СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛЕЙ ЛАЗЕРНОЙ ГИПЕРТЕРМИЕЙ Российский патент 2011 года по МПК A61N5/67 B82B1/00 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для проведения лазерной гипертермии злокачественных новообразований.

Применение нанотехнологий в биомедицине открывает новые возможности для диагностики и терапии злокачественных новообразований, в частности, при лазерной гипертермии опухолей.

Наиболее перспективными на сегодняшний день наночастицами признаны так называемые плазмонно-резонансные наночастицы, выполненные из золота, серебра и др. металлов. Они обладают уникальным свойством возбуждать локализованный поверхностный плазменный резонанс в видимой или ближней ИК-области спектра, что приводит к повышенному поглощению и рассеянию ими зондирующего излучения [1]. Существует возможность настройки спектрального положения и амплитуды плазменного резонанса за счет изменения природы металла, размера, формы, структуры частиц и их диэлектрического окружения. Таким образом, путем варьирования различных параметров таких наночастиц можно контролировать длину волны плазменного резонанса и получать частицы с заданными оптическими свойствами [2, 3].

Известно, что плазмонно-резонансные наночастицы могут быть выполнены в различной форме, в частности в виде сферических наночастиц, нанооболочек, наностержней и др.

Немаловажным достоинством этих наночастиц является низкая токсичность, что делает их безопасными для применения в живых организмах. К тому же, в силу своего размера, они обладают высокой способностью проникать внутрь опухоли через эндотелий капилляров и накапливаться в ней. Эта способность обуславливает феномен избирательного накопления наночастиц в опухоли [4].

Лазерная гипертермия опухолей широко применяется с конца прошлого столетия. Однако существующие способы лазерной гипертермии направлены либо на общий нагрев организма, либо на локальный нагрев тканей, осуществляемый при интерстициальном введении световода. Принцип лазерной гипертермии заключается в том, что опухолевые клетки ввиду особенностей метаболизма более чувствительны к нагреванию по сравнению с нормальными. В общем случае при проведении гипертермии осуществляется нагрев ткани до температуры 41-47°С за десятки минут [5]. При данной температуре имеет место необратимое повреждение опухолевых клеток за счет снижения вязкости мембран и денатурации белков. Большое число клинических работ демонстрирует уменьшение размеров опухоли в результате локального термического воздействия. Однако наряду с опухолевыми клетками отмечается нагрев здоровых тканей вокруг опухоли [6, 7].

Накопление наночастиц в опухолевой ткани резко повышает градиент температуры между опухолью и окружающими здоровыми тканями, что обеспечивает локальность нагрева опухоли. Это делает лазерное воздействие прицельным и снижает негативное влияние лазерного воздействия на нормальные ткани. Поэтому накопление наночастиц в опухолевой ткани открывает перспективу ее лечения путем локальной лазерной гипертермии.

В ряде работ показано, что применение плазмонно-резонансных наночастиц являются перспективным для проведения локальной гипертермии опухолей [8].

Опубликованы данные о предварительных исследованиях гипертермической терапии экспериментальных опухолей с применением разных видов плазмонно-резонансных наночастиц. Исследования проводятся преимущественно на подкожно перевитых опухолях [9, 10]. Большинство исследований посвящено неспецифической доставке наночастиц в опухоль [11].

Эффективность проведения сеанса лазерной гипертермии зависит от того, насколько правильно выбрано время начала проведения сеанса после введения наночастиц. Очевидно, что для получения терапевтического эффекта важно проводить воздействие в период максимального накопления наночастиц в опухоли. В настоящее время он подбирается либо эмпирически, либо посредством методов, которые выполняются post mortem и требуют умерщвления большого количества животных. На сегодняшний день вопросы биораспределения наночастиц в организме изучаются как методами качественной оценки: трансмиссионной электронной микроскопией, световой микроскопией [12], конфокальной микроскопией [13], двухфотонной люминесцентной микроскопией [14], так и методами количественной оценки накопления наночастиц в биологических тканях: атомно-абсорбционная спектрометрия [15], метод нейтронно-активационного анализа [16].

В настоящее время оптические методы визуализации биологических тканей признаны наиболее перспективными с точки зрения безопасности, простоты реализации и надежности устройств. Применение в данных методах света видимого и ближнего ИК-диапазона в качестве зондирующего излучения делает их неинвазивными при используемых мощностях и позволяет проводить исследования глубоких биотканей. В последние десятилетия оптические методы визуализации широко используются в различных областях биологии и медицины [17, 18]. С применением этих методов становится возможным безопасно и быстро исследовать проникновение и накопление наночастиц в биоткани на живых объектах [19-21], поскольку они чувствительны к изменению поглощающих или рассеивающих характеристик ткани.

В частности, метод оптической когерентной томографии (ОКТ) позволяет по изменению оптических характеристик визуализировать процесс взаимодействия наночастиц с биотканями. ОКТ - это новейший высокоразрешающий метод получения изображения внутренней микроструктуры тканей. Основной принцип ОКТ заключается в регистрации рассеянного тканью зондирующего излучения и построении на его основании изображения поперечного сечения исследуемой ткани. Современные ОКТ устройства обеспечивают визуализацию структур биотканей на глубину до 2 мм с пространственным разрешением в несколько микрон [22].

Так, известен способ деструкции меланомы слизистой рта у собак, включающий введение в меланому путем инъекции резонансного фотопоглотителя, представляющего собой водную суспензию золотых наночастиц, состоящих из кремниевого ядра диаметром 100-150 нм, окруженного оболочкой золота толщиной 10-20 нм, с концентрацией 10¹⁰-10¹¹ частиц/мл, и последующее облучение лазерным пучком с длиной волны 800-1150 нм при плотности оптической мощности 1-3 Вт/см² в течение 1 мин [23].

Для исключения токсического воздействия на здоровые ткани в данном способе используют фотопоглотитель в виде водной суспензии золотых наночастиц. Используемые золотые наночастицы выбранных размеров имеют максимум плазмонно-резонансного поглощения в оптическом диапазоне 800-1150 нм. При выбранных эмпирических параметрах и режимах облучения (диапазон длины волны, плотности оптической мощности лазерного излучения и время экспозиции) возникает комбинированное оптимальное физико-химическое воздействие, при котором достигается максимальный деструкционный эффект по всему объему опухоли.

Однако данный способ обладает недостаточной эффективностью, обусловленную введением раствора непосредственно в опухоль, что приводит к локальному повреждению опухоли.

Наиболее близким к предлагаемому способу по совокупности существенных признаков и достигаемому техническому результату является известный способ лечения опухолей лазерной гипертермией, выбранный авторами в качестве прототипа [24].

Данный способ осуществляют путем введения внутривенно мышам с перевитой подкожно мышиной карциномой кишечника плазмонно-резонансных золотых наночастиц, выполненных в виде нанооболочек с диаметром ядра 119 нм и размером оболочки 12 нм, обладающих максимумом экстинкции на длине волны 800 нм, после чего через 20 часов после введения наночастиц в организм проводят исследование опухоли ОКТ-методом по контрастированию ОКТ-изображения опухоли, меченной наночастицами, для этого перед исследованием на поверхность кожи над опухолью наносят просветляющий агент глицерол и затем воздействуют на опухоль лазером с длиной волны 808 нм и плотностью мощности 4 Вт/см² в течение 3 минут.

При этом вводимые животному плазмонно-резонансные золотые наночастицы имеют пик рассеяния на длине волны 850-950 нм и длине волны поглощения 750-850 нм.

Однако данный способ лечения приводит наряду с деструкцией патологической ткани к развитию некроза не только опухоли, но и окружающие здоровые ткани. Некротизация тканей нежелательный процесс, поэтому повышенный интерес исследователей направлен на индуцирование запрограммированной гибели раковых клеток - апоптозу, при котором происходит медленное и постепенное отмирание клеток без развития воспалительной реакции.

Таким образом, данный способ направлен, главным образом, на лазерное разрушение опухолевой ткани без учета возможного негативного влияния на здоровые ткани за счет отсутствия контроля максимального накопления наночастиц в опухоли.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка эффективного способа лечения опухолей лазерной гипертермией при отсутствии негативного влияния на окружающие опухоль здоровые ткани.

Поставленная задача решается предлагаемым способом лечения опухолей лазерной гипертермией, включающем введение внутривенно раствора наночастиц, способных проникать в глубину тканей и обладающих свойством плазменного резонанса, длина волны которого и связанный с ним максимум экстинции должны совпадать с длиной волны зондирующего излучения ОКТ, исследование накопления наночастиц в опухоли методом ОКТ по интенсивности ОКТ-сигнала и последующее воздействие на опухоль лазерным излучением, согласно изобретению исследование начинают через 30 мин после введения раствора наночастиц, измеряя интенсивность ОКТ-сигнала, каждые 30 мин до получения ОКТ-сигнала максимальной интенсивности.

Предпочтительно, что в качестве наночастиц используют наночастицы из золота или серебра, которые могут быть выполнены, в частности, в форме нанооболочек, наностержней и др.

Новым техническим результатом предлагаемого способа является повышение эффективности лечения опухоли при отсутствии негативного влияния на окружающие опухоль здоровые ткани.

Данный технический результат обусловлен тем, что лазерное воздействие на опухоль осуществляют при максимальном накоплении наночастиц в опухоли, за счет исследования накопления наночастиц в опухоли методом ОКТ, которое начинают через 30 мин после введения раствора наночастиц, измеряя интенсивность ОКТ-сигнала, каждые 30 мин до получения ОКТ-сигнала максимальной интенсивности сигнала, что позволяет достичь терапевтического эффекта опухоли уже при мощности лазера ~1 Вт, что не приводит к негативному влиянию излучения на окружающие опухоль здоровые ткани.

Осуществление предлагаемого способа

Способ осуществляют, используя оптический когерентный томограф с длиной волны зондирующего излучения 900 нм, пространственным разрешением 15-20 мкм, глубиной проникновения зондирующего излучения 1.2 мм, время получения ОКТ-изображения составляет 2 секунды. Полученные в процессе исследования ОКТ-изображения выводятся на монитор компьютера, при этом на ОКТ-изображении светлые оттенки соответствуют высокой интенсивности ОКТ-сигнала, темные оттенки - низкой интенсивности ОКТ-сигнала.

Предварительно получают контрольное ОКТ-изображение опухоли перед введением наночастиц для сравнения интенсивности ОКТ-сигнала до и после введения наночастиц. После чего животному внутривенно вводят раствор плазмоно-резонансных наночастиц из золота или серебра, которые могут быть стабилизированы биосовместимыми покрытиями, далее через 30 мин после введения раствора наночастиц осуществляют исследование накопления наночастиц в опухоли методом ОКТ, измеряя интенсивность ОКТ-сигнала каждые 30 мин до получения ОКТ-сигнала максимальной интенсивности, по которой судят о максимальном накоплении наночастиц в опухоли, после чего проводят лазерную гипертермию при температуре 44-45°С в течение 20 минут, для этого используют, в частности, диодный лазер с длиной волны 810 нм для наиболее глубокого проникновения излучения в биоткани и адекватный для плазменного резонанса используемых наночастиц.

Мощность лазера подобрана таким образом, чтобы нагрев опухоли до 44°С происходил плавно, но не медленнее чем за 4 минуты. Начальная мощность лазера составляет ~1.2 Вт. Нагрев опухоли проводят под непрерывным контролем ИК-термографа, который фиксирует интегральное значение температуры с поверхности кожи. Для контроля нагрева опухоли используют портативный инфракрасный термограф.

Предлагаемый способ проиллюстрирован следующими чертежами:

На фиг.1 приведена электронная микрофотография плазмонно-резонансных наночастиц (увеличение 28000);

На фиг.2 (А, Б, В) представлены ОКТ-изображения опухоли:

- на фиг.2А представлено ОКТ-изображение опухоли до введения наночастиц;

- на фиг.2Б представлено ОКТ-изображение опухоли через 2 часа после внутривенного введения наночастиц;

- на фиг.2В представлено ОКТ-изображение опухоли через 4 часа после внутривенного введения наночастиц.

На фиг.3 (А, Б, В, Г) представлены графики изменения интенсивности ОКТ-сигнала опухоли после введения наночастиц;

- на фиг.3А представлен график изменения интенсивности ОКТ-сигнала опухоли мыши №4 после введения наночастиц;

- на фиг.3Б представлен график изменения интенсивности ОКТ-сигнала опухоли мыши №5 после введения наночастиц;

- на фиг.3В представлен график изменения интенсивности ОКТ-сигнала опухоли мыши №8 после введения наночастиц;

- на фиг.3Г представлен график изменения интенсивности ОКТ-сигнала опухоли мыши №10 после введения наночастиц.

На фиг.4 изображены графики изменения температуры во время проведения сеанса лазерной гипертермии.

На фиг.5 (А, Б) представлены термограммы, отражающие нагрев опухоли:

- фиг.5А - опухоль без наночастиц (контроль);

- фиг.5Б - опухоль с плазмонно-резонансными наночастицами.

Предлагаемым способом была пролечена группа из 16 животных - самок мышей с опухолевой моделью рака шейки матки путем трансплантации суспензии опухолевой ткани. Размер опухоли на момент начала исследования составлял 7-10 мм.

В результате торможение роста опухоли после лечения составило 53%.

Примеры конкретного использования предлагаемого способа

Пример 1.

Выписка из протокола эксперимента №6

2 апреля 2009 г. Самка мышей линии СВА №4, массой 22 г с подкожно перевитой опухолью рак шейки матки (РШМ-5). Перевивку опухоли проводили по стандартной методике 16 марта 2009 г. Исследование начали через 17 дней после перевивки, когда опухоль хорошо пальпировалась и достигала в размере 0,43 см³. В хвостовую вену ввели 0.1 мл раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц с размером 200-250 нм (концентрация 10⁹ частиц/мл). Электронная микрофотография наночастиц представлена на фиг.1. До введения наночастиц без нанесения просветляющих агентов получили ОКТ-изображения опухоли с целью определения начального уровня ОКТ-сигнала (фиг.2А). После введения наночастиц осуществляли ОКТ-наблюдение за процессом накопления наночастиц в опухоли. При этом изображения получали каждые 30 минут до момента наступления времени максимального накопления. Накопление наночастиц в опухоли оценивали по возрастанию ОКТ-сигнала (фиг.2Б, В). С помощью программы OCTstat построили график изменения сигнала от времени, на котором видно, что ОКТ-сигнал в опухоли резко возрастает к 3-4 часам после инъекции (фиг.3А). Интенсивность сигнала возросла на 64 у.е.

Гипертермию провели через 4 часа. Опухоль облучали диодным лазером на длине волны 810 нм. Пучок лазера охватывал всю опухоль целиком и не превышал 1 см. Измерения температуры в опухоли проводили ИК-термографией. При начальной мощности лазера 1.2 Вт за 4 минуты температура в опухоли достигала 45°С (фиг.4). Для поддержания температуры на постоянном достигнутом уровне мощность источника пришлось снизить до 1 Вт. Для достижения терапевтического эффекта воздействие продолжали 20 минут. Получили, что присутствие наночастиц в опухоли обеспечивает локальный нагрев (фиг.5Б).

После гипертермии проводили измерение размеров опухоли (длина, ширина, высота) в течение 7 дней. Ингибирование роста опухоли оценивали по показателю регрессии роста опухоли и торможению роста опухоли (ТРО). Регрессия роста данной опухоли составила минус 41%, а ТРО 57%. Отрицательное значение регрессии означает, что объем опухоли через 7 дней не уменьшился по сравнению с начальным, но произошло торможение роста опухоли.

Пример 2.

Выписка из протокола эксперимента №6

2 апреля 2009 г. Самка мышей линии СВА №5, массой 24 г с подкожной опухолью РШМ. Перевивку опухоли проводили по стандартной методике 16 марта 2009 г. Исследование начали через 17 дней после перевивки, когда опухоль хорошо пальпировалась и достигала в размере 0,86 см³. Внутривенно ввели золото то же, что и в примере 1. Перед лазерной гипертермией проводили ОКТ-исследование накопления наночастиц в опухоли так, как описано в примере 1. Определили, что максимальное накопление наночастиц в опухоли происходит через 3.5-4 часа (фиг.3Б). Уровень ОКТ-сигнала возрос на 95 у.е. Лазерную гипертермию проводили через 4 часа по методике, описанной в примере 1. Время достижения 45°С - 3.5 минуты. Регрессия роста опухоли составила минус 24%, ТРО 61%.

Пример 3.

Выписка из протокола эксперимента №7

9 апреля 2009 г. Самка мышей линии СВА №8, массой 21 г с подкожной опухолью РШМ. Перевивку опухоли проводили по стандартной методике 24 марта 2009 г. Исследование начали через 16 дней после перевивки, когда опухоль хорошо пальпировалась и достигала в размере 0,6 см³. Внутривенно ввели золото то же, что и в примере 1.

Перед лазерной гипертермией проводили ОКТ-исследование накопления наночастиц в опухоли так, как описано в примере 1. Определили, что максимальное накопление наночастиц в опухоли происходит через 3.5-4 часа (фиг.3В). Уровень ОКТ-сигнала возрос на 100 у.е. Гипертермию проводили через 4 часа таким же способом, как описано в примере 1. Время достижения 45°С - 3 минуты. Регресс роста опухоли составил минус 3%, ТРО 69,8%. Это означает, что размер опухоли на протяжении 7 дней оставался практически неизменным.

Пример 4

Выписка из протокола эксперимента №7

9 апреля 2009 г. Самка мышей линии СВА №10, массой 27 г с подкожной опухолью РШМ. Перевивку опухоли проводили по стандартной методике 24 марта 2009 г. Исследование начали через 16 дней после перевивки, когда опухоль хорошо пальпировалась и достигала в размере 0,92 см³. Внутривенно ввели золото то же, что и в примере 1.

Перед лазерной гипертермией проводили ОКТ-исследование накопления наночастиц в опухоли так, как описано в примере 1. Уровень ОКТ-сигнала возрос на 22 у.е. (фиг.3Г). По сравнению с показателями ОКТ-сигнала у других животных, очевидно, что накопление наночастиц в опухоли произошло в значительно меньшем количестве, что недостаточно для эффективного лазерного воздействия на опухоль.

Сеанс гипертермии проводили через 4 часа по методике, описанной в примере 1. Время достижения 45°С - 7 минут. Регресс роста опухоли составил минус 117%, ТРО 15,7%.

Пример 5 (контроль).

Выписка из протокола эксперимента №7

9 апреля 2009 г. Самка мышей линии СВА №11, массой 21,3 г с подкожной опухолью РШМ. Перевивку опухоли проводили по стандартной методике 24 марта 2009 г. Исследование начали через 16 дней после перевивки, когда опухоль хорошо пальпировалась и достигала в размере 0,48 см³.

Внутривенно ввели физиологический раствор 0.1 мл. ОКТ-исследование не проводили. Лазерную гипертермию проводили через 4 часа после инъекции, как в опытной группе. Режим лазерного воздействия был такой же, как описано в примере 1. Время достижения температуры 44°С при 1.2 Вт происходило более чем за 10 минут. Для поддержания температуры на постоянном уровне в течение 20 минут мощность лазера не уменьшали. ИК-термография показала, что нагрев опухоли происходит не локально, тепло диффузно распределяется на окружающие ткани (фиг.5А).

Регрессия роста опухоли составила минус 231%. Т.е. за 7 дней объем опухоли вырос более чем в 3 раза.

Как видно из полученных результатов:

- процесс накопления наночастиц в опухоли носит индивидуальный характер, поэтому необходимо проводить объективный контроль накопления наночастиц перед началом лазерного воздействия;

- эффективность лазерной гипертермии зависит от интенсивности сигнала в опухоли, чем выше уровень сигнала в опухоли, тем больше в ней содержится наночастиц, тем эффективнее гипертермия;

- лазерная гипертермия опухолей с золотыми наночастицами происходит локально, при меньшей мощности лазера и быстрее достигается нужная температура в опухоли.

Таким образом предлагаемый способ лечения является эффективным при отсутствии негативного влияния на окружающие опухоль здоровые ткани.

Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и касается лечения опухолей лазерной гипертермией. Для этого внутривенно вводят раствор способных проникать в глубину тканей и обладающих свойством плазменного резонанса наночастиц. При этом длина волны плазменного резонанса наночастиц и связанный с ним максимум экстинции должны совпадать с длиной волны зондирующего излучения оптической когерентной томографии (ОКТ). Через 30 минут после введения раствора наночастиц исследуют накопление наночастиц в опухоли методом ОКТ. Измеряют интенсивность ОКТ-сигнала каждые 30 минут. При получении ОКТ-сигнала максимальной интенсивности воздействуют на опухоль лазерной гипертермией. Способ позволяет повысить эффективность лечения опухоли при отсутствии негативного влияния на окружающие опухоль здоровые ткани за счет проведения лазерной гипертермии при максимальном накоплении наночастиц в опухоли. 1 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Способ лечения опухолей лазерной гипертермией, включающий внутривенное введение раствора наночастиц, способных проникать в глубину тканей и обладающих свойством плазменного резонанса, длина волны которого и связанный с ним максимум экстинции должны совпадать с длиной волны зондирующего излучения оптической когерентной томографии (ОКТ), исследование накопления наночастиц в опухоли методом ОКТ по интенсивности ОКТ-сигнала и последующее воздействие на опухоль лазерной гипертермией, отличающийся тем, что исследование опухоли начинают через 30 мин после введения раствора наночастиц, измеряют интенсивность ОКТ-сигнала каждые 30 мин, и при получении ОКТ-сигнала максимальной интенсивности воздействуют на опухоль лазерной гипертермией.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве наночастиц используют наночастицы из золота, которые могут быть выполнены, в частности, в форме наностержня, нанооболочки и др.