СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ОСТРОГО ПОСТСТРЕПТОКОККОВОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2009 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии, патологической физиологии и экспериментальной медицине, и может быть использовано для изучения патогенеза, морфогенеза острого постстрептококкового гломерулонефрита и доклинического исследования эффективности новых лекарственных препаратов.

Пиогенные стрептококки относятся к наиболее распространенным возбудителям постинфекционных поражений сердца и почек. Поэтому воспроизведение в эксперименте адекватной модели постстрептококкового гломерулонефрита с целью доклинической апробации новых лекарственных средств является актуальной задачей практического здравоохранения. Наиболее близким аналогом является способ иммунизации кроликов весом 2,0-2,5 кг инактивированным штаммом Streptococcus pyogenes в течение 6-8 недель (Тотолян А.А., Бурова Л.А. Критический анализ предполагаемых механизмов патогенеза постстрептококкового гломерулонефрита // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2001, Том 3, №4, стр.316-323; Бурова Л.А., Гаврилова Е.А., Пигаревский П.В., Селиверстова В.Г, Нагорнев В.А., Шален К., Тотолян А.А. Способность стрептококков группы А типа М 12 связывать иммунные комплексы и их роль в патогенезе постстрептококкового гломерулонефрита // Медицинская Иммунология, 2007, Том 8, №5-6, стр.623-630). Недостатками известного способа являются дороговизна исследования, длительность и сложность проводимого эксперимента.

Технический результат: упрощение способа моделирования острого постстрептококкового гломерулонефрита на животных, повышение воспроизводимости, сокращение времени эксперимента и удешевление методики.

Указанные задачи достигаются путем многократной иммунизации белых беспородных крыс нефритогенным штаммом пиогенного стрептококка - Dick-I Streptococcus pyogenes (ГНИИ стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича) по новой схеме.

Способ осуществляют следующим образом. Белых беспородных крыс иммунизируют инактивированной бактериальной суспензией эталонного штамма Dick-I Streptococcus pyogenes (ГНИИ стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича). Антигенную суспензию для иммунизации животных получают путем культивирования штамма на мясопептонном бульоне в аэробных условиях при температуре +37°С, центрифугирования суточной бульонной культуры Streptococcus pyogenes в течение 10-15 минут при скорости 3000 оборотов в минуту и последующего удаления супернатанта. Полученную взвесь концентрацией 10⁹ КОЕ/мл, определяемой на КФК-3 (оптическая плотность 0,028, длина волны 540 нм, кювета - 1,060 мм), инактивируют при +56°С в течение 30 минут. Из расчета 50 мкл взвеси на 1 животное готовят разведение: 9 мл стерильного физиологического раствора и 1 мл взвеси (на 1 животное приходится 500 мкл (0,5 мл) полученной вновь взвеси антигенной суспензии). Иммунизацию животных проводят внутрибрюшинно 1 раз в день по схеме: 3 цикла, каждый из которых состоял из 1, 3, 5 дней иммунизации и 2 дней перерыва между циклами.

Эксперимент выполнен на 30 животных - самцах и самках беспородных белых крыс четырехмесячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755) и «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» от 18 марта 1986 г.

Животные были разделены на 2 экспериментальные группы: I группа - контрольная (интактные животные); II группа - моделирование острого гломерулонефрита.

I группа - контрольная (интактные животные), n=10;

II группа - животные, иммунизированные бактериальной суспензией штамма Streptococcus pyogenes, n=20. II группа (опытная) была подразделена на 2 подгруппы, различающихся сроком забора органов (21 и 31 день).

Перед началом эксперимента у животных контрольной (интактной) и опытной группы проводили анализ разовой порции мочи на белок, используя качественную реакцию с 20% сульфосалициловой кислотой. В конце каждого цикла иммунизации у животных контрольной и опытной групп также исследовали разовую порцию мочи на белок. По окончании опыта животных выводили из эксперимента путем перерезки спинного мозга под эфирным наркозом с соблюдением правил эвтаназии. Внутренние органы забирали для проведения гистологического исследования.

Результаты экспериментов подвергнуты статистической обработке с применением компьютерных программ Microsoft Excel и Biostat.

У животных контрольной группы не было выявлено лабораторных и гистологических признаков развития гломерулонефрита. В течение всего эксперимента в моче животных этой группы белок не выявлялся.

При проведении гистологического исследования в почках четко выявлялась капсула почки, корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами, мозговое вещество почки. Хорошо визуализировались сосочек и почечная лоханка, выстланная переходным эпителием. Сосудистые клубочки не были изменены, капсула не утолщена. Между почечными тельцами находились проксимальные и дистальные почечные канальцы с типичной структурой. Прямые канальцы в мозговом веществе и собирательные трубочки - без особенностей.

При исследовании мочи на содержание белка у 90% иммунизированных животных к 21 дню иммунизации был положительный результат.

На секции отмечались макроскопические признаки застойной сердечной недостаточности: общее венозное полнокровие; увеличение печени (печень плотная, темная); инъецированность сосудов брыжейки, имелись небольшие кровоизлияния.

При проведении гистологического исследования аутопсийного материала, полученного от иммунизированных животных к 21 дню эксперимента, в ткани почек выявлялось полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев, большое количество увеличенных гиперцеллюлярных клубочков с резко уменьшенным мочевым пространством, инфильтрированных нейтрофильными гранулоцитами и лимфоцитами, с мезангиальной пролиферацией. Отмечалось сужение просветов капилляров за счет пролиферации эндотелиальных и мезангиальных клеток, что обусловило лапчатость отдельных клубочков. Таким образом, в этом сроке отмечалась экссудативная фаза воспаления в клубочках. В проксимальных и дистальных канальцах нефронов имелись участки белковой дистрофии эпителия, воспалительная инфильтрация стромы преимущественно лимфоцитами с примесью небольшого количества нейтрофилов и гистиоцитов.

При проведении гистологического исследования аутопсийного материала, полученного от иммунизированных животных к 31 дню эксперимента, в клубочках начинали преобладать процессы пролиферации, что выражалось в появлении наряду с мезангиальной и эндотелиальной пролиферацией отложения нитей фибрина и белковых масс в капсуле Боумена, сращении капилляров клубочка с капсулой и образовании микрополулуний в отдельных клубочках. Имелся тромбоз капилляров клубочков. Их базальная мембрана была утолщена. В проксимальных и дистальных канальцах отмечалась белковая дистрофия эпителия, в строме - воспалительная инфильтрация нейтрофильными гранулоцитами и лимфоцитами.

Воспроизводимость способа составила 100%. У всех животных после иммунизации развивались гистологические признаки острого гломерулонефрита.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Самке беспородной белой крысы (№3), массой 164,0 г, в течение 3 недель внутрибрюшинно 1 раз в день вводили микробную суспензию культуры Streptococcus pyogenes по следующей схеме: 3 цикла, каждый из которых состоял из 1, 3, 5 дней иммунизации и 2 дней перерыва между циклами. В конце каждого цикла иммунизации проводилась качественная реакция с 20% сульфосалициловой кислотой для определения белка в разовых порциях мочи. В конце 3-й недели иммунизации животное под эфирным наркозом было выведено из эксперимента, почки фиксировали в нейтральном формалине с целью последующего комплексного морфологического исследования.

К концу 2 недели иммунизации в моче животного отмечалась положительная реакция на белок.

При исследовании в проходящем свете образцов почечной ткани, окрашенных гематоксилином и эозином, выявлялось полнокровие сосудов коркового и мозгового слоев, большое количество увеличенных гиперцеллюлярных клубочков с резко уменьшенным мочевым пространством, инфильтрированных нейтрофильными гранулоцитами и лимфоцитами, с мезангиальной пролиферацией. Отмечалось сужение просветов капилляров за счет пролиферации эндотелиальных и мезангиальных клеток. В проксимальных и дистальных канальцах нефронов имелись участки белковой дистрофии эпителия, воспалительная инфильтрация стромы преимущественно лимфоцитами с примесью небольшого количества нейтрофилов и гистиоцитов.

Пример 2. Самцу белой беспородной крысы (№5), массой 155,0 г, в течение 3 недель внутрибрюшинно 1 раз в день вводили микробную суспензию культуры Streptococcus pyogenes по следующей схеме: 3 цикла, каждый из которых состоял из 1, 3, 5 дней иммунизации и 2 дней перерыва между циклами. На 31 день иммунизации животное под эфирным наркозом было выведено из эксперимента, почки фиксировали в нейтральном формалине с целью последующего комплексного морфологического исследования.

При исследовании разовой порции мочи на белок при помощи качественной реакции с 20% сульфосалициловой кислотой выявлена положительная реакция в конце 2 недели иммунизации.

При проведении гистологического исследования аутопсийного материала в клубочках наряду с мезангиальной и эндотелиальной пролиферацией наблюдались отложения нитей фибрина и белковых масс в капсуле Боумена, сращение капилляров клубочка с капсулой и образование микрополулуний в отдельных клубочках. В части клубочков имелся тромбоз капилляров. Базальная мембрана капилляров клубочка была утолщена. В проксимальных и дистальных канальцах отмечалась белковая дистрофия эпителия, в строме - воспалительная инфильтрация нейтрофильными гранулоцитами и лимфоцитами.

Предлагаемый способ позволяет изучить патогенез, морфогенез острого постстрептококкового гломерулонефрита и проводить доклинические исследования эффективности новых лекарственных препаратов для лечения острого постстрептококкового гломерулонефрита у людей.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к экспериментальной нефрологии, и может быть использовано для моделирования острого постстрептококкового гломерулонефрита. Для этого белой беспородной крысе вводят внутрибрюшинно 1 раз в день штамм Streptococcus pyogenes Dick-I с концентрацией 10⁹ КОЕ/мл, в разведении 1:9, в дозе 0, 5 мл взвеси. Введение осуществляют по следующей схеме - 3 цикла, каждый из которых состоял из 1, 3, 5 дней иммунизации и 2 дней перерыва между циклами. Способ обеспечивает повышение воспроизводимости, сокращение времени эксперимента, удешевление методики, а также прост в исполнении.

Способ моделирования острого постстрептококкового гломерулонефрита в эксперименте путем многократного введения штамма Streptococcus pyogenes лабораторному животному, отличающийся тем, что в качестве лабораторного животного используют белую беспородную крысу, которой вводят внутрибрюшинно 1 раз в день штамм Streptococcus pyogenes Dick-I с концентрацией 10⁹ КОЕ/мл, в разведении 1:9, в дозе 0,5 мл взвеси по следующей схеме - 3 цикла, каждый из которых состоял из 1, 3, 5 дней иммунизации и 2 дней перерыва между циклами.