СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к онкологии, иммунологии, лабораторной диагностике и может быть применено для прогнозирования и раннего выявления лиц с риском развития злокачественных новообразований, что необходимо для обеспечения своевременного адекватного лечения и благоприятного прогноза течения заболевания.

Одной из основных причин смертности в промышленно развитых странах являются злокачественные новообразования. При этом, согласно данным Международного агентства по изучению рака, к 2020 г. прогнозируется повышение заболеваемости злокачественными опухолями до 15 млн и возрастание смертности до 9 млн человек в год [Parkin D.M., Pisani P., Ferlay J. Global cancer statistics CA Cancer // J. Clin. - 1999. - Vol.49. - P. 33-64]. В связи с социальной значимостью проблемы онкологических заболеваний, правительством Российской Федерации в рамках приоритетного национального проекта «Здоровье» в 2009 году начата реализация мероприятий, направленных на совершенствование оказания медицинской помощи больным со злокачественными новообразованиями. Одной из приоритетных задач является выявление заболеваемости на ранних стадиях. Известно, что положительный результат лечения может достигать 90-95% при выявлении онкологических заболеваний на первой или второй стадии заболевания. Несвоевременная диагностика онкологических заболеваний связана с трудностью диагностики заболевания на ранней стадии.

Несмотря на то, что в последние десятилетия были предложены многочисленные методы диагностики онкологических заболеваний, все они характеризовались теми или иными недостатками: либо низкой чувствительностью и предсказательной ценностью, либо высокой стоимостью исследования и невозможностью использования в качестве скрининговых методов диагностики. Учитывая невысокую доступность специализированных лабораторных и инструментальных методов исследования, возникает вопрос, каким образом практический врач может оценить риск развития злокачественного новообразования у конкретного больного, который является чрезвычайно актуальным.

Имеющееся диагностическое исследование на выявление опухолеспецифических онкомаркеров (CA125, CA19-9, SCCA, TPS, РЭА и др.) - это возможность дифференциальной диагностики определенной опухоли в комбинации с другими диагностическими методами. Как известно, антитела к конкретному антигену выявляют в сыворотке больных раком не очень часто (около 10% случаев), с диагностической целью используют определение антител к одному из нескольких опухолеассоциированных антигенов, которые появляются примерно у половины больных [Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология._- 1996. - №6 - С.10-23]. До сих пор не охарактеризован ни один опухолевый маркер, обладающий 100% специфичностью по отношению к какому-либо органу (исключением можно считать ПСА).

Отправной точкой для разработки предлагаемого способа прогнозирования риска развития злокачественных новообразований послужила общепринятая в настоящее время концепция, согласно которой нарушение равновесия между процессами пролиферации и апоптоза является главной причиной формирования опухоли.

Литературные данные свидетельствуют о том, что нарушение регуляции апоптоза характерно как для доброкачественных, так и злокачественных новообразований [Anderson T.J. Pathological studies of apoptosis in the normal breast // Endocr. Relat. Cancer. - 1999. - Vol.6. - №1. - P. 9-12; Talieri M., Diamandis E.P., Katsaros N., et al. Expression of BCL2L12, a new member of apoptosis-related genes, in breast tumors // Thromb. Haemost. - 2003. - Vol.89. - №6. - P. 1081-1088.]. Сравнение уровня спонтанного апоптоза при различных заболеваниях показывает увеличение его в ряду фиброаденома - фиброзно-кистозная мастопатия - рак молочной железы. Однако достоверные отличия обнаружены только с группой рака молочной железы [Боженко В.К., Гали-Оглы Г.А., Кудинова Е.А., Мельникова Н.В. Оценка уровня спонтанного апоптоза при доброкачественных и злокачественных новообразованиях молочной железы http://vestnik.mcrr.ru/vestnik/v4/papers/bozhen_v4.htm].

Большое внимание в литературе уделяется изучению особенностей и выявление различных маркеров апоптоза при злокачественных новообразованиях [Gonzalez-Campora R., Galera Ruiz M.R., Vazquez Ramirez F., et al. Apoptosis in breast carcinoma // Pathol. Res. Pract. - 2000. - Vol.196. -№3. - P. 167-174.; Антонеева И.И., Петров С.Б. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в динамике прогрессирования рака яичника / Онкология. - 2008. - Т. 10. - №2. - С.234-237]. Так, исследование роли индекса апоптоза как предиктора прогноза пациентов с первичным раком молочной железы не выявил прямой взаимосвязи исследуемого показателя прогноза с заболеванием. Однако зарегистрирована ассоциация развития рака молочной железы с ингибиторами апоптоза, получены свидетельства, что патологический процесс может включать ингибиторы клеточного цикла физиологически [Schöndorf Т., Göhring U.-J., Becker М., et al. High Apoptotic Index Correlates to p21 and p27 Expression Indicating a Favorable Outcome of Primary Breast Cancer Patients, but Lacking Prognostic Significance in Multivariate Analysis // Pathobiology. - 2004. - №4. - Vol.71. - P. 217-222].

Получены данные, что в процессе прогрессирования рака яичников, в первичном опухолевом узле имеет место гиперэкспрессия ингибитора апоптоза Bcl-2, обеспечивающее более агрессивное течение заболевания [Антонеева И.И., Петров С.Б. Маркеры апоптоза и пролиферации опухолевых клеток в динамике прогрессирования рака яичника / Онкология. - 2008. - Т. 10. - №2. - С.234-237]. Изучены механизмы, благодаря которым Bcl-2 реализует свою антиапоптотическую функцию при онкологических процессах [Mitselou A., Ioachim Е., Kitsou Е., et al. Immunohistochemica study of apoptosis - related bcl-2 protein and its correlation with proliferation indices (Ki-67, PCNA), tumor suppression genes (p53, pRb), the oncogene c-erb-B2, sex steroid hormone receptor and other clinico-pathological features, in normal, hyperplastic and neoplastic endometrium // In vivo. - 2003. - Vol.17. - P. 469-478.]. Однако данные относительно уровня экспрессии белка Bcl-2 и возможностей использования его в качестве прогностического фактора у больных с солидными опухолями достаточно противоречивы [Zhang G.J., Kimijima I., Abe R., et al. Apoptotic index correlates to bcl-2 and p53 protein expression, histological grade and prognosis in invasive breast cancers. // Anticancer Res. - 1998. - Vol.18. - P. 1989-1998; Абраменко И.В., Фильченков A.A. Оценка параметров апоптоза в диагностике онкологических заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии // Вопр. онкол. - 2003. - №49. - С.21-30; Мильчаков Д.Е. Клинико-морфологическая характеристика серозного рака яичников у женщин (на примере Кировской обл.): Автореф. дис … канд. мед. наук. - Санкт-Петербург. - 2007. - 19 с.].

Интенсивно изучается биологическая роль растворимого рецептора Fas - sAPO-1, большинство исследований сосредоточено на малигнизации клеток при лейкемии и солидных новообразовниях [Knipping Е., Debatin К.М., Stricker К., et al. Identification of soluble APO-1 in supernatants of human B- and T-cell lines and increased serum levels in B- and T-cell leukemias // Blood. -1995. - Vol.85. - P. 1562-1569; Wong W.W., Dimitroulakos J., Minden M.D., et al. HMG-CoA reductase inhibitors and the malignant cell: the statin family of drugs as triggers of tumor-specific apoptosis // Leukemia. - 2002. - Vol.16. - P. 508-519]. Предполагают, что растворимые формы ингибируют апоптоз, блокируя связывание мембранной формы Fas с Fas-L, за счет взаимодействия в кровотоке [Serrao K.L., Fortenberry J.D., Owens M.L., et al. Neutrophils induce apoptosis of lung epithelial cells via release of soluble Fas ligand // Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. - 2001. - Vol.280. - P. 298-305]. Имеются данные, что sAPO-1 может защищать клетки от Fas - лиганд-индуцированного апоптоза [Chen J., Zhou Т., Liu С.et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule // Science. - 1994. - Vol.263. - P. 1759-1762]. Следовательно, секреция sAPO-1 может дать возможность опухолевым клеткам ускользнуть от иммунного надзора и, таким образом, вовлечена в процесс развития опухоли.

Попытка использования количественного значения sAPO-1 в прогностических целях была предпринята в исследованиях, проведенных Касимовой А.К. и Тулеутовым А.Е. [Касимова А.К. Растворимый Fas - антиген у больных новообразованиями яичников и его клиническое значение: Автореф. дис. … канд. мед. наук. - Астана. - 2008. - 24 с.]. Было показано, что безрецидивная выживаемость больных раком яичников зависела от исходного (до лечения) уровня растворимого Fas рецептора (sAPO-1/Fas) и достоверно ниже в группе больных с повышенным (более 200 пг/мл) содержанием в сыворотке крови sAPO-1. Однако динамика количественных изменений растворимого рецептора изучалась только у больных женщин с новообразованиями яичников, кроме того, указанные значения sAPO-1 не могут расцениваться как «повышенная продукция» в связи с тем, что референсные значения данного показателя, согласно рекомендации фирмы-производителя «Bender MedSystems» (Австрия) составляют 1334-2411 пг/мл, что согласуется и с другими исследованиями [Choi J.W. Reference intervals of serum APO-1 (Fas/CD95) concentration in healthy adults // An. Clin. Lab. Science. - 2006. - Vol.36. - P. 103-104].

Данных о дозозависимых эффектах sAPO-1, взаимосвязи уровня концентрации растворимого рецептора Fas/APO-1 с риском развития злокачественных новообразований на доклиническом этапе в литературе мы не обнаружили.

При исследовании научно-технической патентной информации идентичная совокупность существенных признаков, заявленная в изобретении, также не была выявлена. Известен способ прогнозирования развития профессиональных злокачественных новообразований кожи у работников производства стекловолокна [Патент РФ №2454668, опубл. 27.06.2012], при котором из периферической венозной крови обследуемых лиц выделяют ДНК лимфоцитов и осуществляют анализ генного полиморфизма с помощью полимеразной цепной реакции. Указанный аналог изобретения требует длительной и трудоемкой пробоподготовки, включающей ночную инкубацию в термостате, фенол-хлороформную экстракцию и амплификацию ДНК, шестичасовой рестрикционный анализ с последующей оценкой на приборе. Способ, основанный на молекулярно-генетической диагностике, является дорогостоящим, проведение которого возможно только в специализированных лабораториях.

Известен способ оценки и прогнозирования факторов риска злокачественных новообразований гортани [Патент РФ №2246894, опубл. 27.02.2005], включающий медико-генетическое обследование пациента и дополнительное исследование многочисленных факторов, в том числе: возраст, длительность курения, стаж работы с профвредностями, регулярность употребления алкоголя, бытовые вредности, экологические факторы, срок проживания в загрязненном районе. Данные показатели оцениваются в баллах, затем вычисляют коэффициент прогнозирования по разработанной формуле. Недостатком представленного аналога изобретения является его трудоемкость, временная и экономическая затратность при прогнозировании факторов риска только злокачественных новообразований гортани. Способ требует проведения объемных диагностических процедур, параметры полученных данных нуждаются в соответствующих измерениях и стандартизованной оценке, что ограничивает применение способа в практической медицине.

Целью заявленного изобретения является прогнозирование риска развития и раннее выявление злокачественных новообразований в организме человека в условиях широкой сети учреждений практического здравоохранения. Поставленная цель достигается тем, что в периферической крови человека определяют абсолютное содержание естественных киллеров CD16+ лимфоцитов и концентрацию растворимого рецептора апоптоза (sAPO-1). При содержании CD16+ клеток более 0,5×10⁹ кл/л и концентрации sAPO-1 более 4000 пг/мл прогнозируют риск развития злокачественных новообразований. Технический результат предлагаемого способа заключается в том, что посредством дифференцированной оценки количественных значений двух показателей: естественных киллеров CD16+ лимфоцитов и растворимого рецептора апоптоза sAPO-1 в крови человека прогнозируют риск развития злокачественных новообразований.

По данным исследований в модельных системах и косвенных свидетельств, полученных из опыта иммунотерапии опухолей человека, ключевую роль в иммунном повреждении опухолевых клеток играют цитотоксические лимфоциты - естественные киллеры (NK-клетки) и цитотоксические Т-лимфоциты. Основная функция естественных киллеров (NK-клетка, экспрессирующая молекулы CD16) - цитолиз клеток, несущих признаки трансформации, инфицирования или клеточного стресса, при отсутствии на них собственных молекул MHC-I и секреция цитокинов (в первую очередь IFNγ). Они используют классический перфорин-гранзимовый механизм контактного цитолиза, а также Fas-зависимую индукцию апоптоза опухолевых клеток [Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. - 1996. - Т. 6. - С.10-23].

Таким образом, эффект защитной реакции, реализуемый естественными киллерами (CD16+), а также уровень содержания в периферической крови человека ингибитора апоптоза растворимого рецептора sAPO-1 позволяют оценить эффективность работы противоопухолевого иммунитета организма и способность опухолевыми клетками избегать действия эффекторных факторов иммунитета, что дает возможность использовать количественные значения данных биомаркеров в качестве прогноза риска развития злокачественных новообразований.

Преимуществом предлагаемого изобретения является одновременная оценка параметров, определяющих с одной стороны - активность противоопухолевой защиты организма, реализуемую естественными киллерами (CD16+), с другой стороны - защита опухолевых клеток от апоптоза путем его ингибирования (sAPO-1).

Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники и не являющиеся очевидными для специалиста. Способ позволяет сократить время и упростить методику прогнозирования, так как позволяет использовать материалы, реактивы и методы исследования, широко применяемые в стандартной клинико-лабораторной практике. Предлагаемый способ диагностики расширяет контингент обследуемых с целью раннего выявления лиц с риском развития злокачественных новообразований, что необходимо для обеспечения своевременного адекватного лечения и благоприятного прогноза заболевания.

Способ осуществляется следующим образом. Кровь для исследования берется из локтевой вены в объеме 1 мл в 9-10 часов утра, натощак. Методом микроскопирования изучается содержание лимфоцитов в мазках крови, окрашенных по методу Романовскому-Гимзе. Фенотип лимфоцитов (CD16+) определяется непрямой иммунопероксидазной реакцией с использованием моноклональных антител (НПЦ «МедБиоСпектр», г. Москва). Количественное определение растворимого рецептора Fas - sAPO-1 в сыворотке крови проводится методом «конкурентного» иммуноферментного анализа (ИФА) в микропланшетном формате с использованием реактивов фирмы «Bender MedSystems» (Австрия).

Исследование проводилось на автоматическом иммуноферментном анализаторе «Evolis» фирмы «Bio-Rad» (Германия-США). Заявленным способом в апреле 2008 года были обследованы 230 человек, родившихся и постоянно проживающих в г. Архангельске от 28 до 90 лет (средний возраст 58,3 лет). В декабре 2013 года проведен ретроспективный анализ анамнеза жизни исследуемых людей за данный период. Диагноз установлен в Архангельском областном клиническом онкологическом диспансере, обследование проводили с соблюдением основных норм биомедицинской этики. Статистический анализ был выполнен с использованием пакета прикладных программ «SPSS for Windows» (версия 11.5; США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера Европейской территории России. Распределение содержания сывороточного sAPO-1 отличалось от нормального, поэтому представлено в виде медианы, 25- и 75- перцентилей. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия Уилкоксона. Статистическая достоверность присваивалась при значении p<0,05.

Наши исследования показали влияние количества естественных киллеров (CD16+ лимфоцитов) и концентрации растворимого рецептора апоптоза sAPO-1/Fas на развитие злокачественных новообразований у исследуемых людей за период наблюдения 5 лет и 8 месяцев (p<0,05). Установлено, что общее абсолютное содержание естественных киллеров CD16+ значительно выше у обследуемых, у которых в последующем было диагностировано злокачественное новообразование по сравнению с группой лиц без онкологических заболеваний: 0,78±0,03 против 0,34±0,05×10⁹ кл/л (p<0,05), соответственно. При этом повышение количества естественных киллеров (CD16+) сопровождалось увеличением числа цитотоксических лимфоцитов (CD8+) и было ассоциировано с повышением уровня антител ds-DNA (r=0,46; p<0,05) на фоне активизации Fas-опосредованного апоптоза (p<0,05). Естественные киллеры, как известно, обеспечивают первую, еще неспецифическую цитотоксичность в отношении генетически чужеродных клеток или клеток, содержащих чужеродную информацию. Продуцируемый естественными киллерами интерферон гамма (IFNγ) подавляет пролиферацию опухолевых клеток, способствует развитию апоптоза опухолевых клеток, индуцируя экспрессию каспазы 1, а также Fas-рецептора на опухолевых клетках и Fas-лиганда на цитотоксических Т-лимфоцитах [Опферман Т., Корсмэер С. Роль апоптоза в период становления иммунной системы и при развертывании иммунного ответа // Аллергология и иммунология. - 2006. - Т. 7. - №4. - С.464-470].

Наши исследования показали, что содержание растворимого рецептора sAPO-1 в сыворотке крови людей, у которых за период наблюдения диагностировано злокачественное новообразование, значительно выше (44705,80 (9464,525-253649,4) пг/мл), чем у людей, наблюдаемых за тот же период без онкологической патологии (1257,8 (626,30-2015) пг/мл; p<0,05). Повышение sAPO-1 выше 4000 пг/мл ассоциировалось с достоверным увеличением абсолютного числа моноцитов (0,54±0,04 против 0,31±0,09×109 кл/л, p<0,05). Участие моноцитов/макрофагов в противоопухолевом иммунитете связано с секрецией интерферонов, а также с TNF-α, которые активируют клетки-продуценты и усиливают цитотоксическую функцию естественных и специализированных киллеров. Моноциты, инфильтрируя опухоль, способствуют ее разрушению, спонтанному рассасыванию [Войтенков Б.О., Окулов В.Б. Основные характеристики макрофага как клетки эффектора // Вопр. онкологии. - 1995. - №3. - С.59-64; Луговская С.А. Структура и функции моноцитов и макрофагов // Клин. лаб. диагностика. - 1997. - №9. - С.10-15; Secchiero Р., Gonelli A., Mirandola P. et al. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand induces monocytic maturation of leukemic and normal myeloid precursors through a caspase-dependent pathway // Blood. - 2002. - V. 100. - P. 2421-2429]. Показано, что повышение концентрации sAPO-1 выше 4000 пг/мл ассоциировано с увеличением относительного числа лимфоцитов с маркером активации иммунной системы через IL-2 (CD25+)-(23,7±1,32×10⁹ кл/л против 19,85±0,83×10⁹ кл/л, p<0,01), что свидетельствует о взаимосвязи гиперсекреции растворимого рецептора с пролиферативной реакцией.

Установленная в процессе исследования взаимосвязь повышения количества естественных киллеров (CD16+) и гиперсекрецией сывороточного sAPO-1 с развитием злокачественных новообразований, логическая обоснованность данных взаимосвязей, позволяют оценить активность противоопухолевой защиты организма и способность опухолевыми клетками избегать действия эффекторных факторов иммунитета путем ингибирования апоптоза, что дает возможность использовать количественные значения данных биомаркеров в качестве прогноза риска развития злокачественных новообразований. В результате были получены следующие характеристики: чувствительность - 75%, специфичность - 84,3%. Предлагаемый нами способ имеет предсказательную ценностью для прогнозирования риска развития и раннего выявления злокачественных новообразований в организме человека, достоверное и доступное для проведения в стандартной клинической практике.

Примеры, иллюстрирующие изобретение

Пример 1. Больная С., 54 года. При лабораторном обследовании периферической венозной крови в апреле 2008 г.: абсолютное содержание CD16+ лимфоцитов 0,37×10⁹/л; концентрация sAPO-1 составила 694,7 пг/мл. По данным исследования риска развития злокачественного новообразования нет. За период наблюдения с апреля 2008 года по декабрь 2013 года новообразований выявлено не было. Прогноз верен.

Пример 2. Больная В., 32 года. При лабораторном обследовании периферической венозной крови в апреле 2008 г.: абсолютное содержание CD16+ 0,64×10⁹/л; концентрация sAPO-1 составила 4648,8 пг/мл. Сделано заключение о риске развития злокачественного новообразования. Диагноз: Рак яичников, Т-2 ст, Mts 0-1. Заболевание диагностировано в сентябре 2008 года. Прогноз верен.

Пример 3. Больная Н., 72 года. При лабораторном обследовании периферической венозной крови в апреле 2008 г.: абсолютное содержание CD16+ 0,81×10⁹/л; концентрация sAPO-1 составила 312647,9 пг/мл. Сделано заключение о риске развития злокачественного новообразования. Диагноз: Рак молочной железы, Т-3 ст, Mts 2 (в региональные лимфоузлы). Заболевание диагностировано в январе 2009 года. Прогноз верен.

Пример 4. Больной Б., 65 лет. При лабораторном обследовании периферической венозной крови в апреле 2008 г.: абсолютное содержание CD16+ 0,72×10⁹/л; концентрация sAPO-1 составила 76653,8 пг/мл. Сделано заключение о риске развития злокачественного новообразования. Диагноз: Рак прямой кишки, Т-3 ст, Mts 3-4, диагностирован в 2010 году. Больной умер в 2011 году. Прогноз верен.

Изобретение относится к медицине, а именно онкологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития и раннего выявления злокачественных новообразований. Для этого в периферической крови человека определяют абсолютное содержание естественных киллеров (CD16+ лимфоцитов) и концентрацию растворимого рецептора апоптоза (sAPO-1). При содержании CD16+ более 0,5×10⁹ кл/л и концентрации sAPO-1 более 4000 пг/мл прогнозируют риск развития злокачественных новообразований. Использование данного способа позволяет выявлять злокачественные новообразования на ранних стадиях развития с использованием иммунологических методов. 4 пр.

Способ прогнозирования риска развития злокачественных новообразований, отличающийся тем, что в периферической венозной крови человека определяют абсолютное содержание естественных киллеров (CD16+ лимфоцитов) и концентрацию растворимого рецептора апоптоза (sAPO-1); при содержании CD16+ более 0,5×10⁹ кл/л и sAPO-1 более 4000 пг/мл прогнозируют риск развития злокачественных новообразований.