СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА L-АМИНОКИСЛОТ Российский патент 2011 года по МПК C12P13/04 

Описание патента на изобретение RU2422530C2

Область техники

Данное изобретение относится к способам получения L-аминокислот с применением бактерий и, конкретнее, к способу получения таких L-аминокислот, как L-лизин, L-треонин и L-глутаминовая кислота. L-лизин и L-треонин применяются как добавки в корм для животных, диетическое питание, экстракты, содержащие аминокислоты, и тому подобное. L-глутаминовая кислота применяется в качестве приправы к пище.

Уровень техники

L-аминокислоты промышленно производятся с помощью ферментации, с применением бактерий, принадлежащих к родам Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia или им подобным. Способы получения L-лизина описаны в EP 0643135 B, EP 0733712 B, EP 1477565 A, EP 0796912 A, EP 0837134 A, WO 01/53459, EP 1170376 A и WO 2005/010175. В этих способах применяются природные бактериальные штаммы либо их искусственные мутанты, также как бактериальные штаммы, модифицированные с помощью технологий рекомбинантных ДНК для повышения активности ферментов, синтезирующих L-аминокислоты.

Ацетил-CoA синтаза катализирует реакцию получения ацетил-CoA, пирофосфата и АМФ из уксусной кислоты, коэнзима А и АТФ, и кодируется геном acs (J Bacteriol. 1995 May; 177(10):2878-86). Однако до сих пор в печати не было сообщений о том, что повышение активности ацетил-CoA синтазы может быть полезно для продукции L-аминокислот.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью данного изобретения является предоставление бактерии, способной к эффективной продукции L-аминокислот, и способа эффективной продукции L-аминокислот с применением данной бактерии.

Авторы настоящего изобретения провели подробные исследования для достижения вышеуказанной цели. В результате, они обнаружили, что продукция L-аминокислот повышается при увеличении количества копий гена acs, кодирующего ацетил-CoA синтазу, в бактериях, продуцирующих L-аминокислоты, и таким образом, осуществили данное изобретение.

Данное изобретение раскрыто, как указано ниже.

Целью данного изобретения является предоставление способа продукции L-аминокислот, включая культивирование бактерий в среде, и получение L-аминокислот из среды либо бактериальных клеток, где указанные бактерии являются производящими L-аминокислоты бактериями, относящимися к семейству Enterobacteriaceae, которые были модифицированы для повышения активности ацетил-CoA синтазы.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, где активность ацетил-CoA синтазы повышена за счет увеличения числа копий гена acs, кодирующего ацетил-CoA синтазу, либо путем модификации последовательностей, регулирующих экспрессию указанного гена.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, где указанный ген acs выбран из группы, включающей:

(a) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3; и

(b) ДНК, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, либо с зондом, полученным из данной нуклеотидной последовательности, в жестких условиях, и где указанная ДНК кодирует белок, обладающий ацетил-CoA синтазной активностью.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, где L-аминокислота выбрана из группы, состоящей из: L-лизина, L-аргинина, L-гистидина, L-изолейцина, L-валина, L-лейцина, L-треонина, L-фенилаланина, L-тирозина, L-триптофана, L-цистеин, L-глутаминовой кислоты и их комбинации.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление способа, описанного выше, где указанные бактерии принадлежат родам Escherichia, Pantoea, или Enterobacter.

ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Данное изобретение будет далее описано более подробно.

Бактерии данного изобретения

Бактерии данного изобретения относятся к семейству Enterobacteriaceae, способны к продукции L-аминокислот и модифицированы так, что у них повышена активность ацетил-CoA синтазы (ACS). В этом тексте термин «способность к продукции L-аминокислот» относится к способности продуцировать и аккумулировать L-аминокислоты в среде в количестве, достаточном для выделения, когда бактерии данного изобретения культивируются в среде. Бактерии данного изобретения могут быть способны к продукции множества L-аминокислот. Способность бактерий к продукции L-аминокислот может быть природной, либо получена путем модифицирования бактерии мутированием или с помощью технологий рекомбинантных ДНК, для сообщения бактерии способности к продукции L-аминокислот.

Тип L-аминокислот не ограничен конкретным типом, и примеры их включают основные L-аминокислоты, как L-лизин, L-орнитин, L-аргинин, L-гистидин и L-цитруллин; алифатические L-аминокислоты, как L-изолейцин, L-аланин, L-валин, L-лейцин и L-глицин; гидрокси моноаминокарбоновые кислоты, такие как L-треонин и L-серин; циклические L-аминокислоты, как L-пролин; ароматические L-аминокислоты, такие как L-фенилаланин, L-тирозин, L-триптофан; серосодержащие L-аминокислоты, такие как L-цистеин, L-цистин, L-метионин; кислые L-аминокислоты, такие как L-глутаминовая кислота, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-аспарагин. Бактерии данного изобретения могут быть способны к продукции двух и более типов L-аминокислот.

Обеспечение способности к продукции L-аминокислот

Далее будут описаны способы обеспечения способности к продукции L-аминокислот, также как примеры бактерий, которым может быть придана способность к продукции L-аминокислот. Однако перечень бактерий ими не ограничен при условии, что они обладают способностью к продукции L-аминокислот.

Бактерии, относящиеся к семейству Enterobacteriaceae, включая принадлежащих к родам Escherichia или Pantoea, могут быть использованы как родительский штамм, из которого производятся бактерии данного изобретения. Другие примеры бактерий, относящихся к семейству Enterobacteriaceae, включают γ-Proteobacteria, такие как Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Salmonella и Morganella.

Применяться могут такие бактерии рода Escherichia; опубликованы в Neidhardt et al. ((Backmann, B.J. 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, p.2460-2488. Table 1. In F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/Second Edition, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.), в частности Escherichia coli. Примеры штаммов Escherichia coli дикого типа включают штамм K-12 или его производные, Escherichia coli штамм MG1655 (ATCC No. 47076), и штамм W3110 (ATCC No. 27325). Эти штаммы доступны в American Type Culture Collection (ATCC) (Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1, United States of America).

Примеры бактерий Enterobacter включают Enterobacter agglomerans и Enterobacter aerogenes, а примером бактерии Pantoea является Pantoea ananatis. Недавно, Enterobacter agglomerans в некоторых случаях была классифицирована как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рибосомальной РНК. Следовательно, бактерии данного изобретения могут относиться к любому роду Enterobacter или роду Pantoea, при условии, что они классифицированы как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae. Когда Pantoea ananatis выведены с применением технологий генной инженерии, могут быть использованы штамм Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614), штамм AJ13356 (FERM BP-6615), штамм AJ13601 (FERM BP-7207), их производные и им подобные. Эти штаммы были идентифицированы и представлены для регистрации как Enterobacter agglomerans, когда они были выделены, но как описано выше, эти штаммы были переклассифицированы как Pantoea ananatis на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рибосомальной РНК.

Способность к продукции L-аминокислот может быть придана родительским штаммам следующим образом.

С целью обеспечения способности к продукции L-аминокислот могут применяться методики, используемые при традиционном разведении Escherichia coli либо им подобных, такие как получение ауксотрофных мутантов, штаммов, устойчивых к аналогам, или штаммов, мутантных по регуляции обмена веществ; либо создание рекомбинантных штаммов, имеющих повышенную экспрессию ферментов, синтезирующих L-аминокислоты (Amino Acid Fermentation, Japan Scientific Societies Press, first edition publication: May 30, 1986, p.77 to 100). В данном изобретении такие свойства, как ауксотрофность, устойчивость к аналогам, мутации регуляции метаболизма, могут быть сообщены бактериям независимо либо в комбинации со способностью к продукции L-аминокислот. Более того, может быть усилена экспрессия одного или более фермента, синтезирующего L-аминокислоты. Кроме того, сообщение бактериям таких свойств как ауксотрофность, устойчивость к аналогам, мутации регуляции метаболизма может быть скомбинировано с повышенной экспрессией ферментов, синтезирующих L-аминокислоты.

Ауксотрофные мутантные штаммы, штаммы, устойчивые к аналогам L-аминокислот, и штаммы, несущие мутации в регуляции метаболизма, которые обладают способностью к продукции L-аминокислот, могут быть получены следующим образом. Родительский штамм либо штамм дикого типа подвергается типичной мутагенной обработке, такой как облучение рентгеновскими или ультрафиолетовыми лучами, или подвергается воздействию мутагена, включая N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) и этилметансульфонат (EMS), с последующей селекцией штаммов, демонстрирующих ауксотрофность, устойчивость к аналогам или мутации регуляции метаболизма и обладающих способностью к продукции L-аминокислот.

Методики генной рекомбинации включают повышение экспрессии гена, кодирующего фермент, вовлеченный в биосинтез целевой L-аминокислоты, и снижение экспрессии гена, кодирующего фермент, вовлеченный в деградацию целевой L-аминокислоты.

В дальнейшем в этом документе будут представлены примеры бактерий, которым сообщена способность к продукции L-аминокислот, но разновидности бактерий, применяемых в способе изобретения, не ограничены этими примерами.

Бактерии, продуцирующие L-треонин

Примеры родительских штаммов для производства L-треонина-продуцирующих бактерий данного изобретения включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (патент США No. 5175107, патент США No. 5705371), E.coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (патент США No. 5631157), E.coli NRRL-21593 (патент США No. 5939307), E.coli FERM BP-3756 (патент США No. 5474918), E.coli FERM BP-3519 и FERM BP-3520 (патент США No. 5376538), E.coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978)), E.coli VL643 и VL2055 (EP 1149911 A) и подобные.

Штамм TDH-6 является дефицитным по гену thrC, а также сахарозо-усваивающим, а ген ilvA имеет мутацию с сохранением остаточного уровня экспрессии. Этот штамм также имеет мутацию в гене rhtA, которая придает устойчивость к высоким концентрациям треонина и гомосерина. Штамм B-3996 содержит pVIC40, полученный инсерцией оперона thrA*BC, содержащего мутантный ген thrA, в вектор - производный RSF1010. Этот мутантный ген thrA кодирует аспартокиназу гомосерин дегидрогеназу I, которая существенно снижает восприимчивость к ингибированию треонином по принципу обратной связи. Штамм B-3996 был представлен к регистрации 19 ноября 1987 во Всесоюзном Научном Центре Антибиотиков (ул. Нагатинская 3-A, 117105 Москва, Российская Федерация) под инвентарным номером RIA 1867. Этот штамм также был представлен к регистрации в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (VKPM) (Россия, 117545 Москва, Дорожный проезд, 1) 7 апреля 1987 под инвентарным номером B-3996.

E.coli VKPM B-5318 (EP 0593792B) также может быть использован для получения бактерий данного изобретения, продуцирующих L-треонин. Штамм B-5318 является прототрофным относительно изолейцина, а регуляторная область треонинового оперона в плазмиде pVIC40 замещена температуро-зависимым репрессором С1 и PR промотором фага лямбда. Штамм VKPM B-5318 был представлен к регистрации в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (VKPM) (Россия, 117545 Москва, Дорожный проезд, 1) 3 мая 1990 под инвентарным номером VKPM B-5318.

Предпочтительно, бактерии данного изобретения дополнительно модифицированы с целью повышения экспрессии одного или более генов из следующего списка:

- мутантный ген thrA, кодирующий аспартокиназу гомосерин дегидрогеназу I, которая обеспечивает устойчивость к ингибированию треонином по принципу обратной связи;

- ген thrB, кодирующий гомосеринкиназу;

- ген thrC, кодирующий треонинсинтазу;

- ген rhtA, кодирующий предполагаемый трансмембранный белок;

- ген asd, кодирующий аспартат-β-семиальдегид дегидрогеназу; и

- ген aspC, кодирующий аспартат аминотрансферазу (аспартат трансаминазу).

Последовательность гена Escherichia coli thrA, который кодирует аспартокиназу гомосерин дегидрогеназу I, была установлена (номера нуклеотидов с 337 по 2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). Ген thrA расположен между генами thrL и thrB на хромосоме E.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена Escherichia coli thrB, который кодирует гомосерин киназу, была установлена (номера нуклеотидов с 2801 по 3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). Ген thrB расположен между генами thrA и thrC на хромосоме E.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена Escherichia coli thrC, который кодирует треонин синтазу, была установлена (номера нуклеотидов с 3734 по 5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). Ген thrC расположен между геном thrB и открытой рамкой считывания yaaX на хромосоме E.coli K-12. Все три гена функционируют вместе как треониновый оперон. Чтобы повысить экспрессию треонинового оперона, область аттенюатора, которая прерывает транскрипцию, может быть удалена из оперона (WO2005/049808, WO2003/097839).

Мутированный ген thrA, кодирующий аспартокиназу гомосерин дегидрогеназу I, обеспечивающую устойчивость к ингибированию треонином по принципу обратной связи, также как гены thrB и thrC, могут быть получены как один оперон из хорошо известной плазмиды pVIC40. Эта плазмида присутствует в штамме E.coli VKPM B-3996, продуцирующем треонин, и подробно описана в патенте США №5705371.

Ген rhtA расположен на 18 мин на хромосоме E.coli, близко к оперону glnHPQ, кодирующему компоненты системы транспорта глутамина. Ген rhtA идентичен ORPl (ybiF ген, номера нуклеотидов с 764 по 1651, GenBank accession number AAA218541, gi:440181) и расположен между генами pexB и ompX. Последовательность, ответственная за экспрессию белка, кодируемого ORFl, была обозначена ген rhtA (rht: resistance to homoserine and threonine) (устойчивость к гомосерину и треонину). Также, мутация rhtA23 - это замена A-на-G в позиции -1 относительно старт-кодона ATG (ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A).

Нуклеотидная последовательность гена asd E.coli уже определена (номера нуклеотидов с 3572511 по 3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi:16131307), и может быть получена методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; ссылка на White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)), используя праймеры на основе нуклеотидной последовательности гена. Гены asd из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.

Также, нуклеотидная последовательность гена aspC E.coli уже определена (номера нуклеотидов с 983742 по 984932, GenBank accession NC_000913.1, gi:16128895), и может быть получена методом ПЦР. Гены aspC из других микроорганизмов могут быть получены подобным способом.

Бактерии, продуцирующие L-лизин

Примеры бактерий, продуцирующих L-лизин и относящихся к роду Escherichia включают мутантов, обладающих устойчивостью к аналогам L-лизина. Аналоги L-лизина подавляют рост бактерий, относящихся к роду Escherichia, но это подавление полностью или частично снижено, когда L-лизин также присутствует в среде. Примеры аналогов L-лизина включают, но не ограничены, оксализин, лизин гидроксамат, S-(2-аминоэтил)-L-цистеин (AEC), γ-метил лизин, α-хлоркапролактам и так далее. Мутанты, обладающие устойчивостью к этим аналогам лизина, могут быть получены путем подвержения бактерий рода Escherichia стандартной искусственной мутагенной обработке. Конкретные примеры штаммов бактерий, применяемых для продукции L-лизина, включают Escherichia coli AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; см патент США No. 4346170) и Escherichia coli VL611. У этих микроорганизмов снижена чувствительность к ингибированию аспартокиназы L-лизином по принципу обратной связи.

Штамм WC 196 может применяться как продуцирующие L-лизин бактерии вида Escherichia coli. Этот бактериальный штамм был выведен путем сообщения штамму W3110, происходящему из Escherichia coli K-12, свойства устойчивости к AEC. Полученный итоговый штамм был обозначен Escherichia coli AJ 13069 и был представлен к регистрации в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (currently National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 6 декабря 1994 и получил инвентарный номер FERM P- 14690. Затем он был конвертирован в международный депозит по условиям Будапештского соглашения 29 сентября 1995, и получил инвентарный номер FERM BP-5252 (патент США No. 5827698).

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-лизин, также включают штаммы, в которых повышена экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты, синтезирующих L-лизин. Примеры ферментов, вовлеченных в биосинтез L-лизина, включают, но не ограничены, дигидро дипиколинат синтазу (dapA), аспартокиназу (lysC), дигидро дипиколинат редуктазу (dapB), диамино пимелат декарбоксилазу (lysA), диамино пимелат дегидрогеназу (ddh) (патент США No. 6040160), фосфоенолпируват карбоксилазу (ppc), аспартат семиальдегид дегидрогеназу (asd) и аспартазу (aspA) (EP 1253195 A). Дополнительно, родительский штамм может иметь повышенную экспрессию гена, вовлеченного в энергетический обмен (cyo) (EP 1170376 A), гена, кодирующего никотинамид нуклеотид трансгидрогеназу (pntAB) (патент США No. 5830716), гена ybjE (WO 2005/073390), гена gdh (Gene23: 199-209(1983)), гена arcA (EP 1382686 A) или их комбинации.

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-лизин, также включают штаммы, имеющие сниженную либо элиминированную активность ферментов, катализирующих реакцию синтеза другого вещества, кроме L-лизина, при ответвлении в биосинтетическом пути метаболизма L-лизина. Примеры ферментов, катализирующих реакцию синтеза другого вещества, кроме L-лизина, при ответвлении в биосинтетическом пути метаболизма L-лизина, включают гомосерин дегидрогеназу (WO 95/23864), лизин декарбоксилазу (патент США No. 5827698) и декарбоксилирующую малатдегидрогеназу (WO 2005/010175).

У Escherichia coli лизин декарбоксилазы кодируются геном cadA (Genbank Accession No. NP_418555, SEQ ID NO: 5) и геном ldcC (Genbank Accession No. NP_414728, SEQ ID NO: 7) (WO 96/17930), следовательно, эти гены могут быть нарушены с целью повышения способности к продукции L-лизина. Молекулы ДНК, гомологичные, генам cadA и ldcC, могут применяться ввиду того, что они способны приводить к гомологичной рекомбинации с генами cadA и ldcC на хромосоме бактерии-хозяина. Например, молекула ДНК, гомологичная гену cadA, может гибридизоваться с комплементарной цепью SEQ ID NO: 5 в жестких условиях, а молекула ДНК, гомологичная гену ldcC, может гибридизоваться с комплементарной цепью SEQ ID NO: 7 в жестких условиях.

Бактерии, продуцирующие L-цистеин

Примеры родительских штаммов для производства L-цистеин-продуцирующих бактерий данного изобретения включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli JM 15, трансформированный разными аллелями cysE, кодирующих устойчивые к регуляции по принципу обратной связи серин ацетилтрансферазы (патент США No. 6218168, патентная заявка России 2003121601), E.coli W3110, у которого повышена экспрессия генов, кодирующих белки, участвующие в секреции токсичных веществ (патент США No. 5972663), штаммы E.coli со сниженной активностью цистеин десульфогидразы (JP11155571A2); E.coli W3110 с повышенной активностью положительного транскрипционного регулятора цистеинового регулона, кодируемого геном cysB (WO 0127307A1), и тому подобные.

Бактерии, продуцирующие L-лейцин

Примеры родительских штаммов для производства L-лейцин-продуцирующих бактерий данного изобретения включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы E.coli, устойчивые к лейцину (например, штамм 57 (VKPM B-7386, патент США No. 6124121)) или аналогам лейцина, включая β-2-тиенилаланин, 3-гидроксилейцин, 4-азалейцин, 5,5,5-трифторлейцин (JP 62-34397 B и JP 8-70879 A); штаммы E.coli, полученные по методикам генной инженерии (описаны в WO 96/06926); E.coli H-9068 (JP 8-70879 A) и подобные.

Бактерии данного изобретения могут быть улучшены путем повышения экспрессии одного или более генов, вовлеченных в биосинтез L-лейцина. Примеры этих генов включают таковые из оперона leuABCD, который предпочтительно содержит мутированный leuA ген, кодирующий изопропилмалат синтазу, устойчивую к регуляции L-лейцином по принципу обратной связи (патент США 6403342). В дополнение, бактерии данного изобретения могут быть улучшены путем повышения экспрессии одного или более генов, кодирующих белки, которые выводят L-аминокислоты из бактериальной клетки. Примеры таких генов включают гены b2682 и b2683 (ygaZH гены) (EP 1239041 A2).

Бактерии, продуцирующие L-гистидин

Примеры родительских штаммов для производства L-гистидин-продуцирующих бактерий данного изобретения включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli штамм 24 (VKPM B-5945, RU2003677); E.coli штамм 80 (VKPM B-7270, RU2119536); E.coli NRRL B-12116 - B12121 (патент США No. 4388405); E.coli H-9342 (FERM BP-6675) и H-9343 (FERM BP-6676) (патент США No. 6344347); E.coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087); E.coli AI80/pFM201 (патент США No. 6258554) и подобные.

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-гистидин, также включают штаммы, в которых повышена экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-гистидина. Примеры этих ферментов биосинтеза L-гистидина включают АТФ фосфорибозилтрансферазу (hisG), фосфорибозил АМФ циклогидролазу (hisl), фосфорибозил-АТФ пирофосфогидролазу (hisIE), фосфорибозилформимино-5-аминоимидазол карбоксамид риботид изомеразу (hisA), амидотрансферазу (hisH), гистидинол фосфат аминотрансферазу (hisC), гистидинолфосфатазу (hisB), гистидинолдегидрогеназу (hisD) и так далее.

Известно, что гены, кодирующие ферменты биосинтеза L-гистидина (hisG, hisBHAFI) ингибируются L-гистидином, и, следовательно, L-гистидин-продуцирующая способность также может быть эффективно повышена введением мутации в АТФ фосфорибозилтрансферазу (hisG), обеспечивающей устойчивость к ингибированию по принципу обратной связи (патенты РФ №№.2003677 и 2119536).

Конкретные примеры штаммов, обладающих способностью к продукции L-гистидина, включают E.coli FERM-P 5038 и 5048, которые были трансформированы вектором, несущим кодирующую ДНК для фермента биосинтеза L-гистидина (JP 56-005099 A), штаммы E.coli, трансформированные rht, геном для экспорта аминокислот (EP 1016710 A), штамм E.coli 80, обеспеченный сульфагуанидином, DL-1,2,4-триазол-3-аланином, и устойчивостью к стрептомицину (VKPM B-7270, патент РФ No. 2119536) и так далее.

Бактерии, продуцирующие L-глутаминовую кислоту

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli VL334thrC+ (EP 1172433). E.coli VL334 (VKPM B-1641) являются ауксотрофами по L-изолейцину и L-треонину, и мутированы по генам thrC и ilvA (патент США No. 4278765). Аллель дикого типа гена thrC был передан неспецифической трансдукцией с применением бактериофага P1, растущем на штамме дикого типа E.coli K12 (VKPM B-7). В результате, был получен ауксотрофный по L-изолейцину штамм VL334thrC+ (VKPM B-8961).

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, включают (но не ограничены ими) штаммы, в которых повышена экспрессия одного или более генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Примеры ферментов биосинтеза L-глутаминовой кислоты включают глутаматдегидрогеназу (gdhA), глутаминсинтазу (glnA), глутаматсинтазу (gltAB), изоцитратдегидрогеназу (icdA), аконитатгидратазу (acnA, acnB), цитратсинтазу (gltA), фосфоенолпируват карбоксилазу (ppc), пируватдегидрогеназу (aceEF, lpdA), пируваткиназу (pykA, pykF), фосфоенолпируват синтазу (ppsA), енолазу (eno), фосфоглицеромутазу (pgmA), фосфоглицерат киназу (pgk), глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (gapA), триозо фосфат изомеразу (tpiA), фруктозобифосфат альдолазу (fbp), фосфофруктокиназу (pfkA, pfkB) и глюкозофосфат изомеразу (pgi).

Примеры штаммов, модифицированных так, что повышена экспрессия генов цитрат синтазы, фосфоенолпируват карбоксилазы и/или глутамат дегидрогеназы, включают таковые, раскрытые в EP 1078989 A, EP 955368 A и EP 952221 A.

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, также включают штаммы, имеющие сниженную либо элиминированную активность ферментов, катализирующих реакцию синтеза другого вещества, кроме L-глутаминовой кислоты, при ответвлении в биосинтетическом пути метаболизма L-глутаминовой кислоты. Примеры подобных ферментов включают изоцитрат лиазу, α-кетоглутарат дегидрогеназу, фосфотрансацетилазу, ацетат киназу, синтазу ацетогидроксикислот, ацетолактат синтазу, формат ацетилтрансферазу, лактат дегидрогеназу и глутамат декарбоксилазу. Бактерии, принадлежащие роду Escherichia, дефицитные по активности α-кетоглутарат дегидрогеназы, либо имеющие сниженную активность α-кетоглутарат дегидрогеназы, и способы их получения описаны в патент США №№5378616 и 5573945.

Конкретнее, эти штаммы включают следующие:

E.coli W3110sucA::Kmr

E.coli AJ12624 (FERM BP-3853)

E.coli AJ12628 (FERM BP-3854)

E.coli AJ12949 (FERM BP-4881)

E.coli W3110sucA::Kmr получен при нарушении гена α-кетоглутарат дегидрогеназы (далее в этом тексте называемый "ген sucA") в E.coli W3110. Этот штамм полностью дефицитен по α-кетоглутарат дегидрогеназе.

Другие примеры родительских штаммов для производства бактерий, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, включают таковые, принадлежащие к роду Escherichia, и обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты. Эти штаммы также могут быть дефицитны по активности α-кетоглутарат дегидрогеназы и включают, к примеру, E.coli AJ13199 (FERM BP-5807) (патент США No. 5908768), FERM P-12379, у которого дополнительно снижена интенсивность разложения L-глутаминовой кислоты (патент США №5393671); AJ13138 (FERM BP-5565) (патент США No. 6,110,714) и подобные.

Примеры бактерий, продуцирующих L-глутаминовую кислоту, включают мутантные штаммы, относящиеся к роду Pantoea, дефицитные по активности α-кетоглутарат дегидрогеназы, либо имеющие сниженную активность α-кетоглутарат дегидрогеназы, и могут быть получены, как описано выше. Такие штаммы включают Pantoea ananatis AJ13356 (патент США No. 6331419). Pantoea ananatis AJ13356 был представлен к регистрации в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (сейчас, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary, Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) 19 февраля 1998 под инвентарным номером FERM P-16645. Затем он был конвертирован в международный депозит по условиям Будапештского Соглашения 11 января 1999, и получил инвентарный номер FERM BP-6615.

Pantoea ananatis AJ13356 дефицитны по активности α-кетоглутарат дегидрогеназы, как результат нарушения гена субъединицы αKGDH-El (suсA). Вышеуказанный штамм был идентифицирован как Enterobacter agglomerans, когда он был выделен и представлен к регистрации как Enterobacter agglomerans AJ13356. Однако недавно он был переклассифицирован как Pantoea ananatis на основе нуклеотидной последовательности 16S рибосомальной РНК и так далее. Хотя AJ13356 был представлен к регистрации в вышеуказанный депозитарий как Enterobacter agglomerans, в целях описания изобретения, они описаны как Pantoea ananatis.

Бактерии, продуцирующие L-фенилаланин

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-фенилаланин, включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli AJ12739 (tyrA::Tnl0, tyrR) (VKPM B-8197); E.coli HW1089 (ATCC 55371), содержащий ген pheA34 (патент США №5354672); E.coli MWEC101-b (KR8903681); E.coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 и NRRL B-12147 (патент США №4407952). Также, в качестве родительского штамма могут применяться E.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB] (FERM BP-3566), E.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) и E.coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB], называемый AJ 12604 (FERM BP-3579), (EP 488424 B1). Кроме того могут применяться L-фенилаланин - продуцирующие бактерии, относящиеся к роду Escherichia, у которых повышена активность белка, кодируемого генами yedA или yddG (патентные заявки США 2003/0148473 A1 и 2003/0157667 A1).

Бактерии, продуцирующие L-триптофан

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-триптофан, включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) и JP6015/pMU91 (DSM10123), дефицитные по триптофан тРНК синтазе, кодируемой мутантным геном trpS (патент США No. 5756345); E.coli SV 164 (pGH5), имеющий аллель гена serА, кодирующий фосфоглицерат дегидрогеназу, устойчивую к ингибированию по принципу обратной связи серином, и аллель trpE, кодирующий антранилат синтазу, устойчивую к ингибированию по принципу обратной связи триптофаном (патент США №6180373); E.coli AGXl7 (pGX44) (NRRL B-12263) и AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264), дефицитные по ферменту триптофаназе (патент США №4371614); E.coli AGXl7/рGX50, pACKG4-pps, в котором повышена способность к продукции фосфоенолпирувата (WO9708333, патент США №6319696), и подобные. Кроме того, могут применяться бактерии, продуцирующие L-триптофан, относящиеся к роду Escherichia, у которых повышена активность белка, кодируемого генами yedA или yddG (патентные заявки США 2003/0148473 A1 и 2003/0157667 A1).

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L- триптофан, также включают штаммы, у которых повышена активность одного или более фермента из списка: антранилатсинтаза (trpE), фосфоглицерат дегидрогеназа (serA) и триптофансинтаза (trpAB). Антранилат синтаза и фосфоглицерат дегидрогеназа обе являются мишенью ингибирования по принципу обратной связи триптофаном или серином, так что мутации, снижающие чувствительность к регуляции по принципу обратной связи, могут быть введены в гены этих ферментов. Конкретные примеры штаммов, несущих подобные мутации, включают E.coli SV 164, у которого снижена чувствительность антранилат синтазы, и штамм, полученный трансформацией плазмидой pGH5 в E.coli SVl64 (WO 94/08031), содержащей ген serА, мутированный таким образом, что у кодируемой фосфоглицерат дегидрогеназы снижена чувствительность к регуляции по принципу обратной связи.

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-триптофан, также включают штаммы, трансформированные триптофановым опероном, который содержит ген, кодирующий нечувствительную антранилатсинтазу (JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, патент США №4371614). Более того, способность к продукции L-триптофана может быть сообщена путем увеличения экспрессии гена, кодирующего триптофан синтазу, внутри триптофанового оперона (trpBA). Триптофан синтаза состоит из двух субъединиц α и β, которые кодируются генами trpA и trpB, соответственно. Дополнительно, способность к продукции L-триптофана может быть усилена путем повышения экспрессии изоцитрат лиазного - малатсинтазного оперона (WO 2005/103275).

Бактерии, продуцирующие L-пролин

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-пролин, включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli 702ilvA (VKPM B-8012), который дефицитен по гену ilvA и способен продуцировать L-пролин (EP 1172433).

Бактерии данного изобретения могут быть улучшены путем повышения экспрессии одного или более гена, вовлеченного в биосинтез L-пролина. Примеры предпочтительных генов для L-пролин - продуцирующих бактерий включают ген proB, кодирующий глутамат киназу, нечувствительную к регуляции по принципу обратной связи L-пролином (DE Patent 3127361). Дополнительно, бактерии данного изобретения могут быть улучшены путем повышения экспрессии одного или более генов, кодирующих белки, участвующие в выводе L-аминокислот из бактериальной клетки. Такие гены включают b2682 и b2683 (ygaZH гены) (EP 1239041 A2).

Примеры бактерий, относящихся к роду Escherichia, которые способны продуцировать L-пролин, включают следующие штаммы E.coli: NRRL B-12403 и NRRL B-12404 (патент GB 2075056), VKPM B-8012 (патентная заявка России 2000124295), мутанты плазмид, описанные в патенте DE 3127361, мутанты плазмид, описанные Bloom F.R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34), и подобные.

Бактерии, продуцирующие L-аргинин

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-аргинин, включают (но не ограничены ими) штаммы, принадлежащие к роду Escherichia, такие как E.coli штамм 237 (VKPM B-7925) (патентная заявка США 2002/058315 A1) и его производные штаммы, несущие мутантную N-ацетилглутамат синтазу (патентная заявка России №2001112869), E.coli штамм 382 (VKPM B-7926) (EP 1170358 A1), аргинин - продуцирующий штамм, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутамат синтазу (EP1170361A1) и подобные.

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-аргинин, также включают штаммы, в которых повышена экспрессия одного или более гена, вовлеченного в биосинтез L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамил фосфат редуктазу (argC), орнитин ацетил трансферазу (argJ), N-ацетилглутамат киназу (argB), ацетилорнитин трансаминазу (argD), орнитин карбамоил трансферазу (argF), аргининсукцинат синтазу (argG), аргининсукцинат лиазу (argH), и карбамоилфосфат синтазу (carAB).

Бактерии, продуцирующие L-валин

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-валин, включают (но не ограничены ими) штаммы, модифицированные для гиперэкспрессии оперона ilvGMEDA (патент США No. 5998178). Желательно удалить область оперона ilvGMEDA, которая необходима для аттенюации, так чтобы экспрессия оперона не прерывалась уже произведенным L-валином. Кроме того, ген ilvA в опероне желательно нарушить, так чтобы снизилась активность треониндеаминазы. Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-валин, также включают мутанты по амино - ацил тРНК синтазе (патент США No. 5658766). Например, может применяться E.coli VL1970, который имеет мутацию в гене ileS, кодирующем изолейцин тРНК синтазу. E.coli VL 1970 был представлен к регистрации в Российской Национальной Коллекции Промышленных Микроорганизмов (VKPM) (Россия, 113545, Москва, Дорожный проезд, 1) 24 июня 1988 под инвентарным номером VKPM B-4411.

Кроме того, могут использоваться мутанты, которым для роста требуется липоевая кислота, и/или не имеющие H+-АТФазу (WO 96/06926).

Бактерии, продуцирующие L-изолейцин

Примеры родительских штаммов для производства бактерий данного изобретения, продуцирующих L-изолейцин, включают (но не ограничены ими) мутанты, обладающие устойчивостью к 6-диметиламинопурину (JP 5-304969 A), мутанты, обладающие устойчивостью к аналогам изолейцина, таким как тиаизолейцин и изолейцин гидроксамат, и мутанты, дополнительно обладающие устойчивостью к DL-этионину и/или аргинин гидроксамату (JP 5-130882 A). В дополнение, также могут применяться рекомбинантные штаммы, трансформированные генами, которые кодируют белки, вовлеченные в биосинтез L-изолейцин, такие как треонин деаминаза и ацетогидроксат синтаза (JP 2-458 A, FR 0356739, и патент США No. 5998178).

Повышение активности ACS

Бактерии данного изобретения могут быть получены путем модификации бактерий, обладающих способностью к продукции L-аминокислот, как описано выше, таким образом, что повышается активность ACS. Однако способность к продукции L-аминокислот может быть сообщена бактериям после модификации, увеличивающей активность ACS. Как описано ниже, активность ACS может быть усилена путем повышения экспрессии гена, кодирующего белок с активностью ACS, что достигается при повышении экспрессии эндогенного гена с помощью модификаций областей, регулирующих экспрессию, таких как промотор, либо при повышении экспрессии экзогенного гена с помощью введения плазмиды, содержащей ген, или подобное. Дополнительно, эти способы могут быть скомбинированы.

В настоящем изобретении термин «активность ACS» обозначает способность (EC 6.2.1.1) катализировать реакцию получения ацетил-CoA, пирофосфата и АМФ из уксусной кислоты, коэнзима А (CoA) и АТФ.

уксусная кислота + коэнзим А (CoA) + АТФ = ацетил-CoA + пирофосфат + АМФ

Также, было опубликовано, что ACS катализирует реакцию получения пропионил-CoA из пропионовой кислоты (Eur J Biochem 2002; 269(24); 6184-94), и было опубликовано, что ACS может функционировать в качестве 4-кумарат-CoA лигазы (Genome Biol 4(9); R54).

коэнзим А + пропионовая кислота + АТФ = пропионил-CoA + пирофосфат + АМФ

коэнзим А + 4-кумарат + АТФ = кумароил-CoA + пирофосфат + АМФ

Повышение активности ACS может быть подтверждено при измерении количества ацетогидроксамовой кислоты, получаемой преобразованием ацетил-CoA, произведенным in vitro с помощью вышеуказанной реакции (Meth. Enzymol. 1, 585-591).

Фраза «модифицировать так, что повысится активность ACS» включает случаи, когда увеличивается количество молекул ACS на клетку, либо повышается активность на молекулу ACS, по сравнению со штаммом дикого типа или немодифицированным штаммом. Активность ACS улучшается не менее, чем 150% на клетку, и предпочтительно не менее, чем 200% на клетку, еще более предпочтительно не менее, чем 300% на клетку, по сравнению со штаммом дикого типа или немодифицированным штаммом. Примеры штамма дикого типа, принадлежащего к семейству Enterobacteriaceae, которые могут применяться в качестве контроля, включают штамм Escherichia coli MG1655 (ATCC No. 47076), штамм W3110 (ATCC No. 27325) и штамм Pantoea ananatis AJ13335 (FERM BP-6615).

Активность ACS может быть повышена путем увеличения экспрессии гена, кодирующего белок с активностью ACS (ген acs). Повышенная экспрессия по сравнению со штаммом дикого типа или немодифицированным штаммом может быть подтверждена сравнением уровня мРНК гена acs с таковой в штамме дикого типа или немодифицированном. Способы подтверждения экспрессии гена включают Нозерн-гибридизацию и РТ-ПЦР (Molecular cloning (Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor (USA), 2001)). Экспрессия может быть на любом уровне при условии, что она повышена по сравнению со штаммом дикого типа или немодифицированным штаммом, и, например, экспрессия предпочтительно повышена не менее чем в 1,5 раза, более предпочтительно повышена не менее чем в 2 раза, и еще более предпочтительно повышена не менее чем в 3 раза по сравнению со штаммом дикого типа или немодифицированным штаммом. Между тем, увеличение экспрессии гена acs может также быть подтверждено повышением уровня соответствующего белка по сравнению с таковым в штамме дикого типа или немодифицированном штамме, и уровень белка может детектироваться, например, Вестерн-блоттингом с использованием антител (Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001)).

Примеры гена acs включают ген acs из Escherichia coli. В данном изобретении, примеры гена acs Escherichia coli включают ген acs SEQ ID NO: 3 (комплементарная цепь, номера нуклеотидов 4283436...4285394, GenBank Accession No. NC_000913).

Примеры генов acs из других источников включают ген acs Yersinia pestis (комплементарная цепь, номера нуклеотидов 577565..579529, GenBank Accession No. NC_004088), ген acs Salmonella typhi (комплементарная цепь, номера нуклеотидов 120832...122790, GenBank Accession No. AL627282), ген acs Vibrio cholerae (комплементарная цепь, номера нуклеотидов 305121…307121, GenBank Accession No. NC_002505) и ген acs Salmonella typhimuriumi (комплементарная цепь, номера нуклеотидов 4513714…4515672, GenBank Accession No. NC_003197).

Дополнительно, гомологи гена acs могут быть получены клонированием, на основе гомологии с вышеперечисленными генами, из γ-протеобактерий, принадлежащих роду Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia, Yersinia или подобных; дифтериеподобных бактерий, таких как Corynebacterium glutamicum или Brevibacterium lactofermentum, бактерий рода Pseudomonas как Pseudomonas aeruginosa; бактерий рода Mycobacterium как Mycobacterium tuberculosis; или подобных. Гомологи могут быть амплифицированы с помощью ПЦР с использованием, например, синтетических олигонуклеотидов, указанных в SEQ ID №№: 1 и 2.

Гомологии последовательностей аминокислот и нуклеотидных последовательностей могут быть определены с применением алгоритма BLAST, разработанного Karlin и Altschul (Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993)) или алгоритма FASTA, разработанного Pearson (Methods Enzymol., 183, 63 (1990)). Программы, названные BLASTN и BLASTX, были разработаны на основе алгоритма BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Фраза «гомолог гена acs» подразумевает ген из других бактерий и природно либо искусственно мутированный ген, имеющий высокое структурное сходство с вышеуказанным геном acs и кодирующий белок с активностью ACS. «Гомологи гена acs» подразумевают гены, которые кодируют белки, имеющие гомологию с SEQ ID NO: 4 как минимум 80%, предпочтительно как минимум 90%, более предпочтительно 95%, особо предпочтительно как минимум 98%, и обладают активностью ACS. Активность ACS может быть подтверждена путем экспрессии гена в клетке-хозяине и измерения активности ACS.

Тем временем, ген acs не является исключительно геном дикого типа и может быть мутантным или искусственно модифицированным геном, кодирующим белок с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4, которая может содержать замены, делеции, инсерции или одну или несколько дополнительных аминокислот в одной или множестве позиций, при условии, что сохранена активность ACS. В данном изобретении, хотя и в зависимости от позиции в третичной структуре белка и типа аминокислотного остатка, термин «одна или несколько», как правило, обозначает от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 10 и еще более предпочтительно от 1 до 5 аминокислот. Вышеупомянутые замены предпочтительно являются консервативными заменами, и примеры консервативных замен включают замены среди ароматических аминокислот, такие как между Phe, Trp и Tyr; замены среди гидрофобных аминокислот, такие как между Leu, Ile и Val; замены среди полярных аминокислот, такие как между Gln и Asn; замены среди основных аминокислот, такие как между Lys, Arg и His; замены среди кислых аминокислот, такие как между Asp и Glu; замены среди аминокислот, имеющих гидроксильную группу, такие как между Ser и Thr. Конкретные примеры консервативных замен включают замену Ser или Thr на Ala; замену Gln, His или Lys на Arg,; замену Glu, Gln, Lys, His или Asp на Asn; замену Asn, Glu или Gln на Asp; замену Ser или Ala на Cys; замену Asn, Glu, Lys, His, Asp или Arg на Gln; замену Gly, Asn, Gln, Lys или Asp на Glu; замену Pro на Gly; замену Asn, Lys, Gln, Arg или Tyr на His; замену Leu, Met, Val или Phe на Ile; замену Ile, Met, Val или Phe на Leu; замену Asn, Glu, Gln, His или Arg на Lys; замену Ile, Leu, Val или Phe на Met; замену Trp, Tyr, Met, Ile или Leu на Phe; замену Thr или Ala на Ser; замену Ser или Ala на Thr; замену Phe или Tyr на Trp; замену His, Phe или Trp на Tyr; и замену Met, Ile или Leu на Val. Между тем, вышеупомянутые аминокислотные замены, делеции, инсерции, достройки или инверсии могут быть природного происхождения (мутант или вариант), возникшими вследствие индивидуальных различий, различий между типами, и других подобных различий у бактерий, имеющих ген acs.

При этом ген acs может представлять собой ДНК, которая гибридизуется с последовательностью, комплементарной SEQ ID NO: 3, или зондом, который может быть приготовлен из данной последовательности, в жестких условиях, при условии, что ген будет кодировать белок, обладающий активностью ACS. В данном изобретении термин «жесткие условия» соотносится с условиями, при которых формируется так называемый специфический гибрид, и не формируется неспецифический гибрид. Затруднительно четко обозначить эти условия в числовых величинах, и примеры включают условия, при которых друг с другом гибридизуются ДНК, имеющие гомологию как минимум 80%, предпочтительно минимум 90%, более предпочтительно минимум 95%, особенно предпочтительно минимум 98%, тогда как ДНК, имеющие гомологию менее 80%, друг с другом не гибридизуются; и конкретные примеры таких условий включают отмывку в обычной Саузерн - гибридизации, то есть отмывку при солевой концентрации 1 × SSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1 × SSC, 0,1% SDS, при 60°C, предпочтительно при 68°C, однократную, предпочтительно двух- или трехкратную.

Экспрессия вышеобозначенного гена acs может быть повышена, например, путем увеличения числа копий гена на клетку с применением методик генной рекомбинации. К примеру, фрагмент ДНК, содержащий ген, лигируется с вектором, который функционален в бактерии-хозяине, предпочтительно мультикопийным вектором, чтобы таким образом приготовить рекомбинантную ДНК, и эта рекомбинантная ДНК используется для трансформации бактерий.

В случае использования гена acs из Escherichia coli, ген acs может быть получен методом ПЦР (полимеразная цепная реакция; White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)) с применением праймеров на основе нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, например, праймеры SEQ ID NOS: 1 и 2 и хромосомной ДНК Escherichia coli в качестве матрицы. Ген acs из различных бактерий также может быть получен с помощью ПЦР с хромосомной ДНК или библиотеки геномной ДНК выбранной бактерии, в качестве праймеров готовятся олигонуклеотиды на основе известной последовательности гена acs выбранной бактерии, либо гена acs другой разновидности бактерий, либо аминокислотной последовательности белка ACS. Ген acs также может быть получен из различных бактерий с помощью гибридизации с использованием олигонуклеотидов, приготовленных на основе последовательности, в качестве пробы. Хромосомная ДНК может быть получена из бактерий, служащих ДНК-донорами, согласно методу Saito и Miura (Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Experiment Manual for Biotechnology, edited by The Society for Biotechnology, Japan, p97-98, Baifukan Co., Ltd., 1992), или подобному.

При этом рекомбинантная ДНК готовится лигированием гена acs, амплифицированного с помощью ПЦР, к вектора ДНК вектора, способного функционировать в бактерии-хозяине. Примеры векторов, пригодных к функционированию в бактерии-хозяине, включают векторы, которые способны автономно реплицироваться в бактерии-хозяине.

Примеры векторов, которые способны автономно реплицироваться в Escherichia coli, включают pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184 (pHSG и pACYC доступны от Takara Bio Inc.), RSF1010 (Gene vol. 75(2), p271-288, 1989), pBR322, pMW219, pMW119 (pMW доступен от Nippon Gene Co., Ltd.), pSTV28 и pSTV29 (Takara Bio Inc.). Также могут применяться векторы на основе фаговой ДНК.

Чтобы лигировать ген к вышеупомянутому вектору, вектор расщепляется ферментами рестрикции, соответствующими для сайтов распознавания на концах фрагмента, содержащего ген acs. Лигирование обычно проводится с использованием лигазы, как Т4 ДНК лигаза. Методы расщепления и лигирования ДНК, получения хромосомной ДНК, получения плазмидной ДНК, трансформации, ПЦР, дизайн олигонуклеотидов, которые будут использоваться в качестве праймеров, хорошо известны специалистам, квалифицированным в данной области. Эти методы описаны в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition”, Cold Sprig Harbor Laboratory Press, (1989), и подобных изданиях.

Приготовленная таким образом рекомбинантная ДНК вводится в бактерии с помощью стандартных методов трансформации, таких как электропорация (Canadian Journal of Microbiology, 43. 197 (1997)). Также возможно повысить проницаемость для ДНК путем обработки клеток хлоридом кальция, как было опубликовано относительно Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970), и вводить ДНК в компетентные клетки на стадии пролиферации, что было опубликовано относительно Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G.A and Young, F.E, Gene, 1, 153 (1977)).

Число копий гена acs также может быть увеличено путем введения множества копий гена в хромосомную ДНК бактерии-хозяина. Введение множества копий гена в хромосомную ДНК бактерии-хозяина может быть достигнуто при гомологичной рекомбинации, используя целевую последовательность, которая присутствует в хромосомной ДНК во множестве копий. Это может быть повторяющаяся ДНК или инвертированные повторы, присутствующие на концах транспозирующихся элементов. Альтернативно, как раскрыто в JP 2-109985 A, множественные копии гена acs могут быть введены в хромосомную ДНК путем вставки гена в транспозон, и их переноса так, что множественные копии гена встраиваются в хромосомную ДНК. Встраивание гена в хромосому может быть подтверждено с помощью Саузерн-гибридизации с применением сегмента гена в качестве зонда.

Кроме того, экспрессия гена может быть повышена, как описано в WO 00/18935, WO 98/04715, путем замещения последовательности, регулирующей экспрессию, такой как природный промотор, более сильным промотором, в независимости от того, находится ген на плазмиде или в хромосоме; путем увеличения копий регуляторного элемента, способного повышать экспрессию гена; или удалением или подавлением регуляторного элемента, снижающего экспрессию гена acs. Примеры известных сильных промоторов включают промотор lac, trp промотор, trc промотор, tac промотор, PR промотор фага лямбда, PL промотор и tet промотор.

Способ оценить силу промотора и примеры сильных промоторов описаны в Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128) или подобных изданиях. В дополнение, известно, что спейсерная область между сайтом связывания рибосомы (RBS) и кодоном начала трансляции, особенно несколько нуклеотидов прямо перед инициирующим кодоном, оказывает большое влияние на эффективность трансляции. Следовательно, эта последовательность также может быть модифицирована.

Дополнительно, с целью повысить активность белка, кодируемого геном acsA, в ген могут быть введены мутации, повышающие активность ACS. Примеры подобных мутаций включают мутации в промоторной области, повышающие уровень транскрипции гена acs, и мутации кодирующей области, повышающие специфические активности белка ACS.

Способ производства L-аминокислот

Способ производства L-аминокислот данного изобретения охватывает культивирование бактерий данного изобретения в среде с целью продукции и накопления L-аминокислот в среде или бактериальных клетках, и выделение L-аминокислот из среды или бактериальных клеток.

Использоваться могут стандартные среды, которые обычно применяются для бактериальной ферментативной продукции L-аминокислот. А именно, может использоваться обычная среда, содержащая источники углерода, азота, неорганических ионов и, если необходимо, другие органические компоненты. В данном изобретении примеры источников углерода включают сахара, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, галактоза, фруктоза и гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин и сорбитол; органические кислоты, такие как фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота. Примеры источников азота включают неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония; органический азот в виде гидролизата сои; газообразный аммиак; и водный раствор аммиака. Предпочтительно, в среде в соответствующих количествах содержатся ауксотрофные вещества в качестве органических индикаторных питательных элементов, такие как витамин B1 и L-гомосерин, дрожжевой экстракт и подобные. Помимо таких веществ, при необходимости, могут быть добавлены в малых количествах фосфат калия, сульфат магния, ионы железа, ионы марганца или подобные. Среда, применяемая в данном изобретении, может быть природного происхождения либо синтетической, при условии, что она содержит источники углерода, азота, неорганических ионов и, если необходимо, другие органические питательные элементы.

Предпочтительно, культивирование проводится в аэробных условиях от 1 до 7 дней при температуре от 24°C до 37°C и pH от 5 до 9. pH может регулироваться неорганическими или органическими кислыми или щелочными веществами, газообразным аммиаком или подобным. L-аминокислоты могут быть получены из ферментативной жидкости общепринятыми способами, например, на ионообменной смоле, осаждением и другими известными методами. Если L-аминокислоты накапливаются внутри бактериальных клеток, L-аминокислоты могут быть выделены, к примеру, разрушением бактериальных клеток ультразвуком или подобным способом, с целью высвобождения L-аминокислот в надосадочную фракцию, и затем бактериальные клетки удаляются центрифугированием, с последующей очисткой финальной надосадочной фракции на ионообменной смоле, или подобным способом.

При производстве основных L-аминокислот ферментация может проводиться при контроле pH среды во время культивирования (рН 6,5-9,0) и контроле pH среды по завершении культивирования (рН 7,2-9,0), равно как при контроле за давлением в ферментационном чане во время ферментации, оно должно быть положительным. Альтернативно, в среду может быть добавлен углекислый газ либо смесь газов, содержащая углекислый газ, так, чтобы бикарбонат ионы и/или карбонат ионы присутствовали в культуральной среде в количестве минимум 2 г/л во время культивирования. Эти ионы функционируют как противоионы к катионам основных L-аминокислот, и целевые L-аминокислоты могут быть выделены (EP 1182261, WO 2006/038695).

ПРИМЕРЫ

Далее в этом документе, данное изобретение будет описано более подробно, с отсылкой на следующие не ограничивающие примеры.

Пример 1

Конструкция плазмиды для амплификации гена acs

Чтобы оценить эффект амплификации гена acs на продукцию L-лизина, был сконструирован плазмидный вектор для амплификации гена acs. Полная хромосомная нуклеотидная последовательность Escherichia coli (Escherichia coli K-12 штамм) уже была раскрыта (Science, 277, 1453-1474 (1997)). Основываясь на нуклеотидной последовательности гена acs, раскрытой в этом документе, в качестве 5'-праймера был использован олигонуклеотид SEQ ID NO: 2, который содержит сайт рестрикции для SalI, присоединенный к последовательности, комплементарной нуклеотидам с 4285765 по 4285784 последовательности GenBank ACCESSION No. NC_000913, и в качестве 3'-праймера был использован олигонуклеотид SEQ ID NO: 1, который содержит сайт рестрикции BamHI, присоединенный к последовательности с 4283415 по 4283435 нуклеотида No. NC_000913. Эти праймеры были использованы для проведения ПЦР, где в качестве матрицы применялась хромосомная ДНК штамма Escherichia coli MG1655.

С целью получения плазмиды для амплификации гена acs (pMWacs), амплифицированный ген acs был очищен и расщеплен SalI и BamHI, и затем лигирован в расщепленный SalI и BamHI вектор pMW119 (Takara Bio).

Пример 2

Создание штамма с нарушенными генами, кодирующими лизин-декарбоксилазу (cadA и ldcC)

Был получен штамм, не производящий лизин декарбоксилазу. Лизин декарбоксилазы кодируется генами cadA (Genbank Accession No. NP_418555, SEQ ID NO: 5) и ldcC (Genbank Accession No. NP_414728, SEQ ID NO: 7) (WO 96/17930). В качестве родительского штамма использовался штамм Escherichia coli WC196 (FERM BP-5252) (WO 96/17930).

Гены cadA и ldcC были нарушены по способу Datsenko и Wanner, называемому "Red-обусловленная интеграция" (“Red-driven integration”) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645), и с помощью системы эксцизии фага λ (J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3 Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.). "Red-обусловленная интеграция" дает возможность создания штамма с нарушенным геном в один шаг с применением ПЦР-продукта, полученного с использованием в качестве праймеров синтетических олигонуклеотидов, содержащих части целевого гена на 5'-концах и части гена устойчивости к антибиотику на 3'-концах. Комбинация с системой удаления фага λ позволяет удалить ген устойчивости к антибиотику, который был встроен в штамм с нарушенным целевым геном (WO 2005/010175).

Нарушение гена cadA

Плазмида pMW118-attL-Cm-attR (WO 2005/010175) использовалась в качестве матрицы для ПЦР. pMW118-attL-Cm-attR была получена инсерцией генов attL и attR, которые являются сайтами интеграции фага λ, и гена cat, являющегося геном устойчивости к антибиотику, в pMW118 (Takara Bio Inc.). Гены расположены в следующем порядке: attL-cat-attR.

ПЦР был проведен с применением в качестве праймеров синтетических олигонуклеотидов, показанных в SEQ ID №№:9 и 10, которые имеют последовательности, соответствующие attL и attR на 3'-концах и последовательности, соответствующие части целевого гена cadA на 5'-концах.

Амплифицированный ПЦР - продукт был очищен из агарозного геля и введен в штамм Escherichia coli WC196 с помощью электропорации. Этот штамм несет pKD46, имеющую температуро - зависимую способность к репликации. pKD46 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645) содержит фрагмент ДНК длиной в 2154 нуклеотидов, происходящий из фага λ и включающий гены, кодирующие рекомбиназу Red (гены γ, β и exo) системы Red гомологичной рекомбинации фага λ, которая контролируется индуцируемым арабинозой промотором ParaB (GenBank/EMBL Accession No. J02459, номера нуклеотидов с 31088 по 33241). pKD46 необходима для интеграции ПЦР - продукта в хромосому штамма WC196.

Компетентные клетки для электропорации были приготовлены следующим образом. А именно, клетки штамма Escherichia coli WC196 с pKD46 культивировали в течение ночи при 30°C в среде LB, содержащей 100 мг/л ампициллина, и затем разводили 100-кратно 5 мл среды SOB (Molecular Cloning: Laboratory manual, 2nd edition, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) содержащей ампициллин (20 мг/л) и L-арабинозу (1 mM). Разведенные клетки наращивались в аэробных условиях при 30°C до OD600 около 0,6, затем 100-кратно концентрировали и трижды промывали 10% глицерином, так, что клетки стали способными к электропорации. Электропорацию проводили с применением 70 мкл компетентных клеток и примерно 100 нг ПЦР-продукта. После электропорации, к клеткам добавляли 1 мл среды SOC (Molecular Cloning: Laboratory manual, 2nd edition, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), и клетки культивировали в течение 2,5 часов при 37°C, затем высевали на культуральные чашки с L-агаром, содержащим Cm (хлорамфеникол) (25 mg/L), чтобы таким образом отобрать Cm-устойчивые рекомбинантные штаммы. В дальнейшем, с целью удалить плазмиду pKD46, клетки дважды пересевали на L-агар, содержащий Cm, и культивировали при 42°C; полученные колонии анализировали на устойчивость к ампициллину, чтобы таким способом получить ампициллин - чувствительные штаммы, из которых удалена pKD46.

Делеция гена cadA в мутантном штамме, идентифицированном по гену устойчивости к хлорамфениколу, была подтверждена с помощью ПЦР. Штамм с нарушенным cadA был назван WC196ΔcadA::att-cat.

В дальнейшем была использована вспомогательная плазмида pMW-intxis-ts (WO 2005/010175), чтобы удалить ген att-cat, который был введен в ген cadA. Плазмида pMW-intxis-ts несет ген, кодирующий интегразу (Int) фага λ, и ген, кодирующий эксцизионазу (Xis), и обладает температурочувствительной способностью к репликации.

Компетентные клетки штамма WC196ΔcadA::att-cat были приготовлены стандартным способом, и затем трансформированы вспомогательной плазмидой pMW-intxis-ts, и затем культивировались при 30°C на культуральных чашках с L-агаром, содержащим 50 мг/л ампициллина для того, чтобы отобрать штаммы, устойчивые к ампициллину.

В дальнейшем, для удаления плазмиды pMW-intxis-ts, клетки дважды пересевали на L-агар, и культивировали при 42°C; полученные колонии анализировали на устойчивость к ампициллину и хлорамфениколу для того, чтобы получить ампициллин - и хлорамфеникол - чувствительные штаммы, в которых ген cadA нарушен, а att-cat и pMW-intxis-ts удалены. Штамм был назван WC196ΔcadA.

Нарушение гена ldcC в штамме WC196ΔcadA

Ген ldcC в штамме WC196ΔcadA был нарушен тем же путем, как описано выше, с применением олигонуклеотидов SEQ ID №№:11 и 12 в качестве праймеров. Этим способом был получен штамм WC196ΔcadAΔldcC с нарушенными генами cadA и ldcC.

Эффект амплификации гена acs в L-лизин - продуцирующем штамме бактерий рода Escherichia

Введение плазмиды для продукции лизина в штамм WC196ΔcadAΔldcC

Штамм WC196ΔcadAΔldcC был трансформирован плазмидой для продукции лизина, называемой pCABD2 (WO 01/53459), которая несет ген dapA, ген dapB, ген lysC и ген ddh, и тем самым получен штамм WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2.

Штамм WC196ΔcadAΔldc/pCABD2 был трансформирован плазмидой для амплификации гена acs (pMWacs), которая была сконструирована в Примере 1, и контрольной плазмидой (pMW119) (Takara Bio Inc), и отобраны штаммы, устойчивые к стрептомицину и ампициллину. Введение плазмид было подтверждено, и штаммы с pMWacs и pMW119 были названы WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-acs штамм и WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-119 штамм, соответственно.

Штаммы WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-acs и WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-119 культивировали при 37°C в L-среде, содержащей 50 мг/л ампициллина и 20 мг/л стрептомицина, до конечной оптической плотности OD600 около 0,6, и затем в среды были добавлены равные объемы 40% раствора глицерина, с последующим перемешиванием. Затем, полученная суспензия была разделена на соответствующие объемы и хранилась при -80°C, что использовалось как глицериновая маточная культура.

Глицериновые маточные культуры штаммов были разморожены, и 100 мкл каждого штамма были равномерно высеяны на чашки с L-агаром, содержащим 50 мг/л ампициллина и 20 мг/л стрептомицина, и культивировались при 37°C в течение 24 часов. Примерно одна восьмая клеток каждого штамма была снята с чашки и перенесена в 20 мл ферментационной среды (среда для продукции L-лизина для бактерий рода Escherichia), содержащей 50 мг/л ампициллина и 20 мг/л стрептомицина, в колбе Сакагучи на 500 мл, и культивировали при 37°C в течение 19 часов с применением вибрационного перемешивающего аппарата. Количество накопленного в среде L-лизина было определено с применением Biotech Analyzer AS210 (Sakura Seiki Co,. Ltd.).

[среда для продукции L-лизина для бактерий рода Escherichia]

Глюкоза 40 г/л Сульфат аммония 24 г/л Дигидрофосфат калия 1,0 г/л Гептагидрат сульфата магния 1,0 г/л Гептагидрат сульфата железа 0,01 г/л Гептагидрат сульфата марганца 0,01 г/л Дрожжевой экстракт 2,0 г/л

Карбонат кальция (принятой степени очистки) 30 г/L (стерилизован отдельно)

Среда была уравновешена до pH 7,0 гидроксидом калия и стерилизована обработкой водяным паром при 115°C в течение 10 минут.

Глюкоза и гептагидрат сульфата марганца были стерилизованы отдельно.

Карбонат кальция (принятой степени очистки) был стерилизован отдельно нагреванием при 180°C в течение 2 часов.

Таблица 1 показывает количества присутствующего L-лизина через 19 часов. В случае штамма WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-acs, количество L-лизина было повышенным по сравнению с таковым в штамме WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-119, который не содержит ген acs. Эти данные демонстрируют, что способность к продукции L-лизина усиливается при повышении экспрессии гена acs.

Таблица 1 Штамм Накопление
L-лизина (г/л)
Выход
L-лизина (%)
WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-119 6,4 42,9 WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-acs 6,7 45,0

ПРИМЕНИМОСТЬ В ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ

Бактерии данного изобретения предоставляют возможность эффективной ферментативной продукции основных L-аминокислот, таких как L-лизин, L-орнитин, L-аргинин, L-гистидин и L-цитруллин; алифатических L-аминокислот, как L-изолейцин, L-аланин, L-валин, L-лейцин и L-глицин; гидрокси моноаминокарбоновых кислот, таких как L-треонин и L-серин; циклических L-аминокислот, как L-пролин; ароматических L-аминокислот, таких как L-фенилаланин, L-тирозин, L-триптофан; серосодержащих L-аминокислот, таких как L-цистеин, L-цистин и L-метионин; кислых L-аминокислот, таких как L-глутаминовая кислота, L-аспарагиновая кислота, L-глутамин, L-аспарагин.

Похожие патенты RU2422530C2

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ ESCHERICHIA 2005
  • Рыбак Константин Вячеславович
  • Сливинская Екатерина Александровна
  • Козлов Юрий Иванович
  • Сузуки Томоко
RU2311454C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН tolC 2007
  • Самсонов Валерий Васильевич
  • Каплан Алла Марковна
  • Ахвердян Валерий Завенович
  • Ворошилова Эльвира Борисовна
  • Гусятинер Михаил Маркович
RU2366703C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-треонина С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia 2006
  • Рыбак Константин Вячеславович
  • Сливинская Екатерина Александровна
  • Шереметьева Марина Евгеньевна
  • Козлов Юрий Иванович
RU2351646C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ 2008
  • Нагаи Юри
  • Хаяси Казуюки
  • Уеда Такудзи
  • Усуда Йосихиро
  • Мацуи Казухико
RU2515044C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН bisC 2006
  • Филиппов Дмитрий Владимирович
  • Ворошилова Эльвира Борисовна
  • Леонова Татьяна Викторовна
  • Гусятинер Михаил Маркович
RU2337958C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН fdrA 2006
  • Филиппов Дмитрий Владимирович
  • Ворошилова Эльвира Борисовна
  • Леонова Татьяна Викторовна
  • Гусятинер Михаил Маркович
RU2337957C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН yrbG 2006
  • Филиппов Дмитрий Владимирович
  • Ворошилова Эльвира Борисовна
  • Гусятинер Михаил Маркович
RU2330881C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА ИЛИ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН aldH 2006
  • Филиппов Дмитрий Владимирович
  • Ворошилова Эльвира Борисовна
  • Леонова Татьяна Викторовна
  • Гусятинер Михаил Маркович
RU2330882C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН yahN 2007
  • Альтман Ирина Борисовна
  • Птицын Леонид Романович
RU2392322C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE 2007
  • Птицын Леонид Романович
  • Альтман Ирина Борисовна
  • Котлярова Вероника Александровна
  • Мохова Ольга Николаевна
  • Ямпольская Татьяна Абрамовна
  • Козлов Юрий Иванович
  • Терасита Масару
  • Усуда Йосихиро
  • Мацуи Казухико
RU2364628C2

Реферат патента 2011 года СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА L-АМИНОКИСЛОТ

Изобретение относится к биотехнологии. L-аминокислоту, такую как L-лизин, получают путем культивирования бактерий, относящихся к роду Escherichia, способных продуцировать L-лизин, и модифицированных для повышения ацетил-СоА синтазной активности. Изобретение позволяет получать L-лизин с высокой степенью эффективности. 2 з.п. ф-лы, 1 табл.

Формула изобретения RU 2 422 530 C2

1. Способ получения L-лизина, включающий культивирование бактерии в среде и выделение L-лизина из среды или указанных бактерий, где указанные бактерии являются бактериями, относящимися к роду Escherichia, способны продуцировать L-лизин и модифицированы для повышения ацетил-СоА синтазной активности.

2. Способ по п.1, где активность ацетил-СоА синтазы повышена способом, выбранным из группы, состоящей из:
a) увеличения числа копий гена acs, кодирующего ацетил-СоА синтазу, и
b) модификации последовательностей, регулирующих экспрессию указанного гена.

3. Способ по п.2, где указанный ген acs выбран из группы, состоящей из:
(a) ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, и
(b) ДНК, которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 3, или зондом, приготовленным из данной нуклеотидной последовательности, в жестких условиях; и где указанная ДНК кодирует белок с активностью ацетил-СоА синтазы.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2011 года RU2422530C2

WO 03008615 А2, 30.01.2003
EP 1510582 A1, 02.03.2005
LOKE H.K., BENNETT G.N, LINDAHL P.A
Active acetyl-CoA synthase from Clostridium thermoaceticum obtained by cloning and heterologous expression of acsAB in Escherichia coli // Proc
Natl
Acad
Science
ЩИТОВОЙ ДЛЯ ВОДОЕМОВ ЗАТВОР 1922
  • Гебель В.Г.
SU2000A1
RU 2003121600 A, 27.01.2005.

RU 2 422 530 C2

Авторы

Катаока Саори

Уеда Такудзи

Дзое Юдзи

Косеки Тие

Даты

2011-06-27Публикация

2007-03-30Подача