СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТРИХИНЕЛЛЕЗА СВИНЕЙ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/49 

Предлагаемое изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности к паразитологии, и может быть использовано для прижизненной диагностики трихинеллеза у свиней.

Известен способ диагностики трихинеллеза при помощи иммуноферментного анализа (ИФА), разработанный Ruitenberg et all. [7] и широко применяемый в ветеринарии и медицине. Нерастворимой основой служат планшеты из полистирола. Все виды биологических жидкостей (антиген, исследуемая сыворотка, конъюгат) и субстрат вносятся в объеме 0,1 мл и затем инкубируются в течение 30 минут. Отрицательным контролем служит сыворотка здорового животного. Свежеприготовленная субстратная смесь (ортофенилендиамин в цитратном буфере) вносится в каждую лунку и выдерживается при комнатной температуре 10 минут в темноте. Реакция останавливается стоп-реагентом (раствор концентрированной серной кислоты с дистиллированной водой в соотношении 1:1). Реакция оценивается визуально (по интенсивности окрашивания лунок) или на многоканальном спектрофотометре для 96-луночных планшетов. К недостаткам существующих способов диагностики трихинеллеза относятся высокая стоимость реактивов, антигена, конъюгата.

Существует способ оценки кристаллообразования и извлечения из совокупности кристаллических и аморфных структур информационной нагрузки, основанный на выделении качественных маркеров того или иного патологического процесса, тогда как привлечение к описанию кристаллогенеза количественных параметров практически не используется специалистами, что существенно снижает достоверность кристаллоскопической диагностики [1, 2-4, 6]. В диагностике паразитозов данный способ не применялся.

Целенаправленное изучение особенностей собственной (кристаллоскопия) и инициированной (тезиграфия) кристаллизации биосубстратов животных не проводилось. Это обусловливает актуальность и значимость исследований, направленных на выяснение диагностической роли тезиграфических и кристаллоскопических паттернов патологических состояний, в том числе при паразитозах. Поэтому целью изобретения явилась оптимизация диагностики трихинеллеза свиней с применением биокристаллоскопии.

Авторы и заявитель предлагают проводить диагностику трихинеллеза животных с применением методов биокристаллоскопии. В основе данного методологического подхода лежит способность биологических жидкостей, в том числе сыворотки крови, к образованию при высушивании специфической кристаллоскопической фации, а также к инициации кристаллогенеза специально подобранных базисных веществ, для которых характер кристаллизации хорошо известен.

В целях составления диагностического алгоритма проведены экспериментальные исследования по оценке результатов собственного и инициированного кристаллогенеза сывороток крови 36 здоровых свиней и 10 свиней, зараженных Trichinella spiralis (штамм ВИГИС, доза возбудителя - 1000) и 20 с естественной инвазией. Для этого на 70 день после экспериментального заражения производили получение сыворотки, подлежащей биокристаллоскопическому исследованию. Проведенный анализ собственной и инициированной 0,9% раствором хлорида натрия (NaCl) кристаллизации сыворотки крови [5], позволил выявить различия кристаллоскопических и тезиграфических обрацов у здоровых и зараженных трихинеллами свиней, а также установить минимально достаточный уровень сопоставимости критериев тезиокристаллоскопии биосреды для достижения чувствительности и специфичности теста более 75%.

Сущность предлагаемого способа и сходство с прототипами заключается в том, что тест (или метод) основан на принципах кристаллообразования и может применяться для прижизненной диагностики. Отличительным признаком является то, что для оценки помимо качественных параметров применяются количественные показатели по установленным нормативам, разработанным авторами. Наряду с простотой в постановке, тест сочетает достаточно высокую информативность, объективность и большую достоверность.

Способ диагностики осуществляют следующим образом. Для этого на предварительно промытое, обезжиренное и просушенное предметное стекло наносят образцы сыворотки крови в объеме 0,1 мл как в индивидуальном виде (собственная кристаллоскопия), так и совместно с базисным веществом - 0,9% раствором хлорида натрия (инициированная тезиграфия). Гемолиз сывороток не допускается. Сушка полученного микропрепарата производится в потоке теплого воздуха. При этом горизонтальное положение стекла и горизонтальное направление потока обеспечивает дегидратацию проб в одинаковых условиях. Не допускается объединение капель.

Оценку приготовленных микропрепаратов производят с помощью микроскопа при суммарном увеличении ×56. Описание образцов осуществляют с применением 9-параметрической системы критериев раздельно для кристаллоскопического и тезиграфического образцов. Для кристаллоскопии в спектр параметров входят:

1. Индекс структурности.

Индекс структурности отражает состав элементов образца, наличие, относительное и абсолютное количество тел аморфного и кристаллического строения в микропрепарате. Оценивается по 4-балльной системе:

0 баллов - присутствие в микропрепарате только вещества аморфного строения;

1 балл - дискретная часть образца представлена аморфными телами и единичными кристаллами;

2 балла - наличие в фации, кроме вышеуказанных элементов, дендритного компонента;

3 балла - большая часть или все поле зрения образовано крупными дендритными структурами, аморфные тела и одиночные кристаллы немногочисленны.

2. Кристаллизуемость;

Кристаллизуемость - индикатор активности процесса кристаллогенеза. Является основным количественным маркером способности биологического субстрата к формированию кристаллов. Определяется по 4-балльной шкале:

0 баллов - нет центров кристаллизации;

1 балл - единичные мелкие кристаллы преимущественно одиночного ряда (не более 10 в поле зрения при суммарном увеличении микроскопа ×56);

2 балла - значительное количество центров кристаллизации (более 10 в поле зрения при суммарном увеличении микроскопа ×56);

3 балла - все поле зрения покрыто кристаллами одиночно-кристаллического или дендритного ряда.

3. Тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел.

Тип взаимодействия кристаллических и аморфных структур - параметр, описывающий характер взаимного расположения элементов фации. Возможны два варианта реализации показателя:

а) налипание аморфных частиц на крупные кристаллические образования;

б) оттеснение элементов аморфного строения от кристаллических структур.

4. Степень деструкции фации.

Степень деструкции фации - интегральный показатель, отражающий правильность протекания кристаллогенеза (основная качественная характеристика фации). Выражается в четырех степенях:

0 степень - все элементы фации правильной конфигурации, не разрушены как в целом, так и на отдельных участках; признаки разрушения текстуры фации отсутствуют;

I степень - элементы фации имеют начальные признаки разрушения, деструктивные изменения текстуры не наблюдаются;

II степень - визуализируются многочисленные разрушенные или измененные структуры; есть локальные нарушения целостности текстуры;

III степень - все элементы фации разрушены, невозможно различить отдельные части фации и структуры, образец представляет собой бесформенную массу аморфного, зачастую окрашенного материала; отмечаются четкие признаки разрушения текстуры.

5. Равномерность распределения элементов.

Равномерность распределения кристаллических и аморфных элементов фации - критерий, свидетельствующий о правильности протекания процесса собственного кристаллогенеза. Интерпретируется с использованием шестибальной шкалы:

0 баллов - полная хаотичность фации, наличие разнородных элементов, пустот, мест скопления кристаллических структур, различная ориентация образований в поле зрения.

1 балл - умеренная сгруппированность кристаллов, намечаются единичные участки правильного их построения, занимающие менее 30% от общей площади поля зрения, направленность фигур еще хаотичная.

2 балла - наблюдаются четкие "островки" упорядоченности, занимающие от 30 до 50% поля зрения (изучается не менее трех), расстояния между элементами в группах приблизительно уравниваются, регистрируется некоторая закономерность направленности структурных образований фации.

3 балла - элементы фации в значительном числе (более 50% от общего количества) структурированы, "островки" равномерности переходят в участки сравнительно большой площади. Внутри этих зон наблюдаются правильное расположение и равномерность расстояний между отдельными образованиями. Закономерность направленности элементов и зональность просматриваются достаточно четко.

4 балла - элементы фации в большинстве своем структурированы (свыше 75% от общего количества), остальные распространяются "островками" по полю зрения, чаще в краевой (маргинальной) зоне. Расстояния между отдельными образованиями практически постоянны. Ориентация элементов подчиняется определенной закономерности почти по всему полю зрения.

5 баллов - все элементы тезиграфической фации четко структурированы на всем поле зрения, что подтверждается рассмотрением нескольких полей. Деление на центральную, промежуточную и краевую зоны четко просматривается. Границы последних можно установить даже без микроскопа. Расстояния между элементами картины постоянны, ориентация фигур правильная, закономерная на всей поверхности фации.

6. Выраженность ячеистости.

Степень выраженности ячеистости фации отражает особенности органико-минеральных взаимодействий в фации. Оценка производится по шестибальной шкале:

0 баллов - полное отсутствие признаков появления ячеистости, однородность картины, нет выделения «островков» кристаллов. Фации представляют единый «пласт» кристаллических образований.

1 балл - наличие первых признаков неоднородности, «дробления» кристаллоскопической картины:

- начало обособления групп элементов (менее 30% от числа всех образований, занимающих менее 30% поля зрения);

- появление некоторой неоднородности картины;

- начало «дробления» единого «пласта» кристаллических фигур.

2 балла - отмечается достаточно просматриваемая тенденция к «дроблению» фации, образованию «островков» кристаллов:

- количество обособившихся элементов в «островках» - от 30 до 50% от числа всех структур, они занимают более 30% поля зрения фации;

- выраженная неоднородность, зональность картины;

- визуализируется процесс «разделения фации на участки, регистрируются формирующиеся пояса кристаллизации, служащие границами последних, в некоторых случаях не на всем протяжении, толщиной в 1 кристалл.

3 балла - наблюдаются выраженные изменения в фации:

- элементы в «островках» составляют от 50 до 75% от общего числа, занимаемая ими поверхность - более 50% поля зрения (по нескольким полям);

- выраженная неоднородность, «зернистость» картины;

- четко просматривается процесс «расчленения» фации в нескольких полях зрения;

- пояса кристаллизации довольно четкие, образованы более чем одним рядом кристаллических структур.

4 балла - достоверно просматриваются признаки появления ячеистости:

- число сгруппированных в ячейки структур от 75 до 100% от общего количества;

- сгруппированные элементы занимают все поле зрения (при изучении не менее чем трех полей);

- очень четко выражены «дробность», «зернистость» картины;

- пояса кристаллизации образованы более чем одним рядом кристаллов, имеются на всей поверхности поля зрения, окружают «островки» полностью.

5 баллов - картина характеризуется следующими признаками:

- число сгруппированных в ячейки структур от 75 до 100% от общего количества;

- сгруппированные элементы занимают все поле зрения (при изучении нескольких, не менее чем трех полей зрения);

- очень четко выражена "дробность", "зернистость" картины;

- пояса кристаллизации образованы более чем одним рядом кристаллов, имеются на всей поверхности поля зрения, окружают "островки" полностью;

- присутствуют "разломы" картины (кроме фаций сыворотки крови, для которых данный феномен является самостоятельным диагностическим признаком).

7. Выраженность зон фации.

Выраженность отдельных зон кристаллизации - параметр, указывающий на четкость центральной, промежуточной и краевой (маргинальной) зоны в фации высушенной биологической жидкости. Выражается в баллах (от 0 до 3):

0 баллов - невозможность выделения зон кристаллоскопической фации;

1 балл - при малом увеличении светового микроскопа выделение зон неотчетливое, наблюдаются незначительные признаки зонализации;

2 балла - наличие зон фации четко определяется при малом увеличении микроскопа;

3 балла - четкая визуализация зон даже без микроскопа.

8. Четкость краевой зоны.

Выраженность четкости краевой белковой зоны указывает на относительное содержание в биологической среде компонентов с высокой молекулярной массой, прежде всего белкового состава. Данный показатель оценивается по 4-балльной шкале:

0 баллов - полное отсутствие краевой зоны, невозможно выделение краевой зоны под малым (меньше ×56) увеличением микроскопа;

1 балл - краевая зона присутствует нечетко и/или не на всем протяжении фации;

2 балла - при микроскопии по всему периметру микропрепарата отмечается наличие выраженной краевой зоны;

3 балла - соотношение «ширина краевой зоны: радиус фации» превышает 1:3;

4 балла - выраженная краевая зона в сочетании с наличием «разломов»;

5 баллов - краевая зона визуализируется даже без использования микроскопа.

9. Выраженность текстуры фации.

Рельефность текстуры позволяет оценить состояние и особенности фонового рисунка, на котором располагаются основные кристаллические и аморфные структуры. Оценивается по прямой 4-балльной схеме:

0 баллов - нет признаков наличия текстуры;

1 балл - едва заметные при микроскопии элементы (участки) текстуры;

2 балла - хорошо различимая при микроскопии текстура фации;

3 балла - визуализируемая без использования микроскопа текстура микропрепарата.

Описание тезиграфических фаций.

Для оценки результата сокристаллизации сыворотки крови свиней с 0,9% раствором хлорида натрия также применяют систему параметров, большинство из которых полностью аналогичны исследованию собственной кристаллизации (степень деструкции фации, равномерность распределения элементов, выраженность ячеистости, выраженность зон фации, четкость краевой зоны и выраженность текстуры фации). Кроме того, используются специальные показатели:

1. Основной тезиграфический коэффициент указывает на степень организации кристаллогенеза раствора хлорида натрия под воздействием биоматериала.

Расчет показателя производится по следующей формуле:

где А - количество центров кристаллизации в опытном образце, ед.; В - количество центров кристаллизации в контрольном образце, ед.

2. Коэффициент поясности демонстрирует степень гетерогенности изучаемого биосубстрата по критерию дисперсии молекулярных масс компонентов. В расчет принимаются диаметры наибольшего и наименьшего из имеющихся в образце поясов кристаллизации:

где d₁ - радиус минимального пояса кристаллизации, мм; d₂ - радиус максимального пояса кристаллизации, мм.

3. Кристалличность - аналог индекса структурности, применяемого в отношении кристаллоскопических фаций, позволяющий оценить сложность организации тезиграфической фации. Описание осуществляется по 6-балльной шкале:

0 баллов - фация полностью образована аморфными телами;

1 балл - большинство элементов, формирующих образец, имеют аморфное строение, но встречаются «островки» кристаллов, составляющие менее 30% от объема микропрепарата и количества фигур;

2 балла - большинство структур являются аморфными телами, но значительная часть образований - это моно- и поликристаллы (30-50% от объема микропрепарата и количества фигур);

3 балла - соотношение «аморфное вещество: кристаллические структуры» приближается или составляет 1:1;

4 балла - в фации преобладают кристаллические элементы, но присутствует и аморфный компонент;

5 баллов - фацию полностью образуют кристаллические структурные элементы.

Полученную совокупность значений и сами образцы сопоставляют с составленными на основании проведенного ранее исследования картинами собственной и инициированной кристаллизации и тезиокристаллоскопическим паттерном (совокупностью показателей кристаллографического исследования) (фиг.1; табл.1 и 2). При совпадении с паттерном не менее 6 показателей кристаллоскопии и тезиграфии констатируют наличие трихинеллеза.

Данный способ не требует специализированного оборудования и дополнительных реактивов, кроме светового микроскопа с увеличением не более ×56 и предметных стекол как для процедуры подготовки препаратов, так и для самого исследования, выполняется в течение 10-15 мин, прост в исполнении, экономичен.

Примеры.

Нами было проведено кристаллоскопическое и тезиграфическое исследование сыворотки крови здоровой свиньи и свиньи со спонтанным трихинеллезом. Наличие трихинеллеза подтверждено традиционными лабораторными методами (трихинеллоскопия).

При проведении кристаллоскопического исследования (табл.1, фиг.1) фация сыворотки крови здоровой свиньи была охарактеризована следующим образом: индекс структурности - 1 балл; кристаллизуемость - 3 балла (1); тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел - налипание; степень деструкции фации - 1 балл; равномерность распределения элементов - 4 балла; выраженность ячеистости - 1 балл; выраженность зон фации - 3 балла (2); четкость краевой зоны - 3 балла (3); выраженность текстуры фации - 1 балл (4). По результатам кристаллоскопии все показатели находятся вне пределов диагностического паттерна трихинеллеза, что подтверждено другими методами.

Данные кристаллоскопии сыворотки крови свиньи с трихинеллезом (табл.1, фиг.2): индекс структурности - 0 баллов; кристаллизуемость - 0 баллов; тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел - налипание; степень деструкции фации - 2 балла; равномерность распределения элементов - 2 балла; выраженность ячеистости - 3 балла; выраженность зон фации - 1 балл; четкость краевой зоны - 4 балла; выраженность текстуры фации - 0 баллов. По результатам кристаллоскопии все показатели находятся в пределах диагностического паттерна трихинеллеза, что подтверждено другими методами.

На основании результатов инициированной тезиграфии сыворотки крови здоровой свиньи установлено следующее (табл.2, фиг.3): основной тезиграфический коэффициент - 1,63 усл. ед.; коэффициент поясности - 1,125 уел ед.; степень деструкции фации - 1 балл; кристалличность - 1 балл (1); равномерность распределения элементов - 4 балла; выраженность ячеистости - 1 балл; выраженность зон фации - 2 балла (2); четкость краевой зоны - 3 балла (3); выраженность текстуры фации - 1 балл (4). По результатам тезиграфии все показатели находятся вне пределов диагностического паттерна трихинеллеза, что подтверждено другими методами.

Результаты тезиграфического анализа сыворотки крови свиньи с трихинеллезом (табл.2, фиг.4): основной тезиграфический коэффициент - 0,543 усл. ед.; коэффициент поясности - 1,5 усл. ед.; степень деструкции фации - 3 балла; кристалличность - 0 баллов (1); равномерность распределения элементов - 2 балла; выраженность ячеистости - 3 балла; выраженность зон фации - 0 баллов (2); четкость краевой зоны - 4 балла (3); выраженность текстуры фации - 1 балл (4). По результатам тезиграфии все показатели находятся в пределах диагностического паттерна трихинеллеза, что подтверждено другими методами.

Результат собственной и инициированной кристаллизации сыворотки крови здоровой и имеющей трихинеллез свиньи показал их четкие различия.

Литература:

1. Воробьев А.В., Алексеева О.П. Способ диагностики язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки. Изобретение 2194985 от 31.02.2001. - прототип.

2. Громова И.П. Кристаллоскопический способ изучения сыворотки крови в токсиколого-гигиеническом эксперименте методом «открытая капля» // Гигиена и санитария. - 2005. - №2. - С.66-69.

3. Залесский М.Г., Эммануэль В.Л., Краснова М.В. Физико-химические закономерности структуризации капли биологической жидкости на примере диагностикума «Литос-система» // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №8. - С.20-24.

4. Каликштейн Д.Б., Мороз Л.А., Квитко Н.Н. с соавт. Кристаллографическое исследование биологических субстратов // Клиническая медицина. - 1990. - №4. - С.28-31.

5. Мартусевич А.К. Количественная оценка результата свободного и инициированного кристаллогенеза биологических субстратов. Учебное пособие. Нижний Новгород: ФГУ «ННИИТО Росмедтехнологий», 2008. - 28 с.

6. Рапис Е.Г. Микрокристаллооптический способ использования стекловидного тела человека и животных в норме и при гемофтальме // Вестник офтальмологии. - 1976. - №4. - С.62-67.

7. Ruitenberg E.J., Van Knapen F. Enzyme Linked immunosorbent assay (ELISA) as a diadnostic method for T. spiralis in pigs // Vet. Parazitol. - 1973. - V.3(u). - P.317-326.

Таблица 1 Результат собственной кристаллизации сыворотки крови здоровых и имеющих трихинеллез свиней (кристаллоскопия) Параметр Здоровая свинья Свинья с трихинеллезом Диагностический паттерн Индекс структурности 1 0 0-0,5 Кристаллизуемость 3 0 0-0,5 Тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел налипание налипание Налипание Степень деструкции фации 1 2 2-2,5 Равномерность распределения элементов 4 2 1,5-2 Выраженность ячеистости 1 3 2,5-3 Выраженность зон фации 3 1 1-1,5 Четкость краевой зоны 3 4 4-4,5 Выраженность текстуры фации 1 0 0,5-1

Таблица 2 Результат инициированной кристаллизации сыворотки крови здоровых и имеющих трихинеллез свиней (тезиграфия, базисное вещество - 0,9% раствор хлорида натрия) Параметр Здоровая свинья Свинья с трихинеллезом Диагностический паттерн Основной тезиграфический коэффициент 1,63 0,543 0,538±0,067 Коэффициент поясности 1,125 1,5 1,411±0,052 Степень деструкции фации 1 3 2,5-3 Кристалличность 1 0 0-0,5 Равномерность распределения элементов 4 2 1,5-2 Выраженность ячеистости 1 3 3-3,5 Выраженность зон фации 2 0 0,5-1 Четкость краевой зоны 3 4 4-4,5 Выраженность текстуры фации 1 1 1-1,5

Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает микроскопирование образцов сыворотки крови. Полученную совокупность значений сопоставляют с тезиокристаллоскопическим паттерном. При этом используют одновременно данные кристаллоскопии и тезиграфии с применением количественных показателей по 9 параметрам, не менее 6 из которых раздельно для кристаллоскопии и тезиграфии должны находится в диапазоне установленных нормативов: кристаллоскопия - индекс структурности 0-0,5, кристаллизуемость - 0-0,5, тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел - налипание, степень деструкции фации 2-2,5, равномерность распределения элементов - 1,5-2, выраженность ячеистости 2,5-3, выраженность зон фации 1-1,5, четкость краевой зоны 4-4,5, выраженность текстуры фации 0,5-1; тезиграфия - основной тезиграфический коэффициент 0,538+0,067, коэффициент поясности 1,411+0,052, степень деструкции фации 2,5-3, кристалличность 0-0,5, равномерность распределения элементов 1,5-2, выраженность ячеистости 3-3,5, выраженность зон фации 0,5-1, четкость краевой зоны 4-4,5, выраженность текстуры фации 1-1,5. При совпадении с паттерном не менее 6 показателей кристаллоскопии и не менее 6 показателей тезиграфии констатируют наличие трихинеллеза. Способ обеспечивает эффективную диагностику трихинеллеза у свиней при экспериментальном и естественном их заражении. 2 табл., 4 ил.

Способ диагностики трихинеллеза свиней, отличающийся тем, что образцы сыворотки крови, в индивидуальном виде - собственная кристаллоскопия, и совместно с 0,9%-ным раствором хлорида натрия - инициированная тезиграфия, наносят в виде капли в объеме 0,1 мл на обезжиренное, сухое предметное стекло в горизонтальном положении и высушивают в горизонтальном потоке теплого воздуха, затем при суммарном увеличении ×56 микроскопируют, полученную совокупность значений и сами образцы сопоставляют с тезиокристаллоскопическим паттерном, при этом при диагностической оценке фаций сывороток используют одновременно данные кристаллоскопии и тезиграфии с применением количественных показателей по 9 параметрам, не менее 6 из которых раздельно для кристаллоскопии и тезиграфии должны находится в диапазоне установленных нормативов: кристаллоскопия - индекс структурности 0-0,5, кристаллизуемость - 0-0,5, тип взаимодействия кристаллов и аморфных тел - налипание, степень деструкции фации 2-2,5, равномерность распределения элементов - 1,5-2, выраженность ячеистости 2,5-3, выраженность зон фации 1-1,5, четкость краевой зоны 4-4,5, выраженность текстуры фации 0,5-1; тезиграфия - основной тезиграфический коэффициент 0,538+0,067, коэффициент поясности 1,411+0,052, степень деструкции фации 2,5-3, кристалличность 0-0,5, равномерность распределения элементов 1,5-2, выраженность ячеистости 3-3,5, выраженность зон фации 0,5-1, четкость краевой зоны 4-4,5, выраженность текстуры фации 1-1,5, и при совпадении с паттерном не менее 6 показателей кристаллоскопии и не менее 6 показателей тезиграфии констатируют наличие трихинеллеза.