НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК В КРОВИ И ДРУГИХ БИОМАТЕРИАЛАХ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛАТЕНТНОЙ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ - ВИРУСА Torque teno virus СЕМЕЙСТВА Circoviridae МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2011 года по МПК C12Q1/68 C12N15/34 

1. Область техники

Изобретение относится к области молекулярно-генетической диагностики вирусов человека. Torque teno virus (TTV) впервые был обнаружен в 1997 году. Популяционные исследования выявили, что вирусный геном обладает крайне высокой вариабельностью - на данный момент выделены 5 групп, содержащих более 40 генотипов. Также показано, что вирус распространен как минимум среди 50% населения Земли. Выявлены ассоциации между наличием TTV и острыми респираторными заболеваниями, заболеваниями печени, астмой, ВИЧ/СПИД, однако точная функция и проявление вируса в организме человека пока не установлены.

Необходимость в тест-системе для TTV очевидна, так как литературные данные указывают на возможность его использования в качестве как минимум диагностического параметра при выявлении заболеваний, перечисленных выше.

2. Уровень техники

В последние годы разрабатываются различные методы молекулярно-генетической диагностики вирусов, а также оценки их вирусной нагрузки. Данные методы позволяют выявлять специфические последовательности ДНК, уникальные для определенного вируса. Таким образом, соответствующий вирус обнаруживается в биоматериале, и делается вывод о наличии инфицирования. Из уровня техники известны следующие аналоги данного изобретения:

2.1 Патент № WO 2008138619 «Определение новой последовательности олигонуклеотидов TTV для предупреждения, диагностики и лечения детской лейкемии»

Настоящее изобретение описывает специфичную перестройку нуклеиновой кислоты вируса TTV, а также последовательности праймеров и проб, с помощью которых можно амплифицировать и детектировать данную нуклеиновую кислоту. Кроме того, настоящее изобретение описывает полипептиды, закодированные нуклеиновой кислотой, а также описывает антитела, связывающие данные полипептиды. В конечном итоге, данное изобретение описывает методы применения полученной нуклеиновой кислоты для диагностики развития детской лейкемии, для диагностики других злокачественных новообразований, для диагностики аутоиммунных заболеваний, также для производства вакцины для предупреждения и лечения данных заболеваний.

2.2 Патент № WO 0185771 «Новый TTV-родственный вирус s-TTV»

Согласно последним данным родственный вирусу TTV вирус s-TTV может оказывать влияние на возникновение такого заболевания, как хронический гепатит; детектирование ДНК данного вируса необходимо. Исходя из этого, была клонирована ДНК вируса s-TTV, что сделало возможным анализировать s-TTV ДНК, s-TTV антиген и s-TTV-антитело. В результате стало возможным диагностировать s-TTV инфекцию или отслеживать процесс заражения. Таким образом, может быть изучена связь между s-TTV и человеческими заболеваниями, а методика, подтверждающая эту связь, может быть отработана на животных.

2.3 Патент US2001041331 «Методы определения вируса TTV»

Настоящее изобретение направлено на получение праймеров или проб, применяемых для определения вируса TTV в биологических образцах. Изобретение распространяется на методы, позволяющие использовать данные праймеры и пробы, а также на получение набора реагентов, содержащего эти олигомеры. Кроме того, данное изобретение направлено на использование нуклеотидных последовательностей вируса TTV в качестве векторов и в качестве маркеров для определения факта передачи вируса между организмами, а также путей передачи. Кроме того, данное изобретение направлено на методы определения инфекции TTV перед ксенотрансплантацией органов или тканей.

2.4 Патент №JP2000175700 «Определение вируса TTV с использованием метода ПЦР в реальном времени, праймер и проба, использованные при этом»

Предметом данного изобретения является создание новых олигонуклеотидных праймеров, прямого и обратного, используемых для определения вируса TTV с помощью метода ПЦР в реальном времени.

3. Раскрытие изобретения

Наиболее перспективным является использование в этих целях метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) - это высокоспецифичный и высокочувствительный метод выявления вирусной ДНК. Принцип ПЦР заключается в многократном копировании (амплификации) определенного фрагмента ДНК, являющегося маркерным для данного вируса. Реакция ПЦР осуществляется ферментом Taq-полимеразой, которая умеет удлинять олигонуклеотидные затравки (праймеры) до целого специфического продукта.

Основным достоинством метода ПЦР как молекулярно-биологического исследования является его чрезвычайно высокая чувствительность. Используемые в медицинской практике тест-системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаруживать патогенные для человека микроорганизмы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим) их выявление невозможно. Система детекции результатов ПЦР в режиме «реального времени», наряду с ответом на вопрос о наличии или отсутствии в исследуемом образце ДНК инфекционного возбудителя, позволяет оценить его количество, что в ряде случаев позволяет уточнить диагноз и выбрать более адекватный метод лечения.

Работа над созданием олигонуклеотидов, которые используются в подобных наборах, строится обычно следующим образом.

1) С помощью открытых и коммерческих баз данных нуклеотидных последовательностей геномов вирусов либо в результате самостоятельного определения нуклеотидной последовательности изучаемого вируса выбирается участок генома, уникальный для данного вируса (или группы видов).

2) На основании выбранного участка генома с помощью специального программного обеспечения подбирается последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции (как правило, это 2 праймера и проба). На данном этапе работа заключается в создании выравнивания многих геномных последовательностей и выборе участка последовательности, где число мутаций соответсвует требуемому расположению праймеров.

Выравнивание геномных последовательностей означает сравнение последовательностей геномов многих организмов друг с другом, поиск уникальных для интересующего вируса участков генома, не имеющих аналогов у других вирусов.

Поиск соответствия между числом мутаций и расположением праймеров означает, что известные на данный момент мутации, возможные у данного вируса, не должны затрагивать выбранный для праймеров участок генома, так как замены в геномной последовательности (мутации) могут негативно сказаться на работе праймеров.

3) Изготовление праймеров заказывается в специальном сервисном центре.

4) С помощью практических экспериментов доказывается пригодность подобранных последовательностей для конкретных целей (например, для определения наличия/отсутствия данного вируса в биоматериале; подсчета количества ДНК данного вируса в биоматериале - вирусной нагрузки).

Предлагаемое изобретение позволяет обнаруживать ДНК вируса Torque teno virus всех известных генотипов, вызывающего латентную вирусную инфекцию. Аналогичные наборы, а также реакционные смеси, праймеры и способы обнаружения ДНК этого вируса неизвестны.

Техническим результатом, на достижение которого направлено предлагаемое изобретение, является достоверное обнаружение указанного вируса в биологическом материале (цельная кровь, плазма крови, образцы тканей).

Указанный результат достигается путем использования при постановке ПЦР набора синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК вируса Torque teno virus, вызывающего латентную вирусную инфекцию, включающего в себя праймеры:

5'-ССТ GCA CTT CCG ААТ GGC TGA GTT-3'

5'-СТТ GAC TGC GGT GTG ТАА ACT САС-3'

и пробу: 5'-FAM-CCT CCG GCA CCC GCC CTC GGG ACG-BHQ1-3',

где BHQ1 означает присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FAM - флуоресцентный краситель РАМ, присоединенный к нуклеотиду С на 5'-конце пробы.

Указанный набор синтетических олигонуклеотидов является составной частью набора следующих веществ:

1) Пробирки с реакционной смесью, запаянной парафином. В данную смесь входят указанные праймеры и проба, специфичные к участку ДНК Torque teno virus - так называемому консервативному домену, последовательность нуклеотидов которого среди разных генотипов TTV одинакова, смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов, реакционный буфер (80 мМ Tris-HCl (pH 8.6 при 25°С), 20 мМ (NH₄)₂SO₄, 3мМ MgCl₂).

И праймеры, и проба представляют собой синтетические олигонуклеотиды. Праймеры, специфичные к маркерному участку генома вируса, вводятся в реакцию непосредственно для амплификации (наработки) продукта. Проба (тоже специфичная к данному участку ДНК) имеет в своем составе флуоресцентную метку, интенсивность флуоресценции которой свидетельствует о количестве образующегося продукта, что, в свою очередь, зависит от эффективности работы праймеров, количества стартового материала и других параметров реакции. Праймеры в реакции выступают в качестве компонентов, обеспечивающих прохождение реакции, а проба - в качестве компонента, обеспечивающего наблюдение за ходом реакции.

2) Раствор фермента Taq-полимеразы.

3) Положительный контрольный образец (ПК) - ДНК рекомбинантной плазмиды с клонированным фрагментом консервативного участка генома TTV. Положительный контрольный образец вносится в отдельную пробирку с реакционной смесью. Результат амплификации ПК демонстрирует эталонное положительное прохождение реакции, с которым сравниваются результаты амплификации исследуемых образцов.

4) Отрицательный контрольный образец - образец, который вводится в эксперимент для контроля возможного загрязнения реактивов продуктами ранее проведенных реакций. Положительный результат в этом образце свидетельствует о необходимости заменить реагенты и переставить эксперимент.

4. Осуществление изобретения

1) Биологический материал (цельная кровь, плазма крови, образцы тканей) перед проведением ПЦР с помощью предлагаемого набора реагентов проводится через процедуру пробоподготовки с использованием другого набора (набор реагентов для пробоподготовки не является предметом данного патента); в ходе этой процедуры из биологического материала выделяется ДНК, которую, в свою очередь, используют для ПЦР;

2) Необходимое количество пробирок с подготовленной реакционной смесью, содержащей специфические синтетические олигонуклеотидные праймеры и пробу, маркируется согласно количеству анализируемых образцов;

3) Во все промаркированные пробирки, не повреждая слой парафина, добавляется раствор Taq-полимеразы;

4) Во все промаркированные пробирки (кроме пробирок К-(отрицательный контрольный образец), К+(положительный контрольный образец)) вносится выделенная согласно п.1) ДНК;

5) В пробирку, маркированную К-, вносится отрицательный контрольный образец;

6) В пробирку, маркированную К+, вносится положительный контрольный образец;

7) Все пробирки устанавливаются в блок термоциклера, амплификация проводится согласно режимам, прописанным в инструкции к набору. Детекция результатов осуществляется детектирующим термоциклером автоматически во время амплификации (устройства: детектирующие термоциклеры ДТ-322, ДТ-96 (ЗАО "НПФ ДНК-Технология").

Анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору.

В случае образования специфического продукта ДНК проба разрушается, что ведет к возрастанию уровня флуоресценции, который фиксируется специальными приборами - детектирующими термоциклерами.

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Раскрыты синтетические олигонуклеотиды для выявления ДНК вируса Torque teno virus всех известных генотипов. Праймеры объединены в набор для выявления ДНК в крови и других биоматериалах возбудителя латентной вирусной инфекции - вируса Torque teno virus семейства Circoviridae методом полимеразной цепной реакции. Изобретение позволяет достоверно проводить обнаружение указанного вируса в биологическом материале.

Набор синтетических олигонуклеотидов для выявления ДНК в крови и других биоматериалах возбудителя латентной вирусной инфекции - вируса Torque teno virus семейства Circoviridae методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что включает в себя праймеры:
5'-ССТ GCA CTT CCG ААТ GGC TGA GTT-3'
5'-СТТ GAC TGC GGT GTG ТАА ACT САС-3'
и пробу: 5'-FAM-CCT CCG GCA CCC GCC CTC GGG ACG-BHQ1-3',
BHQ1 означает присоединенный к 3'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FAM - флуоресцентный краситель FАМ, присоединенный к нуклеотиду С.