ТЕРМОСЕНСИБИЛИЗАТОР ДЛЯ ЛАЗЕРНОЙ ГИПЕРТЕРМИИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2013 года по МПК A61N5/67 B82B1/00 A61K31/13 A61K31/375 A61K31/74 A61K33/38 A61P35/00 

Изобретение относится к нанотехнологии новых материалов, предназначенных для использования в биологии, ветеринарии и медицине.

Лазерная гипертермия - способ лечения (удаления) новообразований, основанный на лазерном нагреве опухолей. Для повышения эффективности лазерной гипертермии используются термосенсибилизаторы - вещества, способные эффективно поглощать лазерное излучения и конвертировать его в тепло. Для реальных применений предпочтительными является использование термосенсибилизаторов, поглощающих свет в инфракрасной области (700-1000 нм), где поглощение самих биотканей минимально (Tuchin V.V. Tissue Optics: Light Scattering Methods and Instruments for Medical Diagnosis. - Bellingham: SPIE Press, 2000 - 942 p.). Известны термосенсебилизаторы инфракрасного диапазона на основе наночастиц различной формы и состава, включая золотые нанооболочки (Терентюк Г.С., Акчурин Г.Г., Богатырев В.А., Максимова И.Л., Маслякова Г.Н., Хлебцов Б.Н., Хлебцов Н.Г., Шантроха А.В. Способ селективного разрушения меланомы. Патент на изобретение №2347563, дата приоритета 21.11.2007, опубликовано 27.02.2009, Бюл. №6), наночастицы фотосенсибилизаторов (Коган Б.Я., Бутенин А.В., Ворожцов Г.Н., Золотавкина Ю.Б., Лукьянец Е.А., Негримовский В.М., Панкратов А.А., Пучнова В.А., Фейзулова Р.К. - Г., Чиссов В.И., Якубовская Р.И. Способ подавления роста опухолей. Патент на изобретение №2339414, дата приоритета 2007.03.27, опубликовано 2008.11.27).

Недостатками этих частиц являются большие геометрические размеры (более 100 нм) и склонность к агрегации, что может служить препятствием для создания лекарственных форм вследствие низкой стабильности коллоидов при хранении.

Наиболее близким к заявляемому решению является индуцированный «зародышами» способ синтеза золотых наностержней с поглощением в инфракрасной области и геометрическими размерами менее 100 нм на основе мягких матриц (Nikoobakht В., El-Sayed M.A. Preparation and growth mechanism of gold nanorods using seed-mediated growth method // Chem. Mater. - 2003. - V.15. - P.1957-1962.). Синтез золотых наностержней проводится в два этапа, на первом этапе получают золотые сферические наночастицы диаметром 1-3 нм. На втором этапе последовательно смешивают водные растворы цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ), нитрата серебра (НС), золотохлористоводородной кислоты (ЗХВК), аскорбиновой кислоты (АА) и золотых наночастиц малого диаметра (НЧ) в молярном соотношении компонентов ЦТАБ 1/НС 2-10×10^-4/3ХВК 5×10^-3/АА 5.5×10^-3/НЧ 3×10^-6.

Недостатком способа является плохая воспроизводимость методики синтеза.

Получаемые данным способом термосенсибилизаторы (золотые наностержни) имеют толщину 12-15 нм и длину 30-100 нм, при этом поверхность золотых наностержней покрыта молекулами цетилтриметламмониибромида (ЦТАБ), которые являются потенциально токсичными.

Задачей настоящего изобретения является создание нового класса биосовместимых термосенсибилизаторов на основе золотых наностержней с поглощением в инфракрасной области и геометрическими размерами менее 50 нм.

Технический результат заключается в повышении стабильности и воспроизводимости синтеза золотых наностержней с поглощением в ИК-области прозрачности биотканей, а также снижении токсичности термосенсибилизатора, полученного заявляемым способом.

В предлагаемом решении предлагается способ, отличающийся от известных концентрациями реагентов, рН реакционной смеси и поверхностной функционализацией частиц.

Способ синтеза термосенсибилизатора заключается в следующем. На первом этапе синтезируются золотые сферические частицы диаметром 1-3 нм, которые используются в качестве шаблона для дальнейшего роста несферических частиц. На втором этапе проводится дополнительное восстановления золота аскорбиновой кислотой на частицах в среде цетилтриметиламмоний бромида в кислой среде (рН 1). На третьем этапе молекулы цетилтриметиламмоний бромида на поверхности частиц замещаются на полиэтиленгликоль для снижения биотоксичности золотых наностержней.

Указанный технический результат достигается тем, что способ получения термосенсибилизатора инфракрасного диапазона, включающий приготовление смеси водных растворов цетилтриметиламмонийбромида, нитрата серебра, золотохлористоводородной кислоты, аскорбиновой кислоты в молярном соотношении: цетиллтриметиламмонийбромид - 1, нитрат серебра - 10×10^-4 25×10^-6, золотохлористоводородная кислота - 5×10^-3, аскорбиновая кислота - 5.5×10^-3, с последующим добавлением золотых сферических наночастиц диаметром 1-3 нм, согласно решению после аскорбиновой кислоты добавляют соляную кислоту в молярном соотношении к цетилтриметиламмонийбромиду 0.1, золотые наночастицы добавляют в молярном соотношении к цетилтриметиламмонийбромиду 25×10^-6, а через временной интервал не менее 24 часов после добавления золотых наночастиц добавляют тиолированный полиэтиленгликоль. Термосенсибилизатор для лазерной гипертермии новообразований, представляющий собой суспензию золотых наностержней, согласно решению стержни выполнены длиной 30-45 нм, толщиной 9-12 нм, и снабжены покрытием из молекул полиэтиленгликоля.

Ниже представлен пример реализации протокола для объема суспензии термосенсибилизатора 100 мл. Способ может быть масштабирован на любой объем образца.

Используются следующие реактивы: нитрат серебра AgNO₃ (>99.9%, Aldrich, 20.913-9), цетилтриметиламмонийбромид (96%, Fluka, №52370), золотохлористоводородная кислота (HAuCl₄, >99%, Aldrich), изоаскорбиновая кислота (AsA, >99%, Fluka), боргидрид натрия (Sigma-Aldrich), соляная кислота (ОСЧ, Вектон), поташ (ОСЧ, Реахим), полиэтиленгликоль-тиол (Mw=5000, Nektar), вода очищенная.

Этап 1 - синтез золотых наночастиц малого размера («зародышей»)

Смешать последовательно 1 мл 0.1 М цетилтриметиламмонийбромида, 25 мкл 10 мМ HAuCl₄ и 100 мкл 10 мМ раствора боргидрида натрия. После добавления HAuCl₄ раствор СТАВ меняет цвет с бесцветного на желтый, после добавления боргидрида натрия цвет немедленно изменяется на бледно-коричневый, что свидетельствует об образовании золотых наночастиц диаметром 1-3 нм. Зародышевый раствор оставляли без перемешивания, не закрывая крышку на 30-120 минут. Зародыши необходимо использовать в экспериментах в указанный промежуток времени, т.к. в дальнейшем происходит их агрегация, которую можно визуально наблюдать по смене цвета суспензии с бледно-коричневого на розовый.

Этап 2 - синтез золотых наностержней

К 100 мл 0.1 М раствора цетилтриметиламмонийбромида добавить последовательно 2 мл 4 мМ раствора нитрата серебра, 5 мл 10 мМ раствора HAuCl₄, 1 мл 100 мМ раствора аскорбиновой кислоты, 1 мл 1 М соляной кислоты, 1 мл золотых наночастиц, полученных на предыдущем этапе. Полученную суспензию выдержать при 28°С в течение 240 часов.

Этап 3 - функционализация полиэтиленгликолем

Суспензию золотых наноетержней, полученных на предыдущем этапе, центрифугировать при 14000 g 1 час. Осадок, содержащий наночастицы, растворить в том же объеме воды. К 100 мл суспензии наночастиц добавить 1 мл 0.2 М раствора поташа и 1 мл 1 мМ раствора тиолированного полиэтиленгликоля. Суспензию выдержать 12 часов при 28°С. Суспензию золотых наностержней, центрифугировать при 14000 g 1 час. Осадок, содержащий термосенсибилизатор, растворить в 100 мл воды. Повторить процедуру центрифугирования-перерастворения 5 раз.

Изобретение поясняется чертежами.

Доказательство успешной реализации предлагаемого решения дано на фиг.1, где приведены электронно-микроскопические изображения полученных наночастиц. Видно, что частицы имеют форму стержня. Анализ электронно-микроскопических изображений показывает, что частицы имеют толщину 10-12 нм и длину 38±5 нм.

Доказательство наличия поглощения термосенсибилизатора в инфракрасной области дано на фиг.2, где представлены спектры оптической плотности (измеренные на спектрофотометре в 2 мм кювете) полученного термосенсибилизатора. Максимум поглощения, соответствует плазменному резонансу наночастиц (800±10 нм).

Доказательство фототермического эффекта при облучении фотосенсибилизатора светом инфракрасного диапазона представлено на фиг.3, где приведена кинетика нагрева под действием лазерного излучения (плотность мощности 1 Вт/см², длина волны 810 нм) пробирки эппендорф, содержащей термосенсибилизатор, в сравнении с аналогичной кинетикой для пробирки с водой. Наблюдалась разница в температуре 50°С через 200 минут облучения.

Доказательством возможности использования термосенсибилизатора для лазерной гипертермии является ниже приведенное исследование.

Исследование проводилось на линейных мышах Balb/c (женские особи), возраст 3 месяца, массой 20-22 г. Животные содержались в соответствии с «Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей» (Страсбург, 1986). До и в период эксперимента мыши находились в виварии при температуре воздуха +20-22°С, влажности - не более 50%, объеме воздухообмена (вытяжка: приток) - 8:10, в световом режиме день-ночь, в стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой и получали стандартный рацион (гранулированный корм ПК120-3 согласно приказу №1179 МЗ СССР от 10.10.1983). Каждому животному подкожно перевивалась асцитная опухоль Эрлиха в объеме 0.2 мл. Перевивание осуществлялось в стерильных условиях в специальном боксе, по стандартной методике. Для исследования эффективности гипертермии было сформировано 3 группы животных по 14 мышей в каждой. На 11 сутки после перевивания опухолей животным первой экспериментальной группы вводилось в хвостовую вену по 0.4 мл раствора наностержней, животным первой и второй контрольных групп вводилось по 0.4 мл физиологического раствора. Спустя сутки после введения наночастиц проводился сеанс лазерной гипертермии животным экспериментальной группы и животным первой контрольной группы. Расстояние от торца волокна до объекта 27 мм, выходная мощность лазера 1.2 Вт, полупроводниковый лазер LIMO. Площадь пятна 0.3 см², диаметр пятна 6 мм, рабочий ток лазера 10.4 А. Плотность мощности 4 Вт/см². Температура регистрировалась каждые 10 секунд тепловизором, продолжительность нагрева 5 минут. Вторая контрольная группа не подвергалась лазерному воздействию. На Фиг.4 представлена динамика нагрева при внутривенном (в/в) введении наностержней. 1 - опухолевая ткань в/в введение наночастиц, 2 - здоровая ткань в/в введение наночастиц, 3 - контроль без введения частиц. Видно, что в результате пассивного селективного накопления наностержней в опухолевой ткани нагрев в ней значительно (на 30 градусов) выше, чем нагрев соседнего участка здоровых тканей у того же животного. Для контроля измерялась температура поверхности кожи без введения наночастиц, как над опухолевыми тканями, так и окружающих здоровых участков. Значимых различий в нагреве здоровых и опухолевых участков без введения наночастиц не выявлено. При внутривенном введении наностержней при нагреве здоровых тканей их температура превышала контрольные значения на 5-7 градусов. Основное повышение температуры биоткани с наночастицами происходит в первые 100 секунд лазерного нагрева, а затем скорость повышения температуры значительно уменьшается.

На фиг.5 представлены результаты термографических измерений двумерного распределения температуры на поверхности тела лабораторных животных при лазерном нагреве. Тепловизор при измерениях находился в одном и том же фиксированном положении. Представлено 2D распределение температуры на поверхности кожи лабораторного животного при лазерном воздействии с наночастицами, а - до нагрева, б - нагрев продолжительностью 1 минута, в - нагрев продолжительность 5 минут.

Размеры опухолей фиксировались непосредственно перед сеансом лазерной гипертермии и с интервалом 3 дня в течение трех недель после сеанса гипертермии. Средний размер опухоли перед лазерным воздействием составлял 1.7±0.3 см³. Лазерное воздействие с наностержнями, сопровождавшееся более значительным повышением температуры, привело к уменьшению средних размеров опухолей 0.4±0.1 см³, наиболее значительному на 9-12 день после воздействия. У животных контрольной группы с лазерным воздействием в диапазоне около 40°С наблюдалась стимуляция роста опухолей до 3.2±0.7 см³. В контрольной группе без воздействия 2.7±0.7 см³.

Доказательство снижения токсичности термосенсибилизатора на основе покрытых полиэтиленгликолем наночастиц по сравнению с наностержнями, содержащими цетиллтриметиламмонийбромид проводилось путем исследования выживаемости клеток HeLa при инкубации с различивши концентрациями образцов. Клеточные суспензии разделялись на три группы по 5 образцов в каждой. 1 Группа: к 1 мл клеточной суспензии, содержащей 10⁴ клеток добавлялось 1, 2, 5, 10, 50 мкл исследуемого термосенсибилизатора. 2 Группа: к 1 мл клеточной суспензии, содержащей 10⁸ клеток добавлялось 1, 2, 5, 10, 50 мкл суспензии наностержней покрытых ЦТАБ. 3 Группа: контроль - клеточные суспензии без добавления наночастиц. Клеточные суспензии инкубировались 1 час при 37°С в CO₂ инкубаторе. Выживаемость клеток определялась с помощью МТТ-теста (Barbari M., Kraljevi S., Grce M., Zork B.Novel 1, 2, 5-oxadiazine derivatives - Synthesis and in vitro biological studies // Acta Pharm. - 2003. - V.53. - P.175-186). На фиг.6 представлены результаты выживаемости клеток - контрольной группы, после инкубации с термосенсибилизатором и после инкубации с суспензией наностержней, покрытых цетилтриметиламмоний бромидом. Видно существенное снижение токсического действия наностержней; не обнаружено достоверных отличий в выживаемости клеток после инкубации с термосенсибилизатором по сравнению с контрольной группой клеток.

Отличительные признаки предлагаемого решения обеспечивают следующие преимущества:

- Способ синтеза золотых наностержней позволяет получить наночастицы с размером менее 50 нм и резонансным поглощением света в инфракрасной области, которые могут использоваться для лазерной гипертермии новообразований.

- Функционализация наночастиц молекулами полиэтиленгликоля позволяет увеличить биосовместимость термосенсибилизатора.

Изобретение относится к нанотехнологии новых материалов, предназначенных для использования в биологии, ветеринарии и медицине, в частности для лазерной гипертермии новообразований. Предлагается способ, отличающийся от известных концентрациями реагентов, рН реакционной смеси и поверхностной функционализацией частиц. На первом этапе способа синтезируют золотые сферические частицы диаметром 1-3 нм, которые используются в качестве шаблона для дальнейшего роста несферических частиц. На втором этапе проводят дополнительное восстановление золота аскорбиновой кислотой на частицах в среде цетилтриметиламмоний бромида в кислой среде (рН 1). На третьем этапе молекулы цетилтриметиламмоний бромида на поверхности частиц замещаются на полиэтиленгликоль для снижения биотоксичности золотых наностержней. В способе используют компоненты в определенных молярных соотношениях. Предложен также термосенсибилизатор, который получают указанным способом, и представляющий собой суспензию золотых наностержней. Стержни выполнены длиной 30-45 нм, толщиной 9-12 нм и снабжены покрытием из молекул полиэтиленгликоля. Изобретение обеспечивает повышение стабильности и воспроизводимости синтеза золотых наностержней с поглощением в ИК-области прозрачности биотканей, а также снижение токсичности термосенсибилизатора. 2 н.п. ф-лы, 6 ил.

1. Способ получения термосенсибилизатора инфракрасного диапазона для лазерной гипертермии новообразований, включающий приготовление смеси водных растворов цетилтриметиламмонийбромида, нитрата серебра, золотохлористоводородной кислоты, аскорбиновой кислоты в молярном соотношении:
цетиллтриметиламмонийбромид 1 нитрат серебра 10·10^-4 золотохлористоводородная кислота 5·10^-3 аскорбиновая кислота 5,5·10^-3,

с последующим добавлением золотых сферических наночастиц диаметром 1-3 нм, отличающийся тем, что после аскорбиновой кислоты добавляют соляную кислоту в молярном соотношении к цетилтриметиламмонийбромиду 0,1, золотые наночастицы добавляют в молярном соотношении к цетилтриметиламмонийбромиду 25·10^-6, а через временной интервал не менее 24 ч после добавления золотых наночастиц добавляют тиолированный полиэтиленгликоль.

2. Термосенсибилизатор инфракрасного диапазона для лазерной гипертермии новообразований, представляющий собой суспензию золотых наностержней, отличающийся тем, что стержни получены способом по п.1 и выполнены длиной 30-45 нм, толщиной 9-12 нм и снабжены покрытием из молекул полиэтиленгликоля.