропенамид формулы (III)

или его фармацевтически приемлемую соль, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для использования в сочетании с ионизирующим излучением для лечения плотной (солидной) опухоли.

2. Применение по п.1, при котором сочетание является совместно терапевтически эффективным в отношении пролиферативного заболевания.

3. Применение по п.1 или 2, при котором лечение плотной опухоли приводит к замедлению развития опухоли.

4. Набор, содержащий соединение формулы (III) по п.1 в фармацевтически приемлемой форме вместе с инструкциями по применению в сочетании с ионизирующим излучением, предназначенный для лечения плотной опухоли.