АНАЛОГИ ЭКСЕНАТИДА Российский патент 2011 года по МПК C07K14/65 C07K14/575 A61K38/26 A61K38/22 A61P3/10 A61P7/12 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано, в фармакологии в качестве лекарственных средств для лечения сахарного диабета, а также для лечения и профилактики диабетической нефропатии и сердечной недостаточности.

Сахарный диабет представляет собой группу метаболических заболеваний, характеризующихся патологически повышенным уровнем глюкозы в крови, который возникает вследствие дефектов в секреции инсулина, действии инсулина, или обоих дефектах. Число больных сахарным диабетом в мире в конце 1999 года составляло 120-140 млн. человек, и это число по прогнозам к 2025 году может удвоиться [1]. Диагностическим критерием сахарного диабета является повышение концентрации глюкозы в плазме венозной и капиллярной крови натощак >7,8 ммоль/л или в цельной венозной или капиллярной крови >6,7 ммоль/л; через 2 ч после нагрузки глюкозой (перорально 75 г) уровень глюкозы в плазме венозной крови >11,1 ммоль/л (200 мг/100 мл) и в плазме капиллярной крови >12,2 ммоль/л (220 мг/100 мл); в цельной венозной крови >10,0 (180 мг/100 мл) и в цельной капиллярной крови >11,1 ммоль/л (200 мг/100 мл). Главная цель лечения сахарного диабета заключается в поддержании нормального уровня глюкозы в крови. Для этой цели, как известно, используются различные лекарственные средства, например, сульфонилмочевины, метформин и инсулин. Эксенатид является одним из лекарственных средств, эффективность лечения которым инсулинонезависимого сахарного диабета является доказанной в клинических испытаниях на людях.

Эксенатид представляет собой полипептид, известный первоначально под названием экзендин-4 (exendin-4), способ выделения которого из яда ящерицы Heloderma suspectum и аминокислотная последовательность HGEGTFTSDL SKQMEEEAVR LFIEWLKNGG PSSGAPPPS-NH₂, впервые были опубликованы в апреле 1992 [2]. Экзендин-4 является представителем семейства инкретиновых пептидов и обладает широким спектром активностей, таких как увеличение секреции инсулина, усиление переработки глюкозы, подавление аппетита, замедление перемещения пищи из желудка и т.д.

Известны области применения эксенатида: так, в патенте US 5424286 [3] раскрывается применение эксенатида (имеет также название экзендин-4) для стимуляции выделения инсулина с эффективностью большей, чем эндогенный гормон GLP-1. В описании изобретения приведенные примеры подтверждают, что эксенатид эффективен для лечения сахарного диабета.

В дальнейшем были обнаружены другие терапевтические эффекты эксенатида: снижение веса [4], снижение моторики и замедление опорожнения желудка [5, 6], а также инотропное и диуретическое действие эксенатида [7, 8, 9]. Описано применение эксенатида для лечения поликистоза яичника [10, 11, 12], лечения и профилактики нефропатии [13, 14], профилактики и лечения сердечной аритмии [15], для дифференцировки клеток костного мозга [16], лечения сахарного диабета у беременных [17, 18], для модуляции уровня триглицеридов и лечения дислипидемии [19, 20], подавления секреции глюкагона [21, 22], для дифференцировки неинсулинопроизводящих клеток в инсулинопроизводящие [23]. Заявка [24] описывает применение эксенатида, агонистов и антагонистов эксенатида для воздействия на центральную нервную систему. Патенты [25, 26] описывают применение эксенатида и его агонистов для снижения всасывания пищи. Заявка [27] описывает стабилизированные соединения эксенатида. Патенты [28, 29] описывают новые применения эксенатида (экзендина и агонистов экзендина).

Однако из всех описанных выше терапевтических эффектов эксенатида, основньм при его применении является лечение инсулинонезависимого сахарного диабета. Вместе с тем, его применение имеет ряд существенных недостатков, таких как необходимость частого применения в виде инъекций (дважды в день ежедневно), высокая стоимость эксенатида, и наличие ряда побочных эффектов, например, индивидуальная непереносимость и тошнота. Кроме того, терапевтическая эффективность эксенатида ограничена его высокой токсичностью, и достижение эффективного снижения (нормализации) глюкозы в крови, первая и главная цель лечения сахарного диабета, ограничивается невозможностью использования высоких доз эксенатида.

Поэтому существует задача создания новых аналогов эксенатида, имеющих меньшую стоимость, большую эффективность, и без побочных эффектов эксенатида.

Заявки [30, 31, 32] описывают новые фармацевтические композиции с применением эксенатида (экзендина). Основным недостатком описанных в них фармацевтических композиций является введение дополнительных веществ в лекарственную форму, что приводит к увеличению стоимости таких препаратов.

Заявки [33, 34] описывают модифицированный экзендин и агонисты экзендина. Заявки [35, 36] описывают новые соединения агонистов экзендина. Заявка [37] описывает новые пептидные аналоги GLP-1 и эксенатида. Заявки [38, 39] описывают новые производные инсулинотропного пептида эксенатида (экзендин-4). Заявка [40] описывает экзендин и агонисты экзендина пролонгированного действия. Заявка [41] описывает новые пептид-агонисты с активностью GLP-1 и эксенатида. Заявка [42] описывает новый аналог эксенатида. Заявка [43] описывает новые аналоги эксенатида для лечения сахарного диабета. Заявка [44] описывает новые производные эксенатида. Заявка [45] описывает новые аналоги эксенатида. Заявки [46, 47] описывают новые соединения агонистов эксенатида. Заявка [48] описывает новые разновидности эксенатида для лечения диабета. Основньм недостатком аналогов эксенатида, описанных в указанных патентах, является возможность ферментативного расщепления по С-концевой аминокислотной последовательности.

Заявка [49] описывает новые аналоги пептида GLP-1 и эксенатида. Заявки [50, 51 ] описывают новый аналог эксенатида с действием на головной мозг. Основным недостатком указанных аналогов является использование пептидных препаратов в более высоких дозах, чем сам эксенатид.

Заявка [52] описывает новые пептиды, аналоги эксенатида для снижения уровня глюкозы в крови. Заявка [53] описывает новые инсулинотропные пептиды пролонгированного действия, аналоги эксенатида. Заявка [54] описывает новые пептиды для снижения уровня глюкозы в крови, аналоги эксенатида. Основным недостатком аналогов эксенатида, описанных в указанных патентах, является необходимость дополнительных модификаций пептидной молекулы, дополнительных стадий синтеза таких препаратов.

Ближайшим аналогом заявленного изобретения является Международная заявка (WO - публикация: WO 2009/011544 А; патент Кореи) [55], выбранная в качестве прототипа, в которой общим с заявляемым изобретением является синтез аналогов эксенатида.

Основным недостатком известного изобретения является необходимость использования в синтезе неприродных синтетических кислот, таких как дезамино-гистидин, β-гидрокси-имидазо-пропионовая кислота, β-карбокси-имидазо-пропионовая кислота, имидазо-уксусная кислота и диметил-гистидин, что усложняет схему синтеза и приводит к увеличению стоимости лекарственного препарата на основе таких производных эксенатида.

В заявленном изобретении описываются аналоги эксенатида с заменами аминокислот в положениях 14 и 35, а также имеющие модификацию аминокислотного остатка в положении 39.

Известно, что пептидные молекулы в плазме крови подвергаются ферментативному расщеплению, что приводит к заметной потере биологической активности. Для предотвращения этого процесса, в частности, в пептиде заменяют некоторые L-аминокислоты на D-аминокислоты ([56] - замена в GLP-1 Аlа(8) на D-Ala для устойчивости по отношению к DPP-IV). Следовательно, замены некоторых L-аминокислот на D-аминокислоты в эксенатиде будут приводить к большей устойчивости по отношению к ферментативному расщеплению.

Водный раствор эксенатида имеет слабокислую реакцию (рН <5) (см. фармакопейную статью по препарату БАЕТА). В кислых водных растворах пептидные молекулы более подвержены различным химическим модификациям, например, таким как деамидирование и гидролиз. Следовательно, уменьшение количества амидных групп в молекуле будет приводить к большей стабильности препарата.

В заявке на патент США [57] описаны продукты деградации эксенатида, имеющие в своей структуре окисленный метионин в положении 14. Также представлен аналог эксенатида с заменой Met(14) на Leu(14) [58], но этот пептид менее активен и имеет более короткое время жизни по сравнению с эксенатидом. Следовательно, актуален поиск других аналогов с заменой метионина в положении 14.

При этом желательно, чтобы новые стабильные аналоги эксенатида обладали большими терапевтическими возможностями по сравнению с уже известными аналогами. Кроме того, такие соединения окажутся предпочтительными для практического применения, если они будут стабильны при хранении и использовании. В некоторых приспособлениях для введения лекарств, таких как шприцы-ручки или гидрогелевые импланты, пептиды не должны подвергаться распаду при хранении в водных растворах или во влажной среде в течение нескольких месяцев.

Изменения в первичной структуре пептидов, которые приводят к увеличению стабильности этих препаратов, также могут приводить к серьезным изменениям в их биологических свойствах, например, связыванию со специфическими рецепторами, активации рецепторов и т.д. Каждое из таких свойств может влиять на изменение активности этих соединений. Новые стабильные аналоги эксенатида должны обладать не меньшей эффективностью по сравнению с эксенатидом.

Новые агонисты эксенатида получены с использованием единой синтетической схемы, пригодной для получения различных аналогов данного пептида.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание новых, более стабильных, аналогов эксенатида, обладающих не меньшей биологической активностью, чем у прототипа, которые могут стать основой для использования в качестве лекарственных средств. Полученные аналоги обладают высокой способностью нормализации концентрации глюкозы в крови после нагрузки глюкозой, а также имеют высокую активность в отношении выделения почкой ионов натрия без потери ионов калия, усиливают выделение ионов кальция и магния, выделение осмотически свободной воды, что не было описано ранее для других известных аналогов эксенатида. Эти свойства могут быть полезны для восстановления водно-солевого обмена наряду с нормализацией гликемии.

Технический результат в заявленном изобретении достигается тем, что используются соединения формулы:

H-HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArgLeuPheIleGlu-TrpLeuLysAsnGlyGIyProSerSerGlyXProProProSer-ol, обладающие инсулинотропным и диуретическим действием.

Кроме этого, технический результат достигается тем, что в соединении, обладающим инсулинотропным и диуретическим действием используют L-Ala: Н-HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArgLeuPheIleGlu-TrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyAlaProProProSer-ol (Соединение I)

Помимо этого, технический результат достигается тем, что в соединении, обладающим инсулинотропным и диуретическим действием используют D-Ala: Н-HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArgLeuPheIleGlu-TrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyD-AlaProProProSer-ol (Соединение II).

Полная последовательность заявленных аналогов I и II была получена карбодиимидной конденсацией в растворе соответствующих защищенных фрагментов 1-34 и 35-39. Общий для этих аналогов фрагмент 1-34 был получен конденсацией фрагментов 1-4 и 5-34 твердофазным конвергентным методом на 2-хлортритилхлоридной смоле с использованием DIC/HOBt. Опытный образец полученного пептида деблокировали в смеси TFA:TIS:EDT:H₂O. Чистота по ВЭЖХ составила 85% пик молекулярного иона в масс-спектре MALDI-TOF соответствовал расчетному (Фиг.1), результаты аминокислотного анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты аминокислотного анализа пептида   Фрагмент 1-34 Аналог I Аналог II А1а 1.01 2.08 2.01 Arg 0.91 0.99 0.98 Asp 1.97 1.91 2.03 Glu 6.20 6.25 6.17 Gly 5.12 5.01 5.22 His 0.89 0.94 0.90 Ile 1.13 1.10 1.09 Leu 3.25 3.23 3.31 Lys 2.02 2.08 2.17 Nle 1.00 1.00 1.00 Phe 1.97 1.95 2.01 Pro 0.95 4.02 3.91 Ser 3.78 3.76 3.82 Thr 1.80 1.77 1.76 Trp 0.94 0.99 0.95 Val 1.15 1.16 1.09

Фрагменты 35-39 (H-AlaProProProSer(tBu)ol и H-D-AlaProProProSer(tBu)ol) синтезированы классическим методом в растворе. Дипептид ВосРrоРrоОН был получен в результате взаимодействия сукцинимидного эфира N-трет-бутилоксикарбонилпролина и натриевой соли пролина в смеси тетрагидрофуран-вода. BocProProProOH был получен в результате взаимодействия сукцинимидного эфира дипептида и натриевой соли пролина. Трет-бутилоксикарбонильная группа была удалена действием раствора трифторуксусной кислоты в дихлорметане. При взаимодействии в диоксане сукцинимидного эфира N-бензилоксикарбонилаланина или N-бензилоксикарбонил-D-аланина и трифторацетата трипептида в присутствии диизопропилэтиламина были получены соответствующие тетрапептиды, которые были использованы в карбодиимидной конденсации с O-трет-бутил-серинолом. Бензилоксикарбонильная группа с полученных соединений была удалена каталитическим гидрогенолизом в метаноле.

Fmoc-Ser(tBu)-ol получали по типичной методике восстановления карбоксильной группы борогидридом натрия [59].

Очистку фрагментов H-AlaProProProSer(tBu)ol и H-D-AlaProProProSer(tBu)ol осуществляли с помощью обращённофазной ВЭЖХ. Чистота пептидов составила более 95%, пики молекулярного ионов в масс-спектрах MALDI-TOF соответствовали расчетным, величины химических сдвигов протонов и углеродов по спектрам ЯМР представлены в таблице 2.

Таблица 2 Величины химических сдвигов протонов и углеродов по спектрам ЯМР H-AlaProProProSer-ol С H H-D-AlaProProProSer-ol C H Ala     D-Ala     -СН- 47,45 4,19 -CH- 47,82 3,98 -СН₃ 14,74 1,38 -СН₃ 15,92 1,19 Pro     Pro     -СН- 60,23 4,25 -СН- 60,23 4,25   60,30 4,59   60,30 4,59   60,46 4,64   60,46 4,64 -N-CH₂- 47,45   -N-CH₂- 47,45     47,57 3,40-   47,57 3,40-   47,87 3,75   47,87 3,75 -N-CH₂-CH₂- 24,43 1,8-2,00 -N-CH₂-CH₂- 24,43 (3) 1,8-2,00   (3)         -СН-СН₂- 29,40   -СН-СН₂ 29,40     27,68 1,65-   27,68 1,65-   27,81 2,35   27,81 2,35 Ser-ol     Ser-ol     -СН- 52,64 3,81 -СН- 52,64 3,81 -O-СН₂- 58,53 3,38- -O-СН₂- 58,53 3,38-   58,68 3,57   58,68 3,57

После обработки полученных защищенных последовательностей 1-39 смесью TFA:TIS:EDT:H₂O (полное удаление защитных групп) проводилась очистка с помощью обращеннофазной ВЭЖХ. Для подтверждения структур полученных соединений был проведен аминокислотный анализ (таблица 1) и определен молекулярный вес с помощью масс-спектрометрии (MALDI-TOF) (Фиг.2 и 3).

Технический результат подтвержден многочисленными экспериментальными исследованиями по синтезу заявляемых аналогов эксенатида и изучению их биологической активности.

Пример 1.

Для получения аналога (I) были использованы конвергентный твердофазный метод синтеза и классический синтез в растворе. 39-аминокислотная последовательность эксенатида была разбита на фрагменты. Метионин в положении 14 был заменен на норлейцин, амид серина в положении 39 был заменен на серинол. Часть фрагментов синтезировали твердофазным методом с использованием Fmoc-/tBu- стратегии на 2-хлортритилхлоридной смоле, фрагмент 35-39 был получен как твердофазным методом, так и классическим методом в растворе. Финальную конденсацию фрагментов 1-34 и 35-39 проводили в растворе, контролируя степень протекания реакции с помощью ВЭЖХ.

После деблокирования в смеси TFA:TIS:EDT:H20 и очистки обращеннофазной ВЭЖХ получили целевой пептид с чистотой 98%. Пик молекулярного иона в масс-спектре MALDI-TOF соответствовал расчетному.

Пример 2.

Для получения аналога (II) были использованы конвергентный твердофазный метод синтеза и классический синтез в растворе. 39-аминокислотная последовательность эксенатида была разбита на фрагменты. Метионин в положении 14 был заменен на норлейцин, L-аланин в положении 35 был заменен на D-аланин, амид серина в положении 39 был заменен на серинол. Часть фрагментов синтезировали твердофазным методом с использованием Fmoc-/tBu- стратегии на 2-хлортритилхлоридной смоле, фрагмент 35-39 был получен как твердофазным методом, так и классическим методом в растворе. Финальную конденсацию фрагментов 1-34 и 35-39 проводили в растворе, контролируя степень протекания реакции с помощью ВЭЖХ.

После деблокирования в смеси TFA:TIS:EDT:H₂O и очистки обращеннофазной ВЭЖХ получили целевой пептид с чистотой 97%. Пик молекулярного иона в масс-спектре MALDI-TOF соответствовал расчетному.

Пример 3.

Водные буферные растворы соединений I и II были инкубированы при 40°С и рН 7 в течение 3-х месяцев. Аликвоты этих растворов периодически отбирались и анализировались с помощью ВЭЖХ. За весь период исследования деградация пептидов составила <3% (<10% в течение месяца в заявке на патент [60). Таким образом, показано, что соединения I и II более стабильны, чем эксенатид и аналоги эксенатида, известные ранее.

Пример 4.

Проверка инсулинотропного действия соединений I и II.

Инсулинотропное действие аналогов I и II определяли по изменению уровня глюкозы в крови. Эксперименты выполнены на крысах линии Вистар (Rattus norvegicus var. albino), возраст 4-6 месяцев, масса тела 150-220 г. Утром за день до эксперимента крысы, как обычно, получали корм, а в течение последующего времени до проведения опыта им не давали пищи при свободном доступе к воде. Проведение опытов выполнено в соответствии с международными стандартами по работе с экспериментальными животными и одобрено этическим комитетом ИЭФБ РАН. Исследование гипогликемического действия препаратов проводилось на наркотизированных крысах, для того чтобы исключить влияние стрессорных воздействий во время эксперимента на уровень глюкозы в крови. Для наркоза крысам внутрибрюшинно вводили 6 мл/кг массы тела смеси 0.75% нембутала и 0.37% хлоралозы. Через 30 мин после введения наркоза у крыс брали каплю капиллярной крови из хвоста и определяли уровень глюкозы с помощью тест-полосок (глюкометр Accu-Chek Go, Roche, Швейцария).

Эксенатид и его аналоги (14-Nlе-35-L-Аlа-39-Serinol-эксенатид (I) и H-Nle-35-D-Ala-39- Seriol-эксенатид (II)) растворяли в 0.9%-ном растворе хлорида натрия до концентрации 1-5 мкг/мл и инъецировали внутримышечно в объеме 1 мл/кг массы тела. Контрольной группе животных вводили тот же объем 0.9%-ного раствора хлорида натрия. Через 15 мин после введения препаратов крысам внутрибрюшинно вводили 3 мл/кг 50%-ного раствора глюкозы (1.5 г глюкозы/кг массы тела). Животным группы контроля внутрибрюшинно вводили 3 мл/кг 0.9%-ного раствора хлорида натрия. Через 15, 30 и 60 минут после введения глюкозы у крыс из хвоста брали пробы капиллярной крови и определяли концентрацию в них глюкозы с помощью глюкометра.

Статистическую обработку осуществляли с использованием программы Statistica 6.0. Все данные представлены в виде М±σ. Значимость различий показателей между группами оценивали по тесту ANOVA и критерию Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений (при p<0.05).

Результаты

Таблица 3 Влияние эксенатида на концентрацию глюкозы в капиллярной крови крыс в условиях нагрузки глюкозой Серии экспериментов n 0 мин 15 мин 30 мин 60 мин Контроль 5 6.1±0.4 5.1±0.3 4.6±0.4 5.0±0.2 Глюкоза 9 6.2±0.6 11.4±1.8^§ 10.3±1.1^§ 5.4±0.7 глюкоза + эксенатид 1 мкг/кг 6 6.1±0.2 10.3±1.4^§ 8.3±1.8^§ 4.4±0.6 глюкоза + аналог I 1 мкг/кг 5 6.5±0.5 11.0±1.2^§ 11.3±0.7^§ 5.7±0.6 глюкоза + эксенатид 2 мкг/кг 10 6.4±0.7 8.4±1.6*^§ 6.6±1.6*^§ 4.7±0.6 глюкоза + аналог I 2 мкг/кг 5 5.6±0.4 10.1±0.8^§ 7.9±1.7^§ 4.6±0.3 глюкоза + аналог II 2 мкг/кг 5 6.5±0.6 8.9±1.3*^§ 6.5±0.7*^§ 4.9±0.9 глюкоза + аналог I 5 мкг/кг 5 6.5±0.7 6.9±0.3*^§ 5.4±0.9* 4.3±1.0 ^§ - значимость различий с группой контроля, *- значимость различий с группой с введением глюкозы без препаратов (р<0.05).

Таким образом, показано, что у соединений I и II при большей устойчивости удельная активность в нормализации концентрации глюкозы в крови на фоне сахарной нагрузки сохраняется на уровне эксенатида.

Пример 5.

Проверка влияния соединений I и II на функции почек.

Влияние аналогов I и II на функции почек определяли по измерению выделения ионов, диуретической активности и осморегулирующей функции почек. Эксперименты проведены на ненаркотизированных крысах линии Вистар (Rattus norvegicus var. albino), возраст 4-6 месяцев, масса тела 150-220 г. Аналоги эксенатида (14-Nle-35-L-Ala-39-Serinol-эксенатид (I) и 14-Nlе-35-D-Аlа-39-Seriol-эксенатид (II)) растворяли в 0.9%-ном растворе хлорида натрия и вводили внутримышечно в дозе 2 мкг/кг массы тела. Животным группы контроля вводили 0.9%-ный раствор хлорида натрия. Животные помещались в клетки-пеналы с проволочным дном, через отверстия которого моча стекала по воронке в пробирку. Выделение мочи регистрировали при спонтанном мочеотделении, измеряли объем мочи, концентрацию в ней ионов натрия, калия, магния, кальция и осмоляльность. Кровь брали по окончании экспериментов из сонной артерии под эфирным наркозом.

В пробах сыворотки крови и мочи осмоляльность определяли криоскопическим методом на микроосмометре 3300 (Advanced Instruments, Inc., США), концентрацию ионов натрия и калия - на пламенном фотометре Corning-410 (Великобритания) в воздушно-пропановом пламени, ионов магния и кальция - в воздушно-ацетиленовом пламени на атомном абсорбционном спектрофотометре Hitachi-508 (Япония).

Статистическую обработку осуществляли с использованием программы Statistica 6.0. Все данные представлены в виде М±о. Значимость различий показателей между группами оценивали по тесту ANOVA и критерию Ньюмена-Кейлса для множественных сравнений (при p<0.05).

Результаты

После инъекции крысам аналогов эксенатида отмечался выраженный рост диуреза (Фиг.4) экскреции осмотически активных веществ (табл.4) и натрия (Фиг.5). Несколько увеличилось выведение катионов магния и кальция (табл.4), в то время как экскреция калия достоверно не отличалась от уровня в контроле (Фиг.6).

Таблица 4. Влияние аналогов эксенатида (2 мкг/кг, в/м) на диурез и экскрецию катионов и воды почкой крыс. Экскреция за 2 ч эксперимента^§ препарат I (n=6) препарат II (n=7) контроль (n=10) Объем мочи, мл 2.0±0.9* 2.4±0.6* 0.4±0.1 Осмотически активные вещества, мкосм 812±223* 865±189* 288±46 Ионы натрия, мкмоль 259±82* 283±71* 40±12 Ионы калия, мкмоль 38±18 37±11 25±6 Ионы магния, мкмоль 5.4±3.0* 5.3±2.2* 2.2±0.4 Ионы кальция, мкмоль 1.3±0.8* 1.3±0.8* 0.3±0.1 Осмотически свободная вода, мл -0.7±0.2 -0.5±0.2 -0.6±0.1 * - значимость различий с группой контроля (p<0.05). ^§ - показатели рассчитаны на 100 г массы тела.

Суммарная реабсорбция осмотически свободной воды за 2 часа экспериментов не изменялась. При анализе динамики экскреции/реабсорбции осмотически свободной воды было выявлено, что в первые 30 мин действия препаратов отмечается значительное снижение реабсорбции осмотически свободной воды в почке и появление в моче осмотически свободной воды. После 45 мин действия инъецированных пептидов происходит смена экскреции осмотически свободной воды на её интенсивную реабсорбцию (Фиг.7).

Полученные результаты исследований показали, что соединения I и II имеют высокую селективную ионорегулирующую и диуретическую активности, которые не были описана для других известных аналогов эксенатида. Клинически ценным является усиление экскреции жидкости и натрия почкой в сочетании с сохранением калия в организме, поскольку это благоприятствует снижению артериального давления и не вызывает неблагоприятных побочных эффектов, связанных с гипокалиемией.

Таким образом, заявленные аналоги эксенатида I и II:

1) более стабильны, чем эксенатид и аналоги эксенатида (патент [60]);

2) обладают высокой инсулинотропной активностью;

3) имеют высокую активность в отношении выделения почкой ионов натрия, выделения воды в сочетании с сохранением ионов калия, выделения ионов кальция и магния, что не было описано для других известных аналогов эксенатида.

Список литературы:

1. Diabetes mellitus, WHO information. Fact Sheet №138, Reviewed November (1999)

2. Eng, J. et al., Isolation and Characterization of Exendin-4, an Exendin-3 Analogue, from Heloderma suspectum Venom. J. Biol. Chem., Vol. 267, Issue 11, 7402-7405, Apr, 1992.

3. US 5424286 Exendin-3 and exendin-4 polypeptides, and pharmaceutical compositions comprising same

4. US 2005043238 Exendin formulations for weight reduction

5. US 6858576 Method for regulating gastrointestinal motility

6. US 9800449 Use of exendins and agonists thereof for the reduction of food intake

7. US 2005037958 Inotropic and diuretic effects of GLP-1 and GLP-1 agonists

8. US 6703359 Inotropic and diuretic effects of exendin

9. JP 2002509078 Inotropic and diuretic effects of exendin and GLP-1

10. US 2004266678 Methods and compositions for treating polycystic ovary syndrome

11. MX 2008015640 Compounds for treatment of metabolic disorders

12. US 2009291100 Therapeutic agent for polycystic ovary syndrome (PCOS)

13. JP 2006520747 Methods and compositions for treating polycystic ovary syndrome

14. US 2004209803 Compositions for the treatment and prevention of nephropathy

15. AU 2003297356 Prevention and treatment of cardiac arrhythmias

16. AU 2003262628 Bone marrow cell differentiation

17. US 2004092443 Long-acting exendins and exendin agonists

18. US 2004023871 Use of exendins and agonists thereof for the treatment of gestational diabetes mellitus

19. JP 2003519667 Use of exendins and agonists thereof for modulation of triglyceride levels and treatment of dyslipidemia

20. US 2003036504 Use of exendins and agonists thereof for modulation of triglyceride levels and treatment of dyslipidemia

21. US 9410225 Method for regulating gastrointestinal motility

22. RU 2247575 Method for inhibiting glucagon

23.US 2007041951 Differentiation of non-insulin producing cells into insulin producing cells by GLP-1 or exendin-4 and uses thereof

24. PT 1019077 Novel exendin agonist compounds

25. LU 91342 Use of exendins and agonists thereof for the reduction of food intake

26. US 2002137666 Use of exendins and agonists thereof for the reduction of food intake

27. US 2006194719 Stabilized exendin-4 compounds

28. US 2003087821 Exendins, exendin agonists, and methods for their use

29. EP 1419783 Use of a composition comprising an exendin or a compound derived therefrom and a pharmaceutical carrier

30. CA 2487269 Novel exendin agonist formulations and methods of administration thereof

31. EP 1419783 Use of a composition comprising an exendin or a compound derived therefore and a pharmaceutical carrier

32. US 2003087820 Novel exendin agonist formulations and methods of administration thereof

33. US 0011814 Modified exendins and exendin agonists

34. CN 1372570 Modified exendin and exendin agonists

35. US 0000902 Novel exendin agonist formulations and methods of administration thereof

36. CN 1284755 Cell lead, cell assemly using the same and combined cell

37. US 2004242853 Glp-1 exendin-4 peptide analogs and uses thereof

38. CN 0200316 Derivatives of exendin

39. US 2004142866 Derivatives of the insulinotropic peptide exendin-4 and methods of production thereof

40. US 2004092443 Long-acting exendins and exendin agonists

41. US 2004106547 Novel peptide agonists of GLP-1 activity

42. CN 1381271 Application of insulinotropic peptide Exendin 4 analog and its salt

43.US 6767887 Exendin analogues, processes for their preparation and medicaments containing them

44. EP 1056775 GLP-1 derivatives of GLP-1 and exendin with protracted profile of action

45. US 2009215694 Lyophilized formulations of exendins and exendin agonist analogs

46. US 9824273 Novel exendin agonist compounds

47. US 9824210 Novel exendin agonist compounds

48. DE 19637230 Truncated versions of exendin peptide(s) for treating diabetes

49. US 0224141 GLP-1 exendin-4 analogs and uses thereof

50. US 0126616 A novel peptide with effects on cerebral health

51. US 2002115605 Novel peptide with effects on cerebral health

52. EP 1196444 Peptides that lower blood glucose levels

53. US 20080318861 Mucosal delivery of stabilized formulations of exendin

54. EP 1076066 Peptides for lowering blood glucose levels

55. KR 2008004170 Insulinotropic peptide derivative wherein its N-terminal ammo acid is modified (прототип)

56. CA 2003001470 Modified GLP-1 peptides with increased biological potency

57. US 20060194719 Stabilized exendin-4 compounds

58. Hargrove et. al., Biological activity of AC3174, a peptide analog of exendin-4. Regulatory Peptides 141 (2007) 113-119

59. Tetrahedron Letters, Vol 32, №7, pp.923-926,1991

60. CA 2008000537 Exendin analogs

Изобретение относится к новым аналогам эксенатида общей формулы Н-HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArgLeuPhe-IleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyXProProProSer-ol, где Х выбирают из L-Ala или D-Ala, которые могут быть использованы для лечения сахарного диабета, а также для лечения и профилактики диабетической нефропатии и сердечной недостаточности. Полученные аналоги более стабильны, чем эксенатид, обладают высокой инсулинотропной активностью, а также имеют высокую активность в отношении выделения почкой ионов натрия без потери ионов калия, усиливают выделение ионов кальция и магния, выделение осмотически свободной воды. Эти свойства могут быть полезны для восстановления водно-солевого обмена наряду с нормализацией гликемии. 2 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл.

1. Соединение формулы:
H-HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArg-LeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyXProProProSer-ol,
где X выбирают из L-Ala или D-Ala,
обладающее инсулинотропным и диуретическим действием.

2. Соединение формулы по п.1, где Х представляет собой L-Ala:
H-HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArg-LeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyAlaProProProSer-ol.

3. Соединение формулы по п.1, где Х представляет собой D-Ala:
H-HisGlyGluGlyThrPheThrSerAspLeuSerLysGlnNleGluGluGluAlaValArg-LeuPheIleGluTrpLeuLysAsnGlyGlyProSerSerGlyD-AlaProProProSer-ol.