СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ГИПЕР-БЕТА 2-МИКРОГЛОБУЛИНЕМИИ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/49 

Изобретение относится к медицине, биологии и может быть использовано для диагностики заболеваний, протекающих с гипер-бета 2-микроглобулинемией.

Бета-2-микроглобулин (β2-МГ) - низкомолекулярный белок поверхностных антигенов клеточных ядер. Присутствие его в сыворотке крови (СК) обусловлено процессами деградации и репарации отдельных элементов клеток. β2-МГ свободно проходит через мембрану почечных клубочков, 99,8% его затем реабсорбируется в проксимальном отделе почечных канальцев. Период полураспада β2-МГ составляет 40 мин. Уменьшение клубочковой фильтрации способствует повышению уровня β2-МГ в СК, нарушение функции почечных канальцев приводит к экскреции больших количеств β2-МГ с мочой.

К состояниям, при которых повышается уровень сывороточного β2-МГ относятся: аутоиммунные заболевания, острые вирусные инфекции, иммунодефицит (например, при СПИД), состояния после трансплантации органов, гемобластозах (В-клеточной миэломе, острых лейкозах, лимфомах).

Определение β2-МГ в СК проводят больным при диагностике заболеваний почек (гломерулонефрит, канальцевые нефропатии, диабетическая нефропатия (Г.И.Назаренко, А.А.Кишкун. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М. 2000, с.346).

Повышенная концентрация сывороточного β2-МГ была выявлена у пациентов с аутоиммунными заболеваниями (ксеродерматоз, системная красная волчанка, ревматоидный артрит (Michalski J.P., Daniels Т.Е., Tatal N, et al: Beta-2 Microglobulin and limphocytic infiltration in sjogren's syndrome. New Engl. J. Med. 293, 12128-1231 (1975); maury C.P. Jetal: Serum 2-microglobulin, sialic acid, and - С reactive protein in systemic lupus erythematosus. Rheumatol Jnt. 2, 145-149 (1982); Manicort D. et al.: Plasma and urinary levels of 2 - microglobulin in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis 37, 328-332 (1978).

Повышенный уровень β2-МГ отмечен при злокачественных новообразованиях легких, грудной железы, желудка, поджелудочной железы, толстой кишки, гемотосаркомах, хроническом лимфо- и миэлолейкозах, истинной полицитемии, инфекционном мононуклеозе, иммунном заболевании печени (В.Г.Воробьев, Б.Н.Сиднев. Клиническое значение радиоиммунологического определения уровня β2-микроглобулина у больных острыми лейкозами. Тер. архив, 1990, №7, стр.20-23).

Известны способы определения β2-микроглобулина в сыворотке крови человека - радиоиммунологический (Кравчук З.И., Чащин В.Л., Дрожденюк А.П. и др. Радиоиммунологическая тест-система для определения β2-микроглобулина в сыворотке крови и мочи человека // Медицинская радиология, №2, 1989, с.44-47) и иммуноферментный (Набор «β2-микроглобулин ИФА Cobas CoRe» АО «РОШ-Москва», 101407, Москва, Рахмановский пер.4. Т.25 8-27-38).

Аналог: Радиоиммунологический способ (Кравчук З.И., Чащин В.Л., Дрожденюк А.П. и др. Радиоиммунологическая тест-система для определения β2-микроглобулина в сыворотке крови и мочи человека // Медицинская радиология, №2, 1989, с. 44-47).

В основе способа лежит принцип «конкуренции» между ¹²⁵J-β2-МГ и β2-МГ (стандартным или определяемым) за связывание со специфическими антителами.

Ход исследования

- Используют тест-систему, включающую антисыворотки в разведении, обеспечивающем 50% связывание меченого лиганда.

- Радийодирование β2-МГ осуществляют при помощи хлорамина Т по методу V. Huhter и F. Greenwood, 1962.

- Для выделения и очистки ¹²⁵J - β2-МГ используют гель-хроматографию на колонке с сефадексом.

- Готовят калибровочные пробы с известным содержанием β2-МГ.

- Для отделения свободного β2-МГ от его комплекса со специфическими антителами используют 18% раствор полиэтиленглюколя.

Недостатки способа

- Нарушение нативности исследуемой сыворотки крови.

- Использование радиоактивного материала.

- Применение наборов реактивов и дорогостоящего оборудования.

Нами в качестве прототипа взят иммуноферментный способ для количественного определения β2-микроглобулина в сыворотке крови человека (набор «β2-микроглобулин ИФА Cobas CoRe», рекомендован к применению в учреждениях здравоохранения и зарегистрирован регистрационной комиссией МЗ РФ (Р/У МЗ РФ 2000/720).

Принцип способа: «β2-микроглобулин ИФА Cobas CoRe» является твердофазным одноступенчатым иммунноферментным способом, основанным на принципе конкуренции.

В данной тест-системе используются высокоспецифические моноклональные мышиные антитела к β2-МГ.

Рекалибратор, контрольная сыворотка и образцы пациентов инкубируются с шариками, покрытыми человеческим полигаптеном β2-МГ и моноклональными анти-β2-МГ антителами, ковалентно связанными с пероксидазой хрена.

В течение инкубации антитела вступают во взаимодействие или с β2-МГ находящимся на шарике или с β2-МГ рекалибратора, контрольной сыворотки или образца пациента.

После промывки шарики инкубируют с рабочим раствором субстрата. Интенсивность образующейся окраски обратно пропорциональна концентрации β2-МГ.

Ход исследования

- Довести все реактивы до комнатной температуры. Подготовить пробирки в дублях.

- Внести реагенты:

100 мкл рекалибратора (3d) или 10 мкл контрольной сыворотки

(4) крови пациента

100 мкл дилюгента (5) в контрольную сыворотку и 100 мкл

делюгента (5) в образцы сыворотки крови

200 мкл коньюгента (2)

- Добавить 1 шарик во все пробирки кроме ФП

- Инкубировать 20 мин при 37°С и постоянном встряхивании

- Промыть при помощи промывателя по заданной программе

- Приготовить рабочий раствор субстрата за 10 мин перед использованием из расчета: 1 объем ТМБ (8) + 4 объема H₂O₂ в буфере (10)

- Добавить 250 мкл рабочего раствора субстрата

- Инкубировать 15 мин при 37°С и постоянном встряхивании в темноте

- Добавить 1 мл серной кислоты (12)

- Измерить поглощение при 450 нм против ФП

- Рассчитать результат по компьютерной программе для β2-МГ

Недостатки

- Нарушение нативности сыворотки крови

- Использование реактивов для иммунологической реакции, ферментной реакции

- Применение дорогостоящего автоматического анализатора CoBAS CoRe фирмы «Хоффманн-Ла-Рош»

- Дороговизна проводимого исследования

Задачи

1. Повышение информативности определения гипер-β2-МГ

2. Обеспечение экспресс-диагностики гипер-β2-МГ

3. Возможность визуальной оценки присутствия β2-МГ

4. Снижение экономических затрат

Технической новизной способа экспресс-диагностики гипер-бета 2-микроглобулинемии является приготовление препарата сыворотки крови человека с последующей его микроскопией, для чего капли сыворотки крови наносят на дно чашки Петри в количестве от 8 до 10, накрывают второй чашкой Петри, помещают в вакуумную камеру при создании в ней давления 0,1-0,5 мм рт.ст., Т=+18-20°С, высушивают на протяжении 1-1,5 часа, микроскопируют в проходящем свете и при наличии в препарате спиральных агрегатов цепочечно-ориентированных или разреженных диагносцируют гипер-β2-микроглобулинемию.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Из вены больного берут 3,0 см³ крови, цетрифугируют для получения сыворотки крови (СК)

2. Капли СК тарированной пипеткой в объеме 0,02-0,03 мл наносят на дно чашки Петри в количестве 8-10 капель

3. Второй чашкой Петри накрывают первую чашку Петри и помещают обе чашки в вакуумную камеру при создании в ней давления 0,1-0,5 мм рт.ст., Т=+18-20°С

4. Препарат выдерживают в камере (сушат) на протяжении 1-1,5 часа и микроскопируют в проходящем свете

5. При наличии в препарате спиральных агрегатов цепочечно-ориентированных или разреженных диагносцируют гипер-бета 2-микроглобулинемию.

Нами предварительно были приготовлены эталонные модели, представленные образцами, полученными при сушке в вакуумной камере (давление 0,1-0,5 мм рт.ст., Т=+18-20°С, время выдерживания в камере - 1-1,5 часа) калибратора из набора «β2 микроглобулин ИФА CoBas Core», содержавшего 450 мг/м β2-МГ, сывороток крови человека, содержавших известное количество β2-МГ: 1,80 мг/л, 4,5 мг/л и 40,3 мг/л.

На фиг.1 представлена структура СК здорового человека, высушенная в условиях вакуумной камеры (давление 0,1-0,5 мм рт.ст., Т= +18-20°С, время выдерживания в камере - 1-1,5 часа), видны субпараллельные полосы.

На фиг.2 представлена структура калибратора (рекалибратора), содержащая 450 НГ/МЛ β2-МГ, видны спиральные агрегаты.

На фиг.3, 4, 5 представлены эталонные модели, приготовленные из сыворотки крови человека, содержащие соответственно 1,8, 4,5 и 40,3 мг/л β2-МГ.

Способ апробирован на 400 больных.

Пример 1. Больной К. Диагноз (DS): Хр. гломерулонефрит, ХПН II ст., история болезни (ИБ) №718. На фиг.6 приведена структура сыворотки крови (СК), видны спиральные агрегаты цепочечно ориентированные.

Технология. Из вены больного К. взяли 3,0 мл крови, отцентрифугировали. Капли СК, каждая объемом 0,02 мл в количестве 8 капель нанесли на дно чашки Петри, накрыли второй чашкой Петри и высушили в вакуумной камере при создании в ней давления 0,1 мм рт.ст., Т=+18°С, время сушки 1 час. Полученный препарат изучили под микроскопом в проходящем свете. Присутствуют спиральные агрегаты цепочечно ориентированные. Одновременно в СК определили уровень β2-МГ, он оказался повышенным - 7,4 мг/л при норме 1,68±0,09 мг/л. Предполагаемая гипер-бета 2-микроглобулинемия подтвердилась.

Пример 2. Больной Н. DS: Сахарный диабет I тип, нефропатия II ст., ИБ №79. На фиг.7 приведена его структура СК, видны спиральные агрегаты цепочечно ориентированные.

Технология. Из вены больного Н. взяли 3,0 мл крови, отцентрифугировали. Капли СК (9) каждая объемом 0,03 нанесли на дно чашки Петри, накрыли второй чашкой Петри и высушили в вакуумной камере (ВК) при давлении 0,2 мм рт.ст., Т=+19°С на протяжении 1,5 часа. Препарат микроскопировали в проходящем свете. Видны спиральные агрегаты цепочечно ориентированные. Одномоментно в СК определили уровень β2-МГ, он оказался повышен и составил 16,8 мг/л, при норме 1,68 мг/л. Гипер-бета 2-микроглобулинемия подтвердилась.

Пример 3. Больная 3. DS: Аутоиммунный гепатит. ИБ №249. На фиг.8 приведена структура СК, видны спиральные агрегаты разреженные.

Технология. Из вены больной 3. взято 3 мл крови, в количестве 10 капель, каждая объемом 0,03 мл нанесли на дно чашки Петри, накрыли второй чашкой Петри и высушили в вакуумной камере (ВК) при создании в ней давления 0,5 мм рт.ст., Т=+20°С. Сушку вели 1 час. Препарат микроскопировали в проходящем свете, видны спиральные агрегаты разреженные. Одномоментно в СК определили уровень β2-МГ, который был повышен - 39,4 мг/л, гипер-бета 2-микроглобулинемия подтвердилась.

Пример 4. Больной В. DS: Хр. пиелонефрит, ХПН II ст. ИБ №20. На фиг.9 приведена структура СК, присутствуют спиралевидные агрегаты разреженные.

Технология. Из вены больного В. взято 3,0 мл крови, которую отцентрифугировали. СК в количестве 8 капель, каждая объемом 0,02 мл нанесли на дно чашки Петри, накрыли второй чашкой Петри и высушили в ВК при давлении 0,5 мм рт.ст. на протяжении 1,5 часа при Т=+19°С. Полученный препарат микроскопировали. Видны спиралевидные агрегаты разреженные.Одновременно в СК определили уровень β2-МГ, он оказался повышен - 18,4 мг/л, при норме 1,68 мг/л. Гипер-бета 2-микроглобулинемия подтвердилась.

Пример 5. Больной Д. DS: О.респираторная вирусная инфекция. ИБ №306. На фиг.10 приведена структура СК, видны спиралевидные агрегаты цепочечно ориентированные.

Технология. Из вены больного Д. взято 3,0 мл крови, она отцентрифугирована. СК в количестве 9 капель, каждая объемом 0,03 мл нанесли на дно чашки Петри, накрыли второй чашкой Петри и высушили в ВК на протяжении 1 час при давлении 0,4 мм рт.ст., Т=+20°С. Препарат микроскопировали. Присутствуют спиралевидные агрегаты цепочечно ориентированные. Одновременно в СК определили уровень β2-МГ, он оказался повышен - 2,9 мг/л при норме 1,68 мг/л. Гипер-бета 2-микроглобулинемия подтвердилась.

Пример 6. Больная У. DS: Системная красная волчанка. ИБ №36. На фиг.11 приведена структура СК, присутствуют спиралевидные агрегаты цепочечно ориентированные.

Технология. Из вены больной У. взято 3,0 мл крови, она отцентрифугирована. Капли СК в количестве 8, каждая объемом 0,2 мл нанесли на дно чашки Петри, накрыли второй чашкой Петри и высушили в ВК при давлении 0,5 мм рт.ст. при Т=+19°С на протяжении 1 часа. Препарат микроскопировали. Видны спиралевидные агрегаты цепочечно ориентированные. Одновременно в СК определили уровень β2-МГ, он оказался повышен и составил 3,1 мг/л. Гипер-бета 2-микроглобулинемия подтвердилась.

Пример 7. Больной Я. DS: О. лейкоз. ИБ №212. На фиг.12 приведена структура СК, видны спиралевидные агрегаты разреженные.

Технология. Из вены больного Я. взято 3,0 мл крови, она отцентрифугирована. СК в количестве 10 капель, каждая объемом 0,02 мл нанесли на дно чашки Петри, накрыли второй чашкой Петри и высушили в ВК при давлении 0,3 мм рт.ст., Т=+18°С на протяжении 1,5 часа. Образец микроскопировали. Присутствуют спиралевидные агрегаты разреженные. Одновременно в СК определили уровень β2-МГ, он оказался повышен - 12,2 мг/л. Гипер-бета 2-микроглобулинемия подтвердилась.

Пример 8. Больная В., DS: Хр. лимфолейкоз. На фиг.13 приведена структура СК, видны спиралевидные цепочечно ориентированные агрегаты.

Технология. Из вены больного В. взято 3,0 мл крови, она отцентрифугирована. СК в количестве 9 капель, каждая объемом 0,03 мл нанесли на дно чашки Петри, накрыли второй чашкой Петри и высушили на протяжении 1 часа в ВК при создании в ней давления 0,4 мм рт.ст., Т=+19°С. Препарат микроскопировали. Видны спиралевидные агрегаты цепочечно ориентированные. Одновременно в СК определили уровень β2-МГ, он оказался повышен и составил 10,6 мг/л. Гипер-бета β2-МГ подтвердилась.

Пример 9. Больная Л. DS: Ревматоидный полиартрит. ИБ №79. На фиг.14 приведена структура СК, видны спиралевидные агрегаты цепочечно ориентированные.

Технология. Из вены больной Л. взято 3,0 мл крови, ее отцентрифугировали. СК в количестве 8 капель, каждая объемом 0,03 мл нанесли на дно чашки Петри, накрыли второй чашкой Петри и высушили в ВК на протяжении 1,5 часа при давлении 0,1 мм рт.ст., Т=+20°С. Препарат микроскопировали. Видны спиралевидные агрегаты цепочечно ориентированные. Одномоментно в СК определили уровень β2-МГ, он оказался повышен и составил 5,9 мг/л. Гипер-β2-МГ подтвердилась.

Пример 10. Больной П. DS: Сахарный диабет I тип, диабетическая нефропатия II-III степени, ХПН.

На фиг.15 приведена структура СК, видны рязреженные спиралевидно ориентированные агрегаты.

Технология. Из вены больного П. взято 3,0 мл крови, она отцентрифугирована. СК в количестве 9 капель, каждая объемом 0,02 мл нанесли на дно чашки Петри, накрыли второй чашкой Петри и высушили в ВК на протяжении 1,5 часа при Т=+20°С, давление 0,2 мм рт.ст. Образец микроскопировали. Видны разреженные спиралевидные агрегаты. Одновременно в СК определили уровень β2-МГ, он оказался повышен и составил 44,9 мг/л. Гипер-β2-МГ подтвердилась.

Преимущества предлагаемого способа:

1. Нативность и физиологичность проводимого исследования.

2. Повышение достоверности регистрации повышения содержания β2-МГ в сыворотке крови человека.

3. Экспресс-визуальная диагностика гипер-β2-МГ.

4. Снижение затрат, упрощение базового способа.

Изобретение относится к медицине, биологии и может быть использовано для диагностики заболеваний, протекающих с гипер-бета 2-микроглобулинемией. Для осуществления способа капли сыворотки крови наносят на дно чашки Петри в количестве от 8 до 10, накрывают второй чашкой Петри, помещают в вакуумную камеру при создании в ней давления 0,1-0,5 мм рт.ст., Т=+18-20°С, высушивают на протяжении 1-1,5 часа, микроскопируют в проходящем свете. При наличии в препарате спиральных агрегатов цепочечно-ориентированных или разреженных диагносцируют гипер-бета 2-микроглобулинемию. Способ прост в исполнении и может быть использован как скрининг-тест. 15 ил.

Способ экспресс-диагностики гипер-бета 2-микроглобулинемии, включающий исследование сыворотки крови человека, отличающийся тем, что капли сыворотки крови наносят на дно чашки Петри в количестве от 8 до 10, накрывают второй чашкой Петри, помещают в вакуумную камеру при создании в ней давления 0,1-0,5 мм рт. ст., Т=+18-20°С, высушивают на протяжении 1-1,5 ч, микроскопируют в проходящем свете и при наличии в препарате спиральных агрегатов цепочечно ориентированных или разреженных диагностируют гипер-бета 2-микроглобулинемию.