СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ФИБРОАДЕНОМЫ И РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Российский патент 2020 года по МПК G01N33/574 G01Q60/24 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и раскрывает способ дифференциальной диагностики между фиброаденомой и раком молочной железы.

Заболеваемость раком молочной железы (РМЖ) увеличивается с возрастом, начиная с 40 и пиком в 60-65 лет. Снижение смертности от рака молочной железы в ряде развитых стран связывают с ранней диагностикой. По этой причине одним из актуальных вопросов является своевременная дифференциальная диагностика РМЖ. Это имеет важное значение для выбора программ дальнейшего лечения пациента, которые чрезвычайно различаются по объему и последствиям в зависимости от выявленной патологии.

В молочных железах помимо различных форм мастопатии, фиброаденом и рака встречаются липомы различных размеров, липогранулемы, возникающие после травм, галактоцеле у кормящих женщин, ангиоматозные опухоли, саркомы, дифференциальная диагностика которых осуществляется клиническим, маммографическим, ультразвуковым и цитологическим исследованием.

Значительные трудности возникают при дифференциальной диагностике рака и фиброаденомы (ФА) молочной железы.

Фиброаденома - доброкачественная опухоль фиброэпителиального строения. Это наиболее частая форма из доброкачественных опухолей молочной железы. В основном встречается в гормонально активном возрасте между 20-40 годами. Лишь четвертая часть ФА достигает таких размеров, когда они могут быть обнаружены макроскопически или выявлены на маммограммах, остальные остаются на микроскопическом уровне. Достигнув определенной стадии, ФА прекращает рост и может годами сохранять стабильность. Установлена зависимость размеров и гистологической структуры опухоли с циклическими гормональными процессами в организме: во время менструального цикла опухоль увеличивается, а после менструации вновь возвращается в исходное состояние. Во время беременности и лактации фиброаденомы могут достигать гигантских размеров.

Фиброаденомы обызвествляются с такой же частотой, как и рак (около 30%), но характер кальцинатов иной: они немногочисленны, более крупные, бесформенные, глыбчатые.

Колоссальное значение имеет своевременная дифференциальная диагностика ФА и рака молочной железы.

Из предшествующего уровня техники известен способ дифференциальной диагностики фиброаденомы и рака молочной железы при котором морфометрически в гистологических срезах опухоли определяют количество паренхиматозных клеток, фибробластов и фиброцитов, локализованных периартериолярно, и при числе паренхиматозных клеток, равном или менее 18,67±1,96, числе фибробластов, равном или более 11,91±0,81, числе фиброцитов, равном или более 14,00±1,07, диагностируют фиброаденому, а при числе паренхиматозных клеток, равном или более 44,62±6,56, числе фибробластов, равном или менее 8,32±0,61, числе фиброцитов, равном или менее 8,65±0,72, диагностируют РМЖ (RU 2092843, 10.10.1997).

Однако, в этом способе не учитываются объективные параметры паренхиматозных клеток, а лишь их количество и соотношение с фиброцитами и фибробластами, что исключает диагностику начального рака молочной железы на фоне фиброаденомы. Кроме того способ рассчитан на гистологическую диагностику и не может применяться в цитологии.

Известен способ морфометрического исследования, повышающего информативность патогистологического исследования. Например, в качестве критерия дифференциальной диагностики опухолей предлагается обращать внимание на содержание ДНК ядер клеток. Наличие эпителиальных клеток с повышенным более 4 раз против нормы содержания ДНК повышает вероятность заболеть раком молочной железы в 9,1 раза (Нейштадт Э.Л. Возможности использования морфологических критериев в определении вероятности заболевания раком молочной железы. Автореф. дисс. д.м.н. Санкт-Петербург, 1991, с. 44).

Однако, способ не рассчитан для цитологического исследования, учитывает лишь один параметр, а именно содержание ДНК в ядрах клеток молочной железы, что позволяет лишь в предположительной форме высказать о вероятности заболеть раком молочной железы.

Известен способ дифференциальной диагностики доброкачественных опухолей и рака молочной железы в гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином. Способ основан на микроскопическом выявлении узловатого образования в молочной железе, в котором от размеров и формы железистых трубок и характера расположения соединительной ткани можно в одних случаях выделять периканаликулярную, в других интраканаликулярную ФА (Ласкина А. В. Опухоли молочной железы. В кн. Руководство по патологоанатомической диагностике опухолей человека. 2 изд./ Под ред. Н. А. Краевского, А. В. Смольянникова. М. Медицина, 1976, с. 191-211).

Однако, недостатком способа является отсутствие однозначных объективных патогистологических критериев, отличающих доброкачественные от начальных форм малигнизации фиброаденом, т.е. от минимального рака молочной железы, в который в 5% от общего числа трансформируются фиброаденомы молочной железы (Ермилова В. Д. Опухоли молочной железы. В кн. Руководстводство по патологоанатомической диагностике опухолей человека /Под ред. Н.А. Краевского, А.В. Смольянникова, Д.С. Саркисова. 3 изд. М. Медицина, 1982. с. 210 232). Способ применяется для гистологии и зависит от опыта и квалификации гистолога, не предполагает цитологического исследования.

Известен способ исследования с применением микроскопии, проведение которого позволяет подтвердить или опровергнуть диагноз злокачественного новообразования. Таким способом является цитологическое исследование биоптата или соскоба из опухоли молочной железы (Руководство по цитологической диагностике опухолей человека. Под редакцией Петровой А.С., Птоховой М.П. М.«Медицина», 1975).

Однако, данное исследование на некоторых своих этапах является субъективным (оценка относительных и абсолютных размеров клеточных элементов, трудности учета неизбежной вариабельности условий подготовки материала, что приводит к вариабельности как цветовых, так и размерных характеристик клеток препарата).

Известен подход к распознаванию в процессе диагностического поиска трехмерной структуры исследуемой ткани на основе компьютерного анализа изображений последовательных гистологических срезов (Rene Albert, Tomas Schinderwolf, Irith Baumann, Harry Harms., Three-Dimensional Image Processing for Morphometric Analysis of Epithelium Sections. Cytometry 13:759-765 (1992)).

Однако, способ содержит в себе два возможных источника погрешностей, которые могут оказаться критическими при исследовании деталей клетки: во-первых, объемная структура клетки не измеряется прямо, а строится программой, во-вторых, точность построения ограничена снизу толщиной срезов, которые готовит микротом. Попытки повысить точность за счет использования ультрамикротомов приводят к необходимости применения указанных дорогостоящих устройств, а также к быстрому росту трудоемкости на гистологическом этапе и к росту вычислительной сложности программных алгоритмов. В качестве примера укажем, что для построения трехмерного образа клетки размером 10 микрометров (довольно обычный и не самый большой размер) с разрешением 10 нанометров (типичное разрешение, достигаемое предлагаемым способом исследований) необходимо с высокой точностью (10 нанометров) подготовить, микроскопировать и совместно обработать программным алгоритмом не менее 1000 гистологических препаратов.

Известен метод атомно-силовой микроскопии (АСМ) - одного из видов сканирующей зондовой микроскопии, основанный на ван-дер-ваальсовских взаимодействиях зонда с поверхностью образца (Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микроскопии М. Техносфера, 2004). Принцип действия АСМ основан на использовании сил атомных связей, действующих между атомами вещества. На малых расстояниях между двумя атомами действуют силы отталкивания, а на больших - силы притяжения. С помощью АСМ получают изображения, как физических объектов (поверхности твердых тел), так и биологических и химических объектов (вирусов и бактерий, атомов и молекул). Разрешение таких микроскопов достигает доли нанометров, что позволяет наблюдать атомы. В результате проведения АСМ можно строить объемный рельеф поверхности образца в режиме реального времени. Разрешающая способность данного метода составляет примерно 0,1-1 нм по горизонтали и 0,01 нм по вертикали. Использование АСМ открывает новые возможности в цитологической диагностике, поскольку метод за небольшое время (минуты) позволяет получить изображение поверхности клеток с разрешением порядка нескольких нанометров. Физической основой работы АСМ служит взаимодействие между острием зонда, сканирующего исследуемый образец, и поверхностью. В процессе сканирования зонд движется строка за строкой по изучаемому образцу. При этом острие зонда приподнимается и опускается, очерчивая микрорельеф поверхности образца.

Предложенный нами способ направлен на преодоление недостатков ранее известных способов проведения исследования и направлен на разработку наиболее точной дифференциальной диагностики ФА и РМЖ.

Техническим результатом изобретения является создание способа, позволяющего с высокой объективностью и достоверностью отдифференцировать РМЖ от ФА для определения дальнейшей тактики лечения таких больных.

Указанный технический результат решается тем, что также как и в известном способе приготавливают цитоспиновые препараты с использованием жидкостной цитологии и проводят АСМ, затем на основе компьютерного анализа микрорельефа поверхностей клеток и измерения параметров клеток, таких как высота цитоплазмы над подложкой, высота ядра над подложкой и соотношение высоты ядра и цитоплазмы определяют объективные морфометрические данные изучаемых клеток.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что содержимое аспирата узловых образований молочной железы помещают в микропробирку, содержащую 800 мкл среды Хенкса, взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги и центрифугируют в течение 5 мин в режиме 1000 об/мин, готовят два жидкостных цитологических мазка, далее полученные цитоспиновые препараты высушивают при комнатной температуре и проводят атомно-силовую микроскопию, и если соотношение высоты ядра и цитоплазмы:

- 2,5 и более, то дифференцируют рак молочной железы;

- 1,7-2,4, то дифференцируют фиброаденому.

Изобретение поясняется подробным описанием, таблицей, клиническим примерами выполнения и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - АСМ изображение клетки эпителия молочной железы: среднее отношение высоты ядра к высоте цитоплазмы соответствовало 1,8 - диагноз фиброаденома.

Фиг. 2 - АСМ изображение клеток инвазивного рака молочной железы неспецифического типа: среднее отношение высоты ядра к высоте цитоплазмы составило 2,7.

Способ осуществляют следующим образом.

Больного обследуют с помощью УЗИ и при наличии узловых образований в молочной железе проводят тонкоигольную пункционную биопсию под контролем УЗИ. Из пунктатов готовят тонкие мазки. Если в результате пункции получена жидкость, ее предварительно центрифугируют и из осадка готовят несколько тонких мазков. Мазки высушивают на воздухе и затем окрашивают азур-эозиновыми смесями по стандартной методике. Таким образом, готовят рутинные цитологические препараты.

Для проведения АСМ применяли метод приготовления цитоспиновых препаратов с использованием жидкостной цитологии. Содержимое аспирата узловых образований молочной железы помещают в среду Хенкса, в микропробирку, содержащую 800 мкл среды Хенкса. Взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги системы Cytospin (Shandon, UK) и центрифугируют в режиме 1000 об/мин в течение 5 мин. Готовят два жидкостных мазка. Полученные цитоспиновые препараты высушивают при комнатной температуре и затем используют для АСМ, предварительно проведя контроль качества полученных монослойных мазков, для чего один цитопрепарат окрашивают рутинным методом по Лейшману (азур эозиновыми смесями).

Полученные рутинные цитологические препараты молочной железы, окрашенные азур эозиновыми смесями анализируют для установления диагноза в два этапа: в начале посредством обычной световой микроскопии, а затем с помощью АСМ.

Для проведения АСМ используют атомно-силовой микроскоп (например, комплекс Интегра производства «ЗАО НТ НДТ» г. Зеленоград, Россия). Сканирование осуществляют в полуконтактном режиме.

Полученные данные микрорельефа поверхностей клеток и его локальных свойств обрабатывают штатными программными средствами, входящими в состав программного обеспечения исследовательского комплекса Интегра.

Статистическую обработку результатов измерений морфологических параметров клеток (определение средних значений параметров, стандартных отклонений, достоверностей различий статистических параметров для клеток различных типов) осуществляют обычными статистическими методами с помощью пакета программ Statistica 6.0.

Был исследован 51 цитологический препарат опухолей молочной железы, полученный методом тонкоигольной аспирационной биопсии под контролем ультразвукового исследования и с помощью соскобов с операционного материала. АСМ исследовали как рутинные цитологические мазки, так и жидкостные монослойные препараты, окрашенные азур эозиновыми смесями. Каждое исследование составило - 20 минут.

При проведении АСМ в клетках РМЖ наблюдается грубый микрорельеф поверхности ядер, ядрышки хорошо просматриваются в виде локальных возвышений, ядерно-цитоплазменное соотношение сдвинуто в сторону ядра. Контуры ядра и цитоплазмы неровные. При ФА клетки, как правило, расположены в виде комплексов, наблюдается укрупнение размеров клеток и ядерный хроматин грубый. Вместе с тем, клетки располагаются примерно на одинаковом расстоянии и ориентированы в одном направлении, контуры ядер ровные, хроматин распределен равномерно, хорошо видна сглаженность микрорельефа ядер (См. таблицу).

Клинический пример 1.

Больная М., 42 года. В анамнезе рак молочной железы справа шесть лет назад, в настоящее время узловое образование в левой молочной железе. По данным УЗИ - фиброаденома, по данным маммографии - подозрение на наличие рака. При цитологическом исследовании методами световой микроскопии материала тонкоигольной аспирационной биопсии, взятого из узлового образования молочной железы, оказалось невозможным исключить РМЖ на фоне фиброаденомы. Материал был подвергнут исследованию с помощью АСМ.

При АСМ наряду с отсутствием ядрышек, среднее отношение высоты ядра к высоте цитоплазмы соответствовало 1,8 (Фиг. 1). Диагноз - ФА, что было подтверждено последующим гистологическим исследованием.

Клинический пример 2.

Больная Ж., 51 год. В анамнезе фиброзно-кистозная мастопатия обоих молочных желез в течение 25 лет, в настоящее время в правой молочной железе выявлено узловое образование. По данным УЗИ диагноз фиброаденома под вопросом, по данным маммографии - подозрение на наличие рака. При цитологическом исследовании методами световой микроскопии материала тонкоигольной аспирационной биопсии, взятого из узлового образования молочной железы, оказалось невозможным исключить РМЖ. Материал был подвергнут исследованию с помощью АСМ. При АСМ среднее отношение высоты ядра к высоте цитоплазмы составило 2,7 (Фиг. 2). Диагноз - рак молочной железы, что впоследствии было подтверждено последующим гистологическим исследованием.

Предложенный способ АСМ позволяет:

- изучать структуру и разнообразные свойства поверхностей в различных средах с высоким пространственным разрешением, порядка нескольких нанометров (7-8 нм), за небольшое время (20 минут);

- получить трехмерное изображение клеток и макромолекул на их поверхности;

- исследовать поведение макромолекул и живых клеточных систем в условиях, приближенных к физиологическим.

- получить информацию о химическом составе исследуемого объекта, а также детектирование физических свойств исследуемых поверхностей;

- получить различия для клеток ФА и клеток РМЖ.

Заявленный способ может оказать цитологу дополнительную неоценимую помощь при патологии молочных желез за счет поиска наиболее точных, объективных и достоверных критериев, позволяющих провести дифференциальную диагностику между нормальными клетками и клетками РМЖ.

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Предложен способ дифференциальной диагностики фиброаденомы (ФА) и рака молочной железы (РМЖ). Содержимое аспирата узловых образований молочной железы помещают в микропробирку, содержащую 800 мкл среды Хенкса, взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги и центрифугируют в течение 5 мин в режиме 1000 об/мин. Готовят два жидкостных мазка. Полученные цитоспиновые препараты высушивают при комнатной температуре и проводят атомно-силовую микроскопию. Если соотношение высоты ядра и цитоплазмы 2,5 и более, то дифференцируют РМЖ, если 1,7-2,4, то дифференцируют ФА. Изобретение обеспечивает создание способа, позволяющего с высокой объективностью и достоверностью отдифференцировать РМЖ от ФА для определения дальнейшей тактики лечения больных. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ дифференциальной диагностики фиброаденомы и рака молочной железы, включающий приготовление цитоспиновых препаратов с использованием жидкостной цитологии и проведение атомно-силовой микроскопии с измерением параметров клеток: высота цитоплазмы над подложкой, высота ядра над подложкой и соотношение высоты ядра и цитоплазмы, отличающийся тем, что содержимое аспирата узловых образований молочной железы помещают в микропробирку, содержащую 800 мкл среды Хенкса, взвесь клеток распределяют по 50-100 мкл в контейнеры центрифуги и центрифугируют в течение 5 мин в режиме 1000 об/мин, готовят два жидкостных мазка, далее полученные цитоспиновые препараты высушивают при комнатной температуре и проводят атомно-силовую микроскопию, и если соотношение высоты ядра и цитоплазмы:

- 2,5 и более, то дифференцируют рак молочной железы;

- 1,7-2,4, то дифференцируют фиброаденому.