СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГРАНУЛЕМАТОЗНОГО ВОСПАЛЕНИЯ IN VITRO Российский патент 1998 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной патологии и иммунологии, и может быть использовано для исследования механизмов клеточной дифференцировки и трансформации в очаге гранулематозного воспаления, в частности механизмов дифференцировки мононуклеарных фагоцитов и их трансформации в эпителиоидные клетки и гигантские многоядерные клетки. Выяснение этих механизмов позволит разрабатывать способы иммунофармакологического воздействия на эти процессы, что, в свою очередь, позволит разрабатывать новые методы иммунофармакологического лечения воспалительных гранулематозных болезней.

Согласно классификации, основанной на морфологическом принципе (по структуре гранулем), выделяют гранулемы инородных тел, эпителиоидно-клеточные гранулемы, смешанные гранулемы и другие [1]. Общепризнано, что без опытов in vitro невозможно дать подробную характеристику отдельным субпопуляциям иммунокомпетентных клеток в иммунопатологическом процессе и факторам, которые они выделяют, а также изучать механизмы межклеточных взаимодействий и выяснять механизмы иммунных реакций, к которым можно отнести и воспаление. Известно, что в культуре ткани, содержащей макрофаги, гигантские многоядерные клетки и эпителиоидные клетки появляются на 2 неделе после начала культивирования [2, 3]. Однако использование не диссоциированных на клетки культур тканей, культур клеток, полученных из уже сформировавшихся гранулем, также как и использование "чистых" культур макрофагов при моделировании гранулематозного воспаления in vitro, не позволяет достаточно глубоко исследовать иммунные механизмы, участвующие в регуляции процессов клеточной дифференцировки и трансформации в очаге гранулематозного воспаления, в том числе и иммунных механизмов, влияющих на дифференцировку мононуклеарных фагоцитов и их трансформацию в эпителиоидные клетки и гигантские многоядерные клетки [4, 5]. Вместе с тем имеются экспериментальные и клинические данные, свидетельствующие о том, что в формировании эпителиоидно-клеточных и смешанных гранулем большую роль играют иммунные механизмы, включающие когнатные взаимодействия между клетками, в которых участвуют различные субпопуляции лимфоцитов [6, 7] . Показано, что процессы образования гигантских многоядерных клеток можно инициировать в однослойных культурах непримированных макрофагов после внесения в культуру супернатантов культур лимфоцитов, инкубированных с лектинами (Con A, PHA), супернатантов миксткультур лимфоцитов и супернатантов культур сенсибилизированных in vivo лимфоцитов после их стимуляции in vitro специфическими антигенами [8, 9, 10]. Однако инициировать процессы образования эпителиоидных клеток в однослойных культурах макрофагов такими способами не удавалось. Особенностью разработанной модели по сравнению с известными способами моделирования in vitro процессов клеточной (макрофагальной) дифференцировки и трансформации, протекающих в очаге хронического воспаления, основанными на использовании очищенных от "посторонних" клеток однослойных культур макрофагов, является предварительное (до внесения частиц для фагоцитоза или других индукторов воспаления) совместное культивирование макрофагов с лимфоцитами, гранулоцитами и тучными клетками (из смыва перитонеальной полости) и длительное совместное культивирование перитонеальных макрофагов, фагоцитировавших химически модифицированные гранулы зимозана, с лимфоцитами.

Задача изобретения - разработать способ моделирования in vitro процессов формирования смешанных воспалительных гранулем, сочетающих реакции типа "гранулем инородных тел" с гиперчувствительными эпителиоидно-клеточными гранулемами.

Цель изобретения - разработать способ моделирования гранулематозного воспаления in vitro, позволяющий исследовать закономерности и механизмы клеточной дифференцировки и трансформации, а также механизмы межклеточных взаимодействий в очаге "иммунного" и "неиммунного" гранулематозного воспаления для разработки методов иммунофармакологического лечения гранулематозных болезней.

Способ состоит в кратковременном начальном совместном культивировании макрофагов, лимфоцитов, гранулоцитов и тучных клеток, последующем внесении в однослойную культуру макрофагов гранул зимозана, нагруженных кислым фуксином, длительном совместном культивировании макрофагов и лимфоцитов и осуществляется следующим образом. Из перитонеальной полости мышей (путем вымывания стерильной средой 199 для культивирования клеток) получают перитонеальную жидкость, содержащую смесь макрофагов, лимфоцитов, гранулоцитов и тучных клеток. Клетки осаждают центрифугированием, надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют свежую порцию стерильной среды 199, содержащую 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина, подсчитывают количество клеток в суспензии в камере для счета клеток и доводят концентрацию клеток в суспензии до 2 • 10⁶/мл. По 2 мл суспензии перитонеальных клеток вносят в стерильные пластиковые чашки Петри с диаметром 40 мм, на дно которых помещаются обезжиренные стерильные покровные стекла (24х24 мм). Клетки инкубируют при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂ в течение 1 сут. После этого из чашек убирают супернатант, содержащий, главным образом, лимфоциты и в небольшом количестве тучные клетки и неадгезированные макрофаги. В чашки Петри с прикрепившимися к стеклу макрофагами и небольшим количеством гранулоцитов и адгезированных лимфоцитов вносят 2 мл свежей среды 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, а также гранулы зимозана, нагруженные (окрашенные) кислоым фуксином (ГЗФ, Рубин С, мол. формула - C₂₀H₁₇N₃O₉Na₂S₃) в такой концентрации, чтобы соотношение частицы : клетки было равное 10 : 1. Монослой макрофагов инкубируют с ГЗФ при 37^oC в течение 1 ч. Затем супернатант, содержащий нефагоцитированные ГЗФ, удаляют, монослой макрофагов промывают средой 199 (1 раз) и вносят в чашку Петри 1 мл среды 199, содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина. Супернатант (полученный ранее), содержащий лимфоциты и другие неадгезированные клетки, центрифугируют, к осажденным клеткам добавляют 1 мл среды 199 (содержащей 10% сыворотки эмбрионов коров, 100 ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина). Суспензию неадгезированных перитонеальных клеток, содержащую, главным образом, лимфоциты, вносят в культуру макрофагов. Смешанную культуру макрофагов и лимфоцитов инкубируют при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂, в течение 3 сут. Затем среду для культивирования заменяют по схеме, описанной выше. Процедуру замены среды для культивирования клеток с возвратом лимфоцитов в культуру макрофагов проводят через каждые 3 сут. Через различные интервалы времени после начала культивирования (2 - 14 сут) стекла с монослоем макрофагов промывают в среде для культивирования, клетки фиксируют в абсолютном метаноле и окрашивают 10 - 15 мин в 1%-ном растворе основного фуксина, по Романовскому в модификации Филлипсона (или другими методами окраски для световой микроскопии), заключают в глицерин (на предметных стеклах) и исследуют методами световой микроскопии. Через различные интервалы времени после начала культивирования в культуре макрофагов регистрируют появление различных переходных трансформированных форм макрофагов, эпителиоидных клеток, гигантских многоядерных клеток, количественные и качественные характеристики межклеточных контактов, количество делящихся клеток в культуре, количество образуемых ими кластеров (скоплений) и другие параметры, характеризующие особенности клеточной дифференцировки и трансформации, а также межклеточные взаимодействия. Оценку результатов культивирования проводят по 3 - 5 препаратам; на каждом препарате просматривают 5000 клеток.

Пример 1. Через 1 сут после начала культивирования (до внесения ГЗФ в смешанную культуру макрофагов и других перитонеальных клеток) в культуре макрофагов эпителиоидные клетки отсутствуют, многоядерные клетки представлены только двухъядерными макрофагами, количество которых не превышает 0,5%.

Пример 2. Через 1 сут после начала совместного культивирования перитонеальных макрофагов с другими клетками смыва перитонеальной полости в культуру макрофагов вносили ГЗФ, культивирование макрофагов проводили без процедуры возврата лимфоцитов в культуру клеток. Через 10 сут после начала культивирования в монослое макрофагов зарегистрировано появление 2,6 ± 0,2(%) клеток эпителиоидного типа, 6,4±0,3(%) гигантских многоядерных клеток (2 - 7 ядерных) типа Пирогова-Лангханса, образование большого количества межклеточных контактов.

Пример 3. Через 1 сут после начала совместного культивирования перитонеальных макрофагов с другими клетками смыва перитонеальной полости в культуру макрофагов вносили ГЗФ, дальнейшее культивирование макрофагов проводили совместно с лимфоцитами, т.е. с процедурой возврата лимфоцитов в культуру макрофагов после очередной смены среды для культивирования клеток. Через 10 сут после начала совместного культивирования макрофагов и лимфоцитов в культуре макрофагов зарегистрировано появление 6,8±0,4(%) эпителиоидных клеток разных типов, более 10% переходных форм трансформированных макрофагов, 6,7±0,2(%) гигантских многоядерных клеток (2 - 10 ядерных) типа Пирогова-Лангханса, наличие большого количества межклеточных контактов, наличие делящихся эпителиоидных клеток, а также формирование кластеров, состоящих из эпителиоидных клеток.

Список литературы
1. Струков И. А., Кауфман О.Я. Гранулематозное воспаление и гранулематозные болезни.- М.: Медицина, 1989, - 182 с.

2. Rhee H.J., van Burgh de Winter C.P.M., Daems M.Th. The differentiation of monocytes into macrophages, epithelioid cells and multinucleated giant cells In subcutaneous granulomas. // Cell. Tiss. Res.- 1979,- Uol. 197. - N3.- P.355-738.

3. Rhee N. J., van Burgh de Winter, Daems M.Th. The differentiation of monocytes into giant cells in subcutaneous granulomas. // Cell. Tiss. Res.- 1979.- Uol. 197.- N3.- P.379-396.

4. Маянский Д.H. Хроническое воспаление.- M.: Медицина, 1991.- 271 c.

5. Bonney R.J., Gery l., T.-Y.LIn, Meyenhofer W.A., Davies P. Mononuclear phagocytes from carrageenan-induced granulomas. // J. Exp. Med.- 1978.- Uol.-148.- N1.- P.261-275.

6. Adams D.O. The biology of the granulomas // Pathology of granulomas/ Ed, H.L.Iochim.- New York, 1983.- P. 1-19.

7. Oord J.J., Chris de Wolf-Peeters, Facchetti F., Desmet U.J. Cellular composition of hypersensivity-type granulomas: Immunochemical analysis of tuberculous and sarcoidal lymphadenitis. // Hum. Path.- 1984,- Uol.- 15.- N6.- P.559-565.

8. Edelson P.J., Cohn Z,A. Effect of concanavalin A on mouse peritoneal macrophages. //J.Exp.Med.-1974.- Uol.140.-P.1364-1386.

9. Sone S., Bucana C., Hoyer L., Fidler l. Kinetiks and ultrastructural studies of the induction of rat alveolar macrophage fusion by mediators released from mitogen-stimulated lymphocytes.// Amer. J. Path.- 1981.- Uol. 103.- P.234-246.

10. Boros D. Limphokines,- N.Y.: Acad. Press, 1981.- Vol.3.- P.257-281.

Способ может быть использован в области медицины, а именно в экспериментальной патологии и иммунологии для исследования механизмов клеточной дифференцировки и трансформации в очаге гранулематозного воспаления, а также механизмы межклеточных взаимодействий в очаге "иммунного" и "неиммунного" гранулематозного воспаления и впоследствии разработки методов иммунофармакологического лечения гранулематозных болезней. Проводят длительное культивирование макрофагов и лимфоцитов в монослое на стекле, причем после совместного культивирования макрофагов с лимфоцитами, гранулоцитами и тучными клетками смыва перитонеальной полости, супернатант, содержащий все неадгезированные клетки, убирают, неадгезированные макрофаги и лимфоциты возвращают в культуру макрофагов в свежей порции среды после внесения в культуру макрофагов гранул зимозана, нагруженных кислым фуксином, смешанную культуру макрофагов и лимфоцитов инкубируют при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей сыворотку эмбрионов коров, пенициллин и стрептомицин, процедуру среды повторяют через каждые 3 сут одновременно с процедурой возврата в культуру макрофагов неадгезированных лимфоцитов, и через различные интервалы времени методами световой микроскопии регистрируют в культуре макрофагов появление различных переходных форм трансформированных макрофагов, гигантских многоядерных клеток, эпителиоидных клеток, формирование межклеточных контактов, образование кластеров, состоящих из эпителиоидных клеток. Способ обеспечивает глубокое исследование иммунных механизмов.

Способ моделирования гранулематозного воспаления in vitro путем длительного культивирования перитонеальных макрофагов мышей в монослое на стекле, отличающийся тем, что через 1 сутки после совместного культивирования макрофагов с лимфоцитами, гранулоцитами и тучными клетками смыва перитонеальной полости супернатант, содержащий все неадгезированные клетки, убирают, неадгезированные макрофаги и лимфоциты возвращают в культуру макрофагов в свежей порции среды после внесения в культуру макрофагов гранул зимозана, нагруженных кислым фуксином, смешанную культуру макрофагов и лимфоцитов инкубируют при 37^oC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO₂, в среде, содержащей сыворотку эмбрионов коров, пенициллин и стрептомицин, процедуру замены среды повторяют через каждые 3 суток одновременно с процедурой возврата в культуру макрофагов неадгезированных лимфоцитов и через различные интервалы времени после начала совместного культивирования макрофагов и лимфоцитов методами световой микроскопии регистрируют в культуре макрофагов появление различных переходных форм трансформированных макрофагов, гигантских многоядерных клеток, эпителиоидных клеток, делящихся эпителиоидных клеток, формирование межклеточных контактов, образование кластеров, состоящих из эпителиоидных клеток.