СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ СТАДИЙ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, эндокринологии, биологии, патофизиологии и может быть использовано для диагностики стадий диабетической нефропатии (ДН).

ДН - специфическое поражение сосудов почек при сахарном диабете, сопровождающееся формированием диффузного (на ранних стадиях) и узелкового (на поздних стадиях) гломерулосклероза, терминальная стадия которого характеризуется развитием хронической почечной недостаточности (ХПН). Во всем мире ДН и развившаяся вследствие нее ХПН являются лидирующей причиной смерти при сахарном диабете.

В настоящее время имеет место следующая классификация ДН (2001 г.):

I стадия

- Диабетическая нефропатия, стадия микроальбуминурии.

Должные показатели: микроальбуминурия 30-300 мг/с, протеинурия <0,5 г/с.

II стадия

- Диабетическая нефропатия, стадия протеинурии.

Должные показатели: микроальбуминурия >300 мг/с, протеинурия >0,5 г/с.

III стадия

- Диабетическая нефропатия, стадия ХПН.

Должные показатели - возможна любая суточная протеинурия, чаще >0,7 г/с+ХПН (Эндокринология. Национальное руководство. М., 2008. С.407-414; М.В.Шестакова, И.И.Дедов. Сахарный диабет и хроническая болезнь почек. - М. 2009. - С.36-67).

Ведущим прогнозирующим фактором является появление протеинурии, что указывает на склерозирование клубочков почек и необратимость этого процесса.

Приводим общепринятые критерии морфологической характеристики структуры почечной ткани при ДН: (Б.И.Шулутко. Вторичные нефропатии. Диабетическая нефропатия. Л., 1987. - С.51-68; М.В.Шестакова, И.И.Дедов. Сахарный диабет и хроническая болезнь почек. - М. 2009. - С.60-65).

I стадия: гипертрофия клубочков и канальцев; утолщение БМК; увеличение мезангиального матрикса более 20% объема клубочков.

II стадия: утолщение БМК увеличение мезангиального матрикса более 40% объема клубочков; склероз 25-50% клубочков; артериологиалиноз; тубулоинтерстициальный фиброз.

III стадия: склероз более 70% клубочков; артериологиалиноз; тубулоинтерстициальный фиброз.

Приводим структуру почек здорового человека, фиг.1 и фиг.2, фиг.1 - строение почки здорового человека (из кн. Атлас по гистологии и эмбриологии. И.В.Алмазов, Л.С.Сутулов. М., 1978, С.448-449).

Фиг.2 - нормальный клубочек. Из кн.: Б.Н.Шулутко. Вторичные нефропатии. М., 1987, С.149.

Приводим структуру почки больных с ДН: диффузная форма, фиг.3. (из кн: Б.Н.Шулутко. Вторичные нефропатии. М., 1987, С.56).

Узелковая форма, фиг.4; взято из той же книги, стр.60-61.

Стандарты диагностики стадий ДН включают определение суточной протеинурии и биопсию почки (М.В.Шестакова, И.И.Дедов. Сахарный диабет и хроническая болезнь почек. М., 2009; О.В.Новоселова, М.Б.Пятигорская, Ю.Е.Михайлов. Клинические аспекты выявления и оценки протеинурии (Справочник заведующего КДЛ, №1, январь, 2007. С.18-24; Биохимический анализатор ADVIA 1200 (Bayer). Руководство по эксплуатации. США, 2008; Руководство по нефрологии. М.2000. - С.77-78).

Аналог

Определение суточной протеинурии, проводимой с помощью биохимического автоматического анализатора ADVIA 1200 (Bayer). Руководство по эксплуатации. США, 2008.

Основные стадии способа:

1. Сбор суточной мочи

2. Взятие пробы из суточной мочи в количестве 0,2 мл.

3. Помещение пробы в анализатор на 10 мин.

Недостатки способа:

- применение дорогостоящего автоматического анализатора,

- трудоемкость,

- погрешности в результатах,

- снижение информативности.

Ближайший аналог

Пункционная биопсия - получение материала для гистологического исследования почечной ткани, по результатам которой ставят диагноз заболевания и определяют его стадии. Биопсию выполняют под контролем рентгенологической или ультразвуковой аппаратуры для точного определения положения почки (Руководство по нефрологии, раздел II: Диагностика заболеваний почек. Дж.Витворт, Дж.Р.Лоренс. М., 2000, С.77-78).

Основные этапы выполнения способа:

1. Период операций - больному дают транквилизатор.

2. Больной находится в положении лежа на животе с подложенным под грудную клетку валиком

3. Проводят местную анестезию по ходу биопсийной иглы, которую аккуратно вводят на расстоянии 1 см кнутри от наружной границы нижнего полюса почки. Иглу продвигают при задержке дыхания пациента.

4. Иглу вводят в ткань на требуемую глубину, затем удаляют троакар, вводят расщепленную иглу и берут кусочек ткани.

5. Затем больного укладывают на 4 часа на спину и через каждые полчаса измеряют давление и частоту пульса.

6. В дальнейшем больной должен соблюдать постельный режим в течение суток.

7. На протяжении 2 недель ему нельзя поднимать тяжести.

8. Полученные образцы ткани исследуют с помощью световой иммунофлюоресцентной и электронной микроскопии.

9. Биопсию осуществляют под контролем рентгенологической или ультразвуковой аппаратуры.

Недостатки способа

1. Инвазивность метода.

2. Вероятность осложнений: кровотечение, почечная колика, обострение хронического процесса, возникновение околопочечной гематомы, развитие септицемии, артериовенозных свищей.

3. Применение сложной аппаратуры: рентгеновский или УЗИ-аппарат, микроскопия световая, иммунофлюоресцентная, электронная.

Задачи предлагаемого изобретения

1. Обеспечение экспресс-диагностики стадий диабетической нефропатии.

2. Повышение информативности диагностики.

3. Исключение инвазивности в диагностике ДН.

4. Упрощение способа, сокращение стоимости диагностики и трудозатрат.

Техническим результатом предложения является экспресс-регистрация изображения структуры почки при ДН. Регистрацию осуществляют биологической тест-системой (БТС), которая «считывает» изображение, формируя ответные структуры, соответствующие стадиям заболевания. Способ позволяет в течение 15-20 минут достоверно определить стадию ДН, исключить инвазивность, сократить расходы на исследование в 10-12 раз.

Существенная новизна предложения - в использовании БТС, для чего предварительно готовят БТС: смесь 0,2% водного раствора аминокислот (глютаминовая, валин, тирозин, серин, триптофан, лейцин, аргинин) в равных пропорциях; 0,25% раствор натриевой соли ДНК; 25% водный раствор сернокислой магнезии в соотношении 2:1:2.

Затем на стеклянную пластину размером 12×6 см в виде ряда дорожек длиной 4-5 мм каждая в шахматном порядке наносят по 0,01-0,02 мл БТС, пластину помещают в зону проекции почки вдоль позвоночника между XII грудным и III поясничным позвонками, выдерживают 4-5 минут, затем препарат сушат при температуре 18-20°С на протяжении 2-3 минут, микроскопируют с кварцевым компенсатором и при наличии в структуре пробы единичных крупнозернистых ячеек и/или мелкозернистых ячеек, разряженных субпараллельных агрегатов со спиралевидными включениями определяют I стадию диабетической нефропатии; при наличии мелкозернистых ячеек, округлых агрегатов с кристаллоидными включениями, разреженных субпараллельных агрегатов с реликтовыми спиралевидными включениями диагностируют II стадию диабетической нефропатии; присутствие недифференцируемых участков разрежения и реликтов спиралевидных агрегатов определяет III стадию диабетической нефропатии.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Готовят БТС - модель in vitro для регистрации биологического излучения почки. Смесь БТС состоит из 0,2% водного раствора аминокислот (глютаминовая, валин, тирозин, серин, триптофан, лейцин, аргинин) в равных пропорциях; 0,25% раствор натриевой соли ДНК; 25% водный раствор сернокислой магнезии в соотношении 2:1:2.

2. Тарированной пипеткой БТС объемом по 0,01-0,02 мл в виде ряда дорожек длиной 4-5 мм каждая в шахматном порядке (с целью определения на большей площади структуры органа) наносят на стеклянную пластину размером 12×6 см.

3. Стеклянную пластину с нанесенной на нее БТС помещают в зону проекции почки вдоль позвоночника между XII грудным и III поясничным позвонками, выдерживают 4-5 минут, затем препарат сушат при температуре 18-20°С на протяжении 2-3 минут, микроскопируют с кварцевым компенсатором и при наличии в структуре пробы единичных крупнозернистых ячеек и/или мелкозернистых ячеек, разреженных субпараллельных агрегатов со спиралевидными включениями определяют I стадию диабетической нефропатии; при наличии мелкозернистых ячеек, округлых агрегатов с кристаллоидными включениями, разреженных субпараллельных агрегатов с реликтовыми спиралевидными включениями диагностируют II стадию диабетической нефропатии; при присутствии недифференцируемых участков разрежения и реликтов спиралевидных агрегатов определяют III стадию диабетической нефропатии.

Приводим данные о БТС - биологическом жидкокристаллическом полимере, реагирующем на энергетическое излучение появлением информационной структуры (Диплом на открытие №37 - S. М., 2009 «Свойство информационной биологической тест-системы изменять свою структуру при взаимодействии с другими объектами». Автор Савина Л.В. и др.).

Структура - мгновенный снимок внутренних взаимодействий в системе (А.А.Малиновский. Теория структуры и ее место в системном подходе. В кн.: Системные исследования. Ежегодник. М., 1970, С.10-31).

Излучения человека, животных и других биообъектов являются носителями информации об их энергоинформационном обмене, волновые коды которого можно регистрировать биокристаллами (Л.В.Савина. Энергоинформационные взаимодействия. Краснодар, 2008; Рорр F.A. Cofrerent photos storage of biological systems // J. Bid. 1999, p.144-167).

В разработанной нами БТС главным компонентом являются аминокислоты, обладающие высокой биологической и информационной активностью. Единая система информации обеспечивается последовательностью нуклеотидов, в которой каждые три нуклеотида - кодон определяют одну молекулу аминокислоты (В.П.Гаряев. Волновой код ДНК. М., 2004).

Используя БТС для регистрации биологического излучения почки, мы при помощи аминокислот «считываем» волновой энергетический код органа, при этом в БТС возникает конвертируемая информационная структура самого органа.

На фиг.5 приведена структура БТС, полученная при ее размещении в зоне проекции почки здорового человека. Присутствуют: «а» - крупнозернистые ячейки и «б» - субпараллельные спиралевидные агрегаты. Проведено 195 клинических экспериментов.

Примеры

Пример 1, фиг.6а, б, в. Больная Г. Диагноз: Сахарный диабет 1 тип. Диабетическая нефропатия 1 стадия. История болезни (ИБ) №55192.

На фиг.6а, б, в приведены структуры БТС, видны единичные крупнозернистые агрегаты (а), мелкозернистые ячейки (б), разряженные субпараллельные агрегаты со спиралевидными включениями (в).

Технология: на стеклянную пластину размером 12×6 см в виде дорожек длиной 4-5 мм каждая в шахматном порядке нанесли по 0,01 мл БТС, пластину поместили в зону проекции почки вдоль позвоночника между XII грудным и III поясничным позвонками, выдержали 4 минуты, высушили при температуре 18°С на протяжении 2 минут, исследовали в поляризованном свете с кварцевым компенсатором, в структуре обнаружили единичные крупнозернистые ячейки, разреженные субпараллельные агрегаты со спиралевидными включениями. Определили 1 стадию диабетической нефропатии.

Одновременно определили суточную протеинурию, которая оказалась <5 г/л, в норме в суточной моче здорового человека определяют следы белка менее 30 мг/с, 1/2 которого составляет глобулин. Биопсия почки выявила: Гипертрофия клубочков канальцев. Расширение мезангиального матрикса, повышение клеточности за счет пролиферации мезангиальных клеток. Артериолы - легкий интимальный фиброз. Клетки тубулярного эпителия вакуолизированы, содержат жир. Утолщена тубулярная базальная мембрана, неравномерна инфильтрация интерстиция.

Увеличение мезангиального матрикса более 20% объема клубочков.

Диагноз (DS): Диабетическая нефропатия 1 стадии подтвердилась.

Пример 2, фиг.7а, б, в. Больная К., DS: Сахарный диабет 1 типа, диабетическая нефропатия II стадии. ИБ №43901.

На фиг 7а, б, в приведены структуры БТС, видны мелкозернистые ячейки (а), округлые агрегаты с кристаллоидными включениями (б), разряженные субпараллельные агрегаты с реликтовыми спиралевидными включениями (в).

Технология: на стеклянную пластину размером 12×6 см в виде дорожек длиной 4-5 мм каждая в шахматном порядке нанесли по 0,02 мл БТС, пластину поместили в зону проекции почки вдоль позвоночника между XII грудным и III поясничным позвонками, выдержали 5 минут, затем препарат высушили при температуре 19°С на протяжении 3 минут, исследовали в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и выявили в структуре пробы мелкозернистые ячейки, округлые агрегаты с кристаллоидными включениями. Определили II стадию диабетической нефропатии. Единовременно определили суточную протеинурию, которая оказалась повышенной - 0,7 г/с.

Биопсия почки выявила: утолщение БМК, интесивное накопление мезагиального матрикса, утрату просвета капилляров, сужение просвета капсулы, преобладают сегментарные изменения. Артериолы - утолщение за счет интимального фиброза и гипертрофии мышечной оболочки. Единичные проявления нодулярного склероза. Увеличение мезангиального матрикса более 40% объема клубочков, склероз 28 клубочков.

DS: Диабетическая нефропатия, II стадия, подтвердился.

Пример 3, фиг.8а, б, в. Б-ая Е. DS: Сахарный диабет, 1 тип. Диабетическая нефропатия, III стадия.

На фиг.8а, б, в приведены структуры БТС, видны недифференцируемые участки разрежения (а), реликтовые спиралевидные агрегаты (б).

Технология: на стеклянную пластину размером 12×6 см в виде дорожек длиной 4-5 мм каждая в шахматном порядке нанесли по 0,02 мл БТС, пластину поместили в зону проекции почки вдоль позвоночника между XII грудным и III поясничным позвонками, выдержали 4 минуты, затем препарат высушили при температуре 20°С на протяжении 3 минут, исследовали в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и обнаружили в структуре пробы недифференцируемые участки разряжения и реликтовые спиралевидные агрегаты. Определили III стадию диабетической нефропатии. Одновременно определили суточную протеинурию, которая оказалась высокой - 8,5 г/с.

Биопсия почки: интенсивное накопление мезангиального матрикса, резкое утолщение капиллярной стенки, сокращается количество просветов капилляров, некоторое увеличение клеточности мезангия, атрофия капилляров и интерстициальный фиброз (от слабого до умеренного). Артериолы - явления нодулярного гломерулосклероза. Склероз 80 клубочков. DS: Диабетическая нефропатия, III стадия, подтвердился.

Изобретение относится к медицине, эндокринологии, биологии, патофизиологии и может быть использовано для диагностики стадий диабетической нефропатии (ДН). Способ экспресс-диагностики стадий диабетической нефропатии, включающий выявление структуры почки, заключается в том, что на стеклянную пластину размером 12×6 см в виде ряда дорожек длиной 4-5 мм каждая в шахматном порядке наносят по 0,01-0,02 мл биологической тест-системы, состоящей из 0,2% водного раствора аминокислот: глютаминовая, валин, тирозин, серин, триптофан, лейцин, аргинин, взятых в равных пропорциях; 0,25% раствора натриевой соли ДНК; 25% водного раствора сернокислой магнезии в соотношении 2:1:2, пластину помещают в зону проекции почки вдоль позвоночника между XII грудным и III поясничным позвонками, выдерживают 4-5 минут, затем препарат сушат при температуре 18-20°С на протяжении 2-3 минут, исследуют под микроскопом в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и при наличии в структуре пробы единичных крупнозернистых ячеек и/или мелкозернистых ячеек, разряженных субпараллельных агрегатов со спиралевидными включениями определяют I стадию диабетической нефропатии, при наличии мелкозернистых ячеек, округлых агрегатов с кристаллоидными включениями, разреженных субпараллельных агрегатов с реликтовыми спиралевидными включениями диагностируют II стадию диабетической нефропатии, при присутствии недифференцируемых участков разрежения и реликтов спиралевидных агрегатов определяет III стадию диабетической нефропатии. Вышеописанный способ прост в исполнении, высокоинформативен, исключает инвазивность. 8 ил.

Способ экспресс-диагностики стадий диабетической нефропатии, включающий выявление структуры почки, отличающийся тем, что на стеклянную пластину размером 12×6 см в виде ряда дорожек длиною 4-5 мм каждая в шахматном порядке наносят по 0,01-0,02 мл биологической тест-системы, состоящей из 0,2%-ного водного раствора аминокислот: глютаминовая, валин, тирозин, серии, триптофан, лейцин, аргинин, взятых в равных пропорциях; 0,25%-ного раствора натриевой соли ДНК; 25% водного раствора сернокислой магнезии в соотношении 2:1:2, пластину помещают в зону проекции почки вдоль позвоночника между XII грудным и III поясничным позвонками, выдерживают 4-5 мин, затем препарат сушат при температуре +18-20°С на протяжении 2-3 мин, исследуют под микроскопом в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и при наличии в структуре пробы: единичных крупнозернистых ячеек и/или мелкозернистых ячеек, разряженных субпараллельных агрегатов со спиралевидными включениями определяют I стадию диабетической нефропатии, при наличии мелкозернистых ячеек, округлых агрегатов с кристаллоидными включениями, разреженных субпараллельных агрегатов с реликтовыми спиралевидными включениями диагностируют II стадию диабетической нефропатии, при присутствии недифференцируемых участков разрежения и реликтов спиралевидных агрегатов определяет III стадию диабетической нефропатии.