МОДЕЛЬНАЯ ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ПРОВЕРКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ ПРОЦЕСС В ПОЧЕЧНОЙ ТКАНИ Российский патент 2011 года по МПК G09B23/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к нефрологии, биотехнологии и экспериментальной иммунологии и может быть использовано для сравнительного изучения влияния различных препаратов на развитие воспалительного процесса при экспериментальном пиелонефрите in vitro. Изобретение позволяет изучать противовоспалительную и нефропротекторную активность и проводить скрининг лекарственных средств.

Уровень техники

В большинстве случаев патогенез пиелонефрита связывают с токсическим действием бактерий, в первую очередь патогенных штаммов E.coli, и лечение направлено, прежде всего, на элиминацию возбудителя (антибиотикотерапия). Однако основным механизмом рубцового повреждения почки является развитие воспалительного процесса, а не собственно бактериальной колонизации при пиелонефрите.

Основным эффекторным звеном в развитии воспаления и последующей деструкции почечной ткани служит инфильтрация лейкоцитов в ответ на бактериальную инвазию (Gupta et al., 1996). Эта естественная реакция организма на патогены протекает без патологического влияния на окружающую ткань лишь тогда, когда активные формы кислорода (АФК) вырабатываются лейкоцитами и макрофагами в фагоцитарных вакуолях внутри клеток. Однако при внеклеточном выбросе АФК они начинают повреждать окружающие клетки почки, приводя к разрушению ткани почки и ее дисфункции. В большинстве случаев бактериальная инфекция вызывает именно избыточную активацию воспалительного ответа и окислительный взрыв в нейтрофилах в ответ на патогенных бактерий затрагивает и окружающую ткань (Mundi et al., 1991). Генерация радикалов осуществляется нейтрофилами, моноцитами и мезангиальными клетками, мигрирующими в очаг воспаления при остром пиелонефрите.

Выяснение механизмов развития окислительного стресса в клетках почки при пиелонефрите позволит разрабатывать способы иммунофармакологического воздействия на эти процессы, что, в свою очередь, позволит разрабатывать новые методы лечения острого и хронического пиелонефрита и других воспалительных болезней почки.

Все существующие модели воспаления почечной ткани при пиелонефрите предполагают моделирование процесса in vivo. Так, известен способ моделирования пиелонефрита путем лапаротомического введения в мочеточник кролика культуры микроорганизмов Escherichia coli, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum (RU 2004138309/14). При другом способе моделирования пиелонефрита производят пиелотомию и вводят в лоханку почки на хлопчатобумажной нити 5% аутокаловую взвесь в количестве 01 мг/100 г массы крысы (RU 2007110619/14).

Недостатком этих методов является необходимость относительно сложных операционных манипуляций на животных, длительного постоперационного периода и высокой вероятности гибели животных. При проведении таких высокоинвазивных операций на состояние животного сильно влияет раневой и постоперационный шок, побочные эффекты наркоза, а также возможность инфицирования раны. Все это ухудшает стандартизацию модельных условий и делает необходимым повышение числа животных в экспериментальной выборке. Кроме того, на моделях in vivo невозможен широкий скрининг препаратов, поскольку число экспериментальных животных ограничено возможностью проведения операций и содержания животных.

Общепризнано, что без опытов in vitro невозможно проводить широкий скрининг веществ, потенциальных лекарственных соединений, что необходимо для начала доклинических испытаний. Модельные системы позволяют дать подробную характеристику роли иммунных клеток в воспалительном in vitro процессе и факторам, которые они выделяют, а также изучать механизмы межклеточных взаимодействий и выяснять механизмы иммунных реакций, к которым относится и воспаление почки при пиелонефрите.

Известен способ моделирования воспаления in vitro путем длительного совместного культивирования макрофагов с лимфоцитами, гранулоцитами и тучными клетками смыва перитонеальной полости с одновременным внесением в культуру макрофагов гранул зимозана, нагруженных кислым фуксином, и последующей регистрирацией появления различных переходных форм трансформированных макрофагов (RU 94041090/14). Однако данная модельная система ограничена наблюдением за морфологическими и физиологическими реакциями только иммунных клеток, тогда как известно, что при воспалительном процессе, в частности при пиелонефрите, основная патология связана именно с ответом на иммунные реакции окружающих тканей. Так, гибель почечных клеток происходит при избыточной генерации активных форм кислорода лейкоцитами, инфильтрирующимися в паренхиму почки при воспалении (Tugtepe et al, 2007).

Раскрытие изобретения

Целью изобретения является моделирование воспалительного процесса в почечной ткани in vitro для исследования механизмов повреждения клеток почки, а также механизмов межклеточных взаимодействий в очаге воспаления при пиелонефрите и тестирования потенциальных лекарственных препаратов.

Сущность изобретения заключается в том, что клетки канальцевого эпителия почки крысы культивируют совместно с лейкоцитами, активированными бактериальной суспензией E.coli.

Таким образом, первым аспектом настоящего изобретения является способ моделирования воспаления in vitro в ткани почки, включающий следующие стадии:

а) обеспечение клеток эпителия почечных канальцев;

б) обеспечение мононуклеаров периферической крови;

в) обеспечение инактивированных бактерий E.coli;

г) совместное культивирование продуктов со стадий а) и б);

д) инкубация смешанной культуры со стадии г) и продуктом со стадии в);

е) регистрация параметров окислительного стресса и жизнеспособности клеток почки.

Предпочтительно концентрация клеток почечных канальцев составляет от от 10³ до 10⁵ кл/мл, концентрация мононуклеаров от 10⁴ до 10⁶ кл/мл, концентрация Е.coli от 10⁸-10⁹ кл/мл, а инкубацию смешанной культуры проводят в среде, содержащей телячью эмбриональную сыворотку при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂.

Совместное культивирование обычно проводят в течение 1-48 часов.

Способ по изобретению предполагает реализацию нескольких этапов, а именно этапа получения изолированных почечных канальцев или первичной культуры клеток эпителия из них, этапа получения суспензии мононуклеарных клеток и этапа совместного культивирования почечных клеток и мононуклеаров в присутствии суспензии инактивированных бактерий E.coli.

Согласно способу по изобретению получают первичную культуру клеток почечных канальцев крысы. Для этого асептически удаляют почки 3-7 дневных крысят. Почки измельчают и помещают в сбалансированный буферный солевой раствор Хенкса, содержащий 140 мМ NaCl, 5,4 мМ КСl, 1,25 мМ СаСl₂, 0,44 мМ КН₂РO₄, 0,58 мМ Na₂HPO₄, 0,81 мМ MgSO₄, рН 7,4. После нескольких отмывок измельченную ткань помещают в 0,05-0,5% раствор коллагеназы типа 2 и инкубируют в течение 20-50 минут при 37°С. Крупные куски ткани удаляют, а клетки осаждают центрифугированием при 1000 g в течение 3 минут. Осадок клеток ресуспендируют в среде DMEM/F-12 1:1, содержащей 5-20% эмбриональной телячьей сыворотки, и высаживают на культуральные планшеты и чашки с плотностью 10³ до 10⁵ кл/мл. Клетки культивируют в инкубаторе с влажной атмосферой и концентрацией СО₂ 5% в течение 1-4 дней, после чего используют для проведения экспериментов.

Согласно способу по изобретению получают суспензию мононуклеарных клеток, содержащую все основные типы клеток, участвующих в воспалительном процессе: лимфоциты, нейтрофилы, макрофаги. Для выделения фракции мононуклеарных клеток периферической крови используют центрифугирование при 2000g гепаринизированной крови, полученной из яремной вены крысы в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-урографина плотностью 1,077 г/см³. Фракцию мононуклеарных клеток собирают, разбавляют питательной средой и переосаждают центрифугированием при 2000g. После этого супернатант сливают, а клетки разводят культуральной средой до необходимой концентрации.

Для индукции провоспалительного ответа лейкоцитов к совместной культуре добавляют суспензию инактивированных нагреванием до 80-100°С в течение 20-60 мин бактерий E.coli в количестве 50-200 мкл суспензии с концентрацией 10⁸-10⁹ клеток в мл.

Затем через различные промежутки времени анализируют жизнеспособность клеток почки, продукцию АФК, других радикалов и любые интересующие физиологические и иммунологические параметры воспалительного процесса, которые возможно исследовать в системе in vitro.

Вторым аспектом изобретения является способ тестирования соединений, влияющих на воспалительный процесс в почечной ткани, включающий стадии:

а) моделирование воспаления в ткани почки в условиях in vitro способом по первому аспекту изобретения;

б) добавление тестируемого соединения на стадии инкубации д) по первому аспекту изобретения;

в) регистрация параметров окислительного стресса и жизнеспособности клеток почки и

г) сравнение параметров окислительного стресса в присутствии и отсутствие тестируемого соединения.

Третьим аспектом изобретения является способ отбора эффективного соединения, влияющего на воспалительный процесс в почечной ткани, включающий стадии:

а) моделирование воспаления в ткани почки в условиях in vitro способом по первому аспекту изобретения;

б) добавление тестируемого соединения на стадии инкубации д) по первому аспекту изобретения;

в) регистрация параметров окислительного стресса и жизнеспособности клеток почки;

г) сравнение параметров окислительного стресса в присутствии и отсутствие тестируемого соединения;

д) отбор эффективного соединения.

Наконец пятым аспектом изобретения является диагностикум для моделирования воспаления in vitro в ткани почки, тестирования соединений, влияющих на воспалительный процесс в почечной ткани, и отбора эффективного соединения, влияющего на воспалительный процесс в почечной ткани, включающий:

а) клетки эпителия почечных канальцев

Клетки представляют собой монослойную культуру живых клеток почечных канальцев, поддерживаемых в инкубаторе с влажной атмосферой и концентрацией СO₂ 5% в стандартной коммерческой питательной среде DMEM/F-12 1:1, содержащей 5-20% эмбриональной телячьей сыворотки в специальной культуральной посуде (флаконы или чашки) в стерильных условиях при температуре 36-37°С.

б) мононуклеары периферической крови

Эта часть диагностикума представляет собой суспензию мононуклеарных клеток крови, полученных согласно первому аспекту изобретения и поддерживаемых в стандартной коммерческой питательной среде DMEM/F-12 1:1 в стерильных условиях в пробирках объемом 10-50 мл при температуре 36-37°С до момента осуществления сокультивирования.

в) инактивированные бактерии Е.Coli

Эта часть диагностикума представляет собой водную суспензию инактивированных нагреванием до 80-100°С в течение 20-60 мин бактерий E.coli в количестве 50-200 мкл суспензии с концентрацией 10⁸-10⁹ клеток в мл.

Техническим результатом заявленного изобретения является возможность анализа соединений, влияющих на воспалительный процесс именно в почечной ткани. Все известные заявителю на дату подачи заявки модели предназначены для оценки либо процесса воспаления как такового, либо воспаления в других тканях и органах. Диагностической системы для скрининга веществ применительно к почечной ткани не известно.

Изобретение иллюстрируется нижеследующими чертежами.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 приведены изображения совместной культуры клеток почечных канальцев и лейкоцитов крови, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии после окраски зондом 2,7-DCF DA. Представлены контрольная культура (А) и культура, активированная добавлением суспензии бактерий (Б).

На фиг.2 приведены данные оценки продукции активных форм кислорода по интенсивности флуоресценции красителя 2,7-DCF в культивируемых клетках почечных канальцев через 24 часа сокультивирования с лейкоцитами крови, активированными бактериальной суспензией. Показано снижение интенсивности флуоресценции красителя 2,7-DCF при инкубации клеток в присутствии 100 мкМ антиоксиданта Trolox.

Осуществление изобретения

Способ по изобретению иллюстрируется нижеследующим конкретным примером, в котором приведен наилучший вариант осуществления изобретения, то есть не ограничивающий область притязаний изобретения.

ПРИМЕР

Через 2 суток культивирования клеток почечного эпителия в 24 луночном планшете добавляли в каждую лунку по 400 мкл суспензии мононуклеарных клеток в среде ДМЕМ/Ф-12 с концентрацией 10⁶ кл/мл. Через 20 мин к смешанной культуре добавляли по 20 мкл суспензии инактивированных автоклавированием при 100°С бактерий E.coli с концентрацией 10⁸ кл/мл в растворе 0,9% хлорида натрия.

Через 3 часа и 24 часа определяли продукцию АФК с помощью конфокальной микроскопии. Образование активных форм кислорода детектировали с помощью 2,7-дихлорфлуоресцеина 2,7-DCF DA (Invitrogen, США). Смешанную культуру лейкоцитов и почечных клеток инкубировали в течение 10 минут при 25°С в среде инкубации, содержащей 10 мкМ 2,7-DCF DA. Затем клетки отмывали культуральной средой в течение 5 мин и анализировали с помощью лазерной конфокальной сканирующей микроскопии на микроскопе LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Для визуализации DCF использовали возбуждающий лазер 488 нм и измеряли флуоресценцию в диапазоне 510-530 нм. Изображение обрабатывалось программным пакетом ImageJ.

Флуоресценция DCF в совместной культуре без добавления суспензии инактивированных бактерий представлена на фиг.1А, увеличение интенсивности флуоресценции DCF через 3 часа сокультивирования после добавления суспензии инактивированных бактерий представлено на фиг.1Б. Сравнение средней интенсивности флуоресценции DCF, полученное с 10 полей зрения для каждого эксперимента, показало более чем трехкратное усиление продукции АФК (измеряемого по флуоресценции DCF) через 24 часа после индукции воспалительной реакции в присутствии инактивированных бактерий по сравнению с контролем (фиг.2). При добавлении к совместной культуре 100 мкМ антиоксиданта Trolox (водорастворимая форма α-токоферола) на все время сокультивирования (24 часа), наблюдалось снижение интенсивности флуоресценции DCF почти до контрольных значений. Эти данные указывают на снижение генерации АФК под действием Тролокса, то есть снижение провоспалительного ответа в почечной ткани.

Краткое описание процедуры тестирования и отбора перспективных соединений

1. Культивирование клеток почечного эпителия в течение выбранного срока.

2. Добавление суспензии мононуклеарных клеток в необходимой концентрации.

3. Добавление к смешанной культуре нужного количества суспензии инактивированных бактерий E.coli.

4. Диагностикум-набор готовят в многолуночных планшетах, чтобы суммарное количество лунок перекрывало необходимое количество повторов и концентраций для каждого тестируемого вещества. Добавляют тестируемые вещества в разные лунки планшета. Используют от 3 до 10 разведений каждого тестируемого вещества.

5. Через выбранный промежуток времени инкубации проводят определение продукции АФК в каждой лунке.

6. Определяют среднюю величину продукции АФК для каждой концентрации каждого тестируемого вещества.

7. Сравнивают величины продукции АФК в диагностикумах с тестируемыми веществами с величиной продукции АФК в диагностикумах без добавления тестируемых веществ.

8. Ранжируют тестируемые вещества по следующим признакам: 1) уменьшение продукции АФК по сравнению с эталонным диагностикумом, 2) наименьшие концентрации тестируемого вещества, при которых выявлялось уменьшение продукции АФК.

9. В качестве перспективных отбирают соединения, которые продемонстрировали наибольшее снижение продукции АФК при наименьшей концентрации тестируемого соединения.

Приведенные выше примеры предназначены только для иллюстрации осуществимости изобретения. Специалисту в данной области должно быть хорошо понятно, что в способы по изобретению могут быть внесены при необходимости дополнения и изменения (модификации), которые не влияют на сущность изобретения, то есть должны подпадать под объем притязаний по изобретению, отраженный в формуле изобретения, приводимой ниже.

Изобретение относится к области медицины, а именно к нефрологии, биотехнологии и экспериментальной иммунологии. Для моделирования воспаления in vitro в ткани почки, тестирования соединений, влияющих на воспалительный процесс в почечной ткани и отбора эффективного соединения, используют набор, состоящий из клеток эпителия почечных каналов; мононуклеаров периферической крови и инактивированных бактерий E.Coli. Моделирование включает стадии: обеспечение клеток эпителия почечных каналов; обеспечение мононуклеаров периферической крови; обеспечение инактивированных бактерий E.coli; совместное культивирование продуктов со стадий а) и б); инкубация смешанной культуры со стадии г) и продуктом со стадии в); регистрация параметров окислительного стресса и жизнеспособности клеток почки. Для тестирования соединений, влияющих на воспалительный процесс в почечной ткани, добавляют тестируемое соединение на стадии инкубации, регистрируют и сравнивают параметры окислительного стресса и жизнеспособности клеток почки в присутствии и отсутствие тестируемого соединения. Отбирают эффективное соединение, влияющее на воспалительный процесс в почечной ткани. Способ позволяет провести анализ соединений, влияющих на воспалительный процесс, непосредственно в почечной ткани in vitro. 4 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Набор для моделирования воспаления in vitro в ткани почки, тестирования соединений, влияющих на воспалительный процесс в почечной ткани и отбора эффективного соединения, влияющего на воспалительный процесс в почечной ткани, включающий:
а) клетки эпителия почечных каналов;
б) мононуклеары периферической крови и
в) инактивированные бактерии Е.соli.

2. Способ моделирования воспаления in vitro в ткани почки, включающий следующие стадии:
а) обеспечение клеток эпителия почечных каналов;
б) обеспечение мононуклеаров периферической крови;
в) обеспечение инактивированных бактерий E.coli;
г) совместное культивирование продуктов со стадий а) и б);
д) инкубация смешанной культуры со стадии г) и продуктом со стадии в);
е) регистрация параметров окислительного стресса и жизнеспособности клеток почки.

3. Способ по п.2, в котором концентрация клеток почечных каналов составляет от от 10³ до 10⁵ кл/мл.

4. Способ по п.2, в котором концентрация мононуклеаров составляет от 10⁴ до 10⁶ кл/мл.

5. Способ по п.2, в котором концентрация E.coli составляет от 10⁸-10⁹ кл/мл.

6. Способ по п.2 д), в котором инкубацию проводят в среде, содержащей телячью эмбриональную сыворотку при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂.

7. Способ по п.2 г), в котором совместное культивирование на стадии проводят в течение 1-48 ч.

8. Способ тестирования соединений, влияющих на воспалительный процесс в почечной ткани, включающий стадии:
а) моделирование воспаления в ткани почки в услових in vitro способом по п.2;
б) добавление тестируемого соединения на стадии инкубации д);
в) регистрации параметров окислительного стресса и жизнеспособности клеток почки; и
г) сравнение параметров окислительного стресса в присутствие и отсутствие тестируемого соединения.

9. Способ отбора эффективного соединения, влияющего на воспалительный процесс в почечной ткани, включающий стадии:
а) моделирование воспаления в ткани почки в условиях in vitro способом по п.1;
б) добавление тестируемого соединения на стадии инкубации д);
в) регистрация параметров окислительного стресса и жизнеспособности клеток почки;
г) сравнение параметров окислительного стресса в присутствие и отсутствие тестируемого соединения;
д) отбор эффективного соединения.