СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАКОВЫХ КЛЕТОК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ ВЕНОЗНОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХ С ПОДОЗРЕНИЕМ НА ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫЕ НОВООБРАЗОВАНИЯ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/574 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в лабораторных методах исследования при проведении первичной диагностики на злокачественные новообразования.

Современные достижения науки и техники существенно расширили возможности распознавания злокачественных новообразований. Тем не менее, несмотря на широкий арсенал вспомогательных методов исследования, врач зачастую по прежнему испытывает существенные затруднения в постановке правильного диагноза, что в конечном итоге отражается на результатах лечения.

Злокачественные новообразования в крови могут приводить к развитию метастазов у больных пациентов, которые могут быть выявлены при распространении раковой опухоли за пределы пораженного органа, частицы которой являются хрупкими и редкими и плохо определяются с помощью существующих методик.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению является способ выявления раковых клеток в крови в Массачусетской больнице (США). Способ заключается в выявлении, изолировании и подсчитывании количества раковых клеток в крови больных пациентов с помощью высокочувствительного микрочипа, а также наблюдении за их динамикой в процессе лечения. При практическом применении на поверхность силиконового чипа размером с пластиковую карточку наносят антитела, которые способны распознать белок, имеющийся в большинстве раковых опухолей. При движении крови вдоль силиконового чипа, на его поверхность притягиваются имеющиеся в крови опухолевые клетки наподобие клея. С помощью микрочипа можно обнаруживать опухолевые раковые клетки крови, содержащиеся в 8-мл пробирке с кровью больного пациента (см. по материалам Nature 450, 1235-1239 (20 Dec. 2007), doi: 10.1038/nature 06385, Letters to Editor.)

Однако данный способ является достаточно дорогим, трудоемким и длительным.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка способа определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования для прогнозирования развития и выяснения причин заболевания, своевременности начала лечения и его успешного исхода.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в сокращении времени обследования, в быстроте определения первичного диагноза у больного, в простоте выполнения и доступности способа определения опухолевых клеток в периферической венозной крови, не снижая точности его исследования, повышении процента морфологического подтверждения диагноза на злокачественные новообразования.

Технический результат предлагаемого изобретения достигается тем, что в способе определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования, предусматривающем взятие крови у обследуемого больного в количестве 8 мл, согласно изобретению взятие крови осуществляют из локтевой вены обследуемого больного, независимо от приема им пищи, затем кровь разводят 1 мл цитрата натрия, в соотношении кровь : цитрат натрия 8:1, для определения опухолевых клеток создают давление в искусственной среде, необходимое для прохождения всей исследуемой крови через калиброванный фильтр, при этом опухолевые клетки задерживаются в осадке на калиброванном фильтре, осадок наносят на предметные стекла, которые предварительно обезжиривают и охлаждают для лучшего прилипания опухолевых клеток и высыхания, затем фиксируют мазки - отпечатки трехпроцентным спиртовым раствором Лейшмана в течение 2-4 минут, далее смывают дистиллированной водой и красят азур-эозиновой смесью в соотношении 3:1 продолжительностью 6-8 минут, после покраски промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе, приступают к просмотру под микроскопом и выявляют наличие в периферической крови опухолевых клеток.

Отличительной особенностью предлагаемого способа по сравнению с известным зарубежным способом определения раковых клеток в крови является принципиально иной механизм выявления опухолевых клеток в периферической венозной крови больного, исключается влияние фактора внешней температуры на результат исследования. Предлагаемое изобретение обеспечивает широкую доступность, простоту выполнения и быстроту получения результата исследования.

Предлагаемое изобретение, по мнению авторов, соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как совокупность существенных отличительных признаков, изложенных в формуле изобретения, позволяет достигнуть технический результат, заключающийся в сокращении времени обследования, быстром определении первичного диагноза у больного, в простоте выполнения и доступности способа определения опухолевых клеток в периферической венозной крови у больных, без снижения точности исследования, в морфологическом подтверждении диагноза злокачественных новообразований и как следствие в повышении своевременной выявляемости, снижении запущенности, годичной летальности от злокачественных новообразований.

Из уровня техники авторы не обнаружили сведения, содержащие совокупность признаков, сходных или эквивалентных заявляемым.

Предлагаемое изобретение поясняется чертежами, где на фиг.1 изображено устройство для определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования, на фиг.2 изображен вид сверху пластмассовой решетки с калиброванным фильтром, на фиг.3 изображен вид снизу пластмассовой решетки с калиброванным фильтром, на фиг.4 - фото, где изображено цитологическое исследование фильтрата крови больного С, 54 лет к примеру 1 описания способа, на фиг.5 - фото, где изображено цитологическое исследование фильтрата крови больной А., 71 лет к примеру 2 описания способа, на фиг.6 - фото, где изображено цитологическое исследование фильтрата венозной крови больной Ц., 52 лет к примеру 4 описания способа, на фиг.7 - фото, где изображено цитологическое исследование фильтрата венозной крови больного И., 59 лет к примеру 5 описания способа, на фиг.8 - фото, где изображено цитологическое исследование фильтрата венозной крови больной Н., 54 лет к примеру 6 описания способа.

Устройство содержит стеклянный цилиндр 1, который заключен в пластиковый кожух 2, у последнего имеются две трубки 3 и 4. Нижняя трубка 4 предназначена для подачи в полость пластикового кожуха 2 воды, предварительно нагретой до +36°С, а верхняя трубка 3 предназначена для выхода воздуха из пластикового кожуха 2. На дне стеклянного цилиндра установлена пластмассовая решетка 5 с закрепленным на ней с помощью металлического кольца 6 калиброванным фильтром 7. Диаметр пор у калиброванного фильтра 7 равен 5 мкм, что соответствует основному диаметру капиллярного русла. Внутри стеклянного цилиндра 1 установлен поршень 8 со штоком 9, который ввинчен не до упора. В поршне 8 выполнены два разных по диаметру канала 10, на стыке которых расположен металлический шарик 11, выполняющий назначение выпускного клапана для воздуха. Стеклянный цилиндр 1 имеет верхнее входное отверстие 12 для подачи венозной крови и нижнее выходное отверстие 13 для оттока венозной крови, последнее снабжено приспособлением 14 для осуществления положений «открыто» и «закрыто». Трубки 3 и 4 пластикового кожуха 2 снабжены пробками 15, 16.

Заявляемый способ определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования осуществляется следующим образом.

Перед исследованием крови осуществляют сборку устройства для определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования. На дно стеклянного цилиндра 1, заключенного в пластиковой кожух 2, помещают пластмассовую решетку 5 с закрепленным на ней с помощью металлического кольца 6 калиброванным фильтром 7.

Для проведения гемофильтроцитологического исследования периферической венозной крови больного в прозрачный пластиковый кожух 2 через нижнюю трубку 4 подают воду, предварительно нагретую до +36°С. При положении «закрыто» приспособления 14 нижнего выходного отверстия 13 в стеклянный цилиндр 1 через верхнее входное отверстие 12 наливают из пробирки венозную кровь, взятую из локтевой вены обследуемого больного, независимо от приема им пищи, в количестве 8 мл, которую разводят в 1 мл цитрата натрия, в соотношении кровь: цитрат натрия 8:1. В стеклянный цилиндр 1 вводят поршень 8 со штоком 9, ввинченным не до упора. Поршень 8 продвигают до уровня жидкости в стеклянном цилиндре 1, при этом воздух из цилиндра 1 выпускают через каналы 10 в поршне 8 с помощью металлического шарика 11, выполняющего назначение выпускного клапана. Затем шток 9 завинчивают до упора в поршне 8 и зажимают металлический шарик 11 (выпускной клапан закрыт). Далее приспособление 14 нижнего выходного отверстия 13 стеклянного цилиндра 1 ставят в положение «открыто» и пропускают всю исследуемую венозную кровь через калиброванный фильтр 7, при этом происходит задержка раковых клеток в осадке на калиброванном фильтре. Осадок наносят на предметные стекла, которые предварительно обезжиривают и охлаждают для лучшего прилипания клеток и высыхания. Фиксируют мазки - отпечатки трехпроцентным спиртовым раствором Лейшмана в течение 2-4 минут. Затем смывают дистиллированной водой и красят азур-эозиновой смесью в соотношении 3:1 продолжительностью 6-8 минут. После покраски промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе и приступают к просмотру под микроскопом и выявляют наличие в периферической крови опухолевых клеток.

Примеры, подтверждающие выполнение способа определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования.

Пример 1.

Больной С, 54-х лет, поступил во II хирургическое отделение республиканского онкологического диспансера 08.04.08 г. с направительным диагнозом: рак желудка?

Диагноз был вынесен на основании клинико-объективных данных и с учетом результатов инструментальных методов обследования. Данные рентгеноскопии и ФГДС не исключали наличия у больного каллезной язвы тела желудка. При стационарном дообследовании больному 11.04.08 г.проведено гемофильтроцитологическое исследование периферической венозной крови №2670, где выявлены опухолевые клетки (см. фиг.4 - фото). Для чего у больного из локтевой вены берут 8 мл крови, независимо от приема им пищи. Взятую кровь 8 мл разводят 1 мл цитрата натрия, в соотношении кровь: цитрат натрия 8:1. Для определения раковых клеток в крови создают давление в искусственной среде, необходимое для прохождения всей исследуемой крови, с помощью устройства (см. фиг.1). Исследуемую кровь пропускают через калиброванный фильтр 7 устройства, при этом происходит задержка раковых клеток в осадке на калиброванном фильтре 7. Осадок наносят на предметные стекла, которые предварительно обезжиривают и охлаждают для лучшего прилипания клеток и высыхания, затем фиксируют мазки-отпечатки трехпроцентным спиртовым раствором Лейшмана в течение 2 минут, далее смывают дистиллированной водой и красят азур-эозиновой смесью в соотношении 3:1 продолжительностью 6 минут. После покраски промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе и приступают к просмотру под микроскопом.

На фиг.4 - фото видно, что на фоне эритроцитов опухолевая клетка с крупным ядром. Ядро занимает почти всю клетку, нарушено ядерно-цитоплазматическое соотношение. Контуры ядра неровные, хроматин пылевидный, неравномерно распределенный. Цитоплазма в виде узкого ободка. Выявленная клетка по цитоморфологическим признакам характерна для железистого рака.

Больной 12.04.08 г.оперирован: на операции подтвержден рак нижней трети тела желудка II стадии и выполнена субтотальная резекция желудка. Послеоперационный период протекал без осложнений. Выписан с улучшением.

В этом примере, проведенное гемофильтроцитологическое исследование периферической венозной крови, помогло установить больному правильный диагноз на ранней стадии онкопроцесса и провести ему радикальное оперативное лечение с благоприятным клиническим прогнозом.

Пример 2.

Больная А., 71 год, поступила во II хирургическое отделение республиканского онкологического диспансера 19.05.08 г. с подозрением на рак тела желудка. Больную беспокоили отсутствие аппетита, боли в эпигастрии и общая слабость. При поступлении состояние средней степени тяжести, правильного телосложения, пониженного питания. Периферические лимфоузлы не увеличены. При проведенном 19.05.08 г. цитологическом исследовании биопсийного материала, полученного при ФГДС, опухолевых клеток не обнаружено.

Больной 20.05.08 г. было выполнено гемофильтроцитологическое исследование периферической венозной крови № 3598, аналогично примеру 1, при фиксировании мазков-отпечатков трехпроцентным спиртовым раствором Лейшмана в течение 3 минут и покраске азур-эозиновой смесью в соотношении 3:1 продолжительностью 7 минут.

Заключение: «Аденокарцинома» (см. фиг.5 - фото), где на фоне эритроцитов обнаружена двухядерная опухолевая клетка. Ядра инвагинированные, структура хроматина грубозернистая, определяются ядрышки. Ядра расположены эксцентрически. Цитоплазма расплывчатая без четких границ. Выявленная клетка по цитоморфологическим признакам характерна для аденокарциномы.

При лапаротомии 22.05.08 г. была обнаружена раковая опухоль тела желудка III стадии. Выполнена операция чрезбрюшинная гастроэктомия. Заживление послеоперационной раны первичным натяжением. Больная была выписана в удовлетворительном состоянии.

Определение раковых клеток в венозной крови у больной позволило получить морфологическое подтверждение диагноза рака желудка и провести своевременное радикальное оперативное вмешательство.

Пример 3.

Больного К., 60-ти лет, переводят во II хирургическое отделение республиканского онкодиспансера из городской инфекционной больницьг с диагнозом: рак головки поджелудочной железы, обтурационная желтуха. Из анамнеза известно, что в конце января 2008 г. появились жалобы на вялость, снижение аппетита. В середине марта 2008 г. присоединилась желтуха, которая быстро нарастала. При поступлении состояние средней степени тяжести. Отмечается интенсивная желтушность склер и кожных покровов. Пальпация области правого подреберья безболезненная. Определить дно желчного пузыря не представляется возможным. Печень на 2 см выступает из под края реберной дуги.

Результаты лабораторных исследований: Нв - 138 г/л, Л - 6,9·10⁹ ммоль/л, СОЭ - 20 мм/час, общий билирубин крови - 180,3 ммоль/л, ACT - 1,70 ммоль/л, АЛТ - 2,70 ммоль/л, сулемовая проба - 1,6 мл, тимоловая проба - 20 ед., сахар крови - 8,7 ммоль/л, калий крови - 3,5 ммоль/л, натрий крови - 136,8 ммоль/л, кальций крови - 2,26 ммоль/л, холестерин крови - 8 ммоль/л.

Перед операцией 14.04.08 г. провели гемофильтроцитологическое исследование периферической венозной крови больного, аналогично примеру 1, при фиксировании мазков-отпечатков трехпроцентным спиртовым раствором Лейшмана в течение 4 минут и покраске азур-эозиновой смесью в соотношении 3:1 продолжительностью 8 минут. Проведенное обследование не выявило опухолевых клеток.

16.04.08 г. больному выполнена лапаротомия. Результаты интраоперационной ревизии как бы подтвердили диагноз: злокачественная опухоль головки поджелудочной железы, третья стадия. По поводу обтурационной желтухи была произведена операция - холецистоэнтеростомия с межкишечным соустьем. Взята интраоперционная биопсия из опухоли головки поджелудочной железы. В послеоперационном периоде состояние больного значительно улучшилось. Поступило патогистологическое заключение операционного материала №21654-55 от 29.04.08 г. «Злокачественного роста в головке поджелудочной железы не обнаружено. Хронический панкреатит». При выписке у больного заключительный клинический диагноз: Хронический индуративный панкреатит. Таким образом, в данном примере, проведенное больному гемофильтроцитологическое исследование периферической венозной крови, в совокупности с клиническими данными, результатом ПТЗ операционного материала послужило обоснованием для вынесения заключительного клинического диагноза.

Пример 4.

Больная Ц., 52 лет поступила во II хирургическое отделение республиканского онкодиспансера 29.04.08 г. с направительным диагнозом: «Малигнизированная язва желудка».

Диагноз был вынесен на основании результатов ФГДС и рентгеноскопии желудка с учетом клинико-объективных данных. При дообследовании в стационарных условиях 30.04.08 больной проведено определение раковых клеток аналогично примеру 1 - гемофильтроцитологическое исследование венозной крови № 2861, где выявлены опухолевые клетки (см. фиг.6 - фото). На фото видно, что среди эритроцитов опухолевая клетка крупного размера с эксцентрично расположенным крупным ядром. Контуры ядра неровные, хроматин мелкозернистый, глыбчатый, неравномерно распределенный. В ядре определяются два полимерных ядрышка. Заключение: аденокарцинома.

Больная 05.05.08 г. оперирована: на операции обнаружен рак выходного отдела желудка третьей стадии и выполнена субтональная резекция желудка. Послеоперационный период протекал без осложнений. В данном примере проведенное гемофильтроцитологическое исследование венозной крови помогло установить больной правильный диагноз и провести ей радикальное оперативное лечение.

Пример 5.

Больной И., 59 лет переведен из городской больницы скорой медицинской помощи во 11 хирургическое отделение республиканского онкодиспансера 16.05.08 г. с подозрением на рак нижней трети тела желудка. Проведенные инструментальные методы исследования (рентгеноскопия желудка и фиброизофагогастроскопия) не исключали новообразование желудка.

19.05.08 г. больному было выполнено гемофильтроцитологическое исследование венозной крови № 3563, аналогично примеру 1. Заключение: железистый рак (см. фиг.7 - фото). На фото показано, что среди эритроцитов две опухолевые клетки больших размеров с полиморфными неровными контурами ядер. Хроматин мелкозернистый. Цитоплазма вакуолизированная. Заключение: железистый рак.

23.05.08 г. больному выполнена верхнесрединная лапоротомия, при ревизии органов брюшной полости обнаружен рак антрального отдела желудка, проведена операция в объеме субтональной резекции желудка по Бильрот - 11. Заживление послеоперационной раны первичным натяжением. Больной выписан в удовлетворительном состоянии. В данном случае проведенное гемофильтроцитологическое исследование венозной крови способствовало установлению больному правильного диагноза и своевременному оперативному лечению.

Пример 6.

Больная Н., 54 лет поступила на стационарное лечение во II хирургическое отделение 10.10.08 г. с направительным диагнозом: рак выходного отдела желудка?

Больной было выполнено стационарное дообследование, в том числе и гемофильтроцитологическое исследование венозной крови №7468, аналогично примеру 1. Заключение: аденокарцинома.

После предварительной предоперационной подготовки 16.10.08 г. больной выполнена операция: субтональная резекция желудка по Бильрот-11 по поводу выявленного после лапоротомии и ревизии рака желудка третьей стадии. Проведенное гемофильтроцитологическое исследование венозной крови помогло установить больной правильный диагноз: рак желудка (см. фиг.8 - фото) и провести оперативное вмешательство в радикальном объеме. На фото можно видеть, что шесть опухолевых клеток мелких размеров с крупными, вариабельными ядрами. Контуры ядер неровные. В трех клетках отмечается эксцентричность расположения ядер. Хроматин неравномерно распределенный, комковатый. Заключение: аденокарцинома.

В целом, проведенное у 31 пациента гемофильтроцитологическое исследование выявило во всех случаях наличие в периферической венозной крови опухолевых клеток.

Предлагаемое изобретение «Способ определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования» по сравнению с зарубежным прототипом (см. по материалам Nature 450, 1235-1239 (20 Dec. 2007), doi: 10.1038/ nature 06385, Letters to Editor.) имеет следующие преимущества:

- простота выполнения способа определения раковых клеток в периферической венозной крови у обследуемых больных позволяет ему быть широко доступным для общей лечебной сети медицинских учреждений;

- быстрота получения результатов исследования позволяет данному способу исследования быть действительно скрининговым;

- достоверный метод определения раковых клеток в периферической венозной крови позволяет повысить процент морфологического подтверждения диагноза и раннюю выявляемость новообразований, тем самым в 2 раза снизить финансовые затраты на специальное лечение онкологических больных.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость», так как может быть использовано для обследования больных и постановки своевременного диагноза в лабораториях поликлиник города, сельской местности, хирургических отделениях ЛПУ.

Изобретение относится к медицине и касается способа определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования. Сущность способа заключается в том, что для проведения исследования берут кровь из локтевой вены обследуемого больного, независимо от приема им пищи, затем кровь разводят 1 мл цитрата натрия в соотношении кровь : цитрат натрия 8:1. Для определения опухолевых клеток создают давление в искусственной среде, необходимое для прохождения всей исследуемой крови через калиброванный фильтр. Опухолевые клетки задерживаются в осадке на калиброванном фильтре, осадок наносят на предметные стекла, которые предварительно обезжиривают и охлаждают для лучшего прилипания опухолевых клеток и высыхания. Затем на предметных стеклах фиксируют мазки - отпечатки трехпроцентным спиртовым раствором Лейшмана в течение 2-4 минут. После чего смывают дистиллированной водой и красят азур-эозиновой смесью в соотношении 3:1 продолжительностью 6-8 минут. После покраски промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе и приступают к просмотру под микроскопом. Использование способа позволяет сократить время обследования, позволяет быстро определить первичный диагноз у больного. 8 ил.

Способ определения раковых клеток в периферической венозной крови у больных с подозрением на злокачественные новообразования, предусматривающий взятие крови у обследуемого больного в количестве 8 мл, отличающийся тем, что взятие крови осуществляют из локтевой вены обследуемого больного, независимо от приема им пищи, затем кровь разводят 1 мл цитрата натрия, в соотношении кровь:цитрат натрия 8:1, для определения опухолевых клеток создают давление в искусственной среде, необходимое для прохождения всей исследуемой крови через калиброванный фильтр, при этом опухолевые клетки задерживаются в осадке на калиброванном фильтре, осадок наносят на предметные стекла, которые предварительно обезжиривают и охлаждают для лучшего прилипания опухолевых клеток и высыхания, затем фиксируют мазки-отпечатки 3%-ным спиртовым раствором Лейшмана в течение 2-4 мин, далее смывают дистиллированной водой и красят азур-эозиновой смесью в соотношении 3:1 продолжительностью 6-8 мин, после покраски промывают дистиллированной водой, сушат на воздухе, приступают к просмотру под микроскопом и выявляют наличие в периферической крови опухолевых клеток.