МОЛЕКУЛЫ АНТИТЕЛ С УЛУЧШЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2011 года по МПК C07K16/28 C12N15/09 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 

Область, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим антитело против рецептора IL-6, используемое в качестве активного ингредиента, а также к способам получения указанных композиций и т.п.

Предшествующий уровень техники

Антитела представляют особый интерес как фармацевтические средства, поскольку они обладают высокой стабильностью в плазме и не вызывают значительных побочных эффектов. К таким антителам относится ряд коммерчески доступных фармацевтически приемлемых антител типа IgG и многие фармацевтически приемлемые антитела, которые в настоящее время находятся на стадии испытаний (непатентные документы 1 и 2). IL-6 представляет собой цитокин, вызывающий различные аутоиммунные заболевания, воспалительные заболевания, злокачественные опухоли и т.п. (непатентный документ 3). Тоцилизумаб (TOCILIZUMAB), то есть гуманизированное антитело IgG1 против рецептора IL-6, специфически связывается с рецептором IL-6. Считается, что тоцилизумаб может быть использован в качестве терапевтического средства для лечения IL-6-ассоциированных заболеваний, таких как ревматоидный артрит, поскольку это антитело нейтрализует биологическую активность IL-6 (патентные документы 1-3 и непатентный документ 4). В Японии тоцилизумаб был разрешен к применению в качестве терапевтического средства для лечения болезни Каслмана и ревматоидного артрита (непатентный документ 5).

Гуманизированные антитела, такие как тоцилизумаб, представляют собой фармацевтически приемлемые антитела первого поколения. Фармацевтически приемлемые антитела второго поколения в настоящее время находятся на стадии исследований, проводимых в целях улучшения эффективности и удобства применения, а также снижения стоимости фармацевтически приемлемых антител первого поколения. В настоящее время разрабатываются различные технологии, которые могут быть применены для получения фармацевтически приемлемых антител второго поколения. Имеются описания методов усиления эффекторной функции, повышения способности связываться с антигеном, улучшения фармакокинетических свойств и повышения стабильности этих антител, а также методов снижения риска развития иммуногенности. Как сообщалось, такими методами повышения эффективности лекарственного средства или снижения дозы являются методы повышения антитело-зависимой клеточно-опосредуемой цитотоксической активности (ADCC-активности) или комплемент-зависимой цитотоксической активности (CDC-активности), проводимые посредством аминокислотной замены в Fc-области антитела IgG (непатентный документ 6). Сообщалось также, что методом повышения антигенсвязывающей способности или антиген-нейтрализующей способности является аффинное созревание (непатентный документ 7). Такая технология позволяет усиливать антигенсвязывающую активность путем введения аминокислотных мутаций в гипервариабельную область (комплементарность-определяющую область (CDR)) вариабельной области или т.п. Повышение антигенсвязывающей способности приводит к усилению биологической активности in vitro или позволяет снижать вводимую дозу, а также приводит к повышению эффективности in vivo (непатентный документ 8). В настоящее время проводятся клинические испытания для характеризации антитела мотавизумаба (Motavizumab) (полученного посредством созревания аффинности), которое, как предполагается, обладает гораздо большей эффективностью, чем паливизумаб (Palivizumab), то есть фармацевтически приемлемое анти-RSV антитело первого поколения (непатентный документ 9). В литературе также описано антитело против рецептора IL-6 с аффинностью приблизительно 0,05 нМ (то есть с аффинностью, превышающей аффинность тоцилизумаба) (патентный документ 4). Однако в литературе отсутствуют какие-либо данные о человеческих, гуманизированных или химерных антителах, аффинность которых превышает 0,05 нМ.

Проблемой, с которой в настоящее время сталкиваются специалисты при получении фармацевтически приемлемых антител, являются высокая стоимость их производства, связанная с введением очень больших количеств белка. Так, например, доза тоцилизумаба, а именно гуманизированного антитела IgG1 против рецептора IL-6, для внутривенной инъекции составляет приблизительно 8 мг/кг/месяц (непатентный документ 4). Для лечения хронических аутоиммунных заболеваний предпочтительной формой введения препарата является подкожное введение. В общих чертах, необходимо, чтобы препараты для подкожного введения имели высокую концентрацию. С точки зрения стабильности или т.п. предельная доза для антитела типа IgG обычно составляет примерно 100 мкг/мл (непатентный документ 10). Недорогостоящие и удобные для применения фармацевтические препараты на основе антител второго поколения, которые могут быть введены подкожно в течение более длительных промежутков времени, могут быть получены путем увеличения времени полужизни антитела в плазме в целях пролонгирования его терапевтического эффекта и тем самым снижения количества вводимого белка, а также путем сообщения данному антителу высокой стабильности.

FcRn тесно связан с фармакокинетикой антител. Что касается различий во времени полужизни антител изотипов IgG1 и IgG2 в плазме, то известно, что IgG1 и IgG2 имеют значительно более продолжительное время полужизни в плазме, чем IgG3 и IgG4 (непатентный документ 11). Как сообщалось, методом еще большего увеличения времени полужизни антител IgG3 и IgG4 в плазме, которые уже имеют достаточно продолжительное время полужизни в плазме, является замена аминокислот в константной области, приводящая к повышению уровня связывания с FcRn (непатентные документы 12 и 13). С точки зрения иммуногенности дальнейшее увеличение времени полужизни в плазме было достигнуто путем замены аминокислот предпочтительно в вариабельной, но не в константной области (патентный документ 5). Однако в настоящее время отсутствуют какие-либо данные об увеличении времени полужизни антител против рецептора IL-6 в плазме, достигаемом посредством модификации вариабельной области.

Другой важной проблемой, с которой сталкиваются специалисты в области разработки биофармацевтических препаратов, является иммуногенность. В общих чертах, иммуногенность мышиных антител может быть снижена путем «гуманизации» антител. При этом предполагается, что при гуманизации антитела риск развития иммуногенности может быть дополнительно снижен путем использования каркасной последовательности зародышевой линии в качестве матрицы (непатентный документ 14). Однако даже адалимумаб (Adalimumab), то есть полностью человеческое анти-TNF антитело, обнаруживало высокий уровень (13%-17%) развития иммуногенности, и было установлено, что у пациентов, у которых наблюдалась иммуногенность, терапевтический эффект был низким (непатентные документы 15 и 16). Т-клеточные эпитопы могут присутствовать даже в CDR человеческих антител, и такие Т-клеточные эпитопы в CDR могут вызывать иммуногенность. Методы in silico и in vitro для предсказания Т-клеточных эпитопов описаны в литературе (непатентные документы 17 и 18). Предполагается, что риск развития иммуногенности может быть снижен путем удаления Т-клеточных эпитопов, предсказанных такими методами (непатентный документ 19).

Тоцилизумаб, то есть гуманизированное антитело против рецептора IL-6, представляет собой антитело IgG1, полученное путем гуманизации мышиного антитела PM1. Присоединение CDR осуществляют с использованием человеческих последовательностей NEW и REI в качестве каркасной матрицы для цепей H и L, соответственно; однако пять аминокислот мышиной последовательности в каркасной области были сохранены в качестве незаменимых аминокислот для поддержания активности (непатентный документ 20). В настоящее время отсутствуют какие-либо данные о полной гуманизации остальной мышиной последовательности в каркасной области гуманизированного антитела тоцилизумаба без снижения его активности. Кроме того, последовательностью CDR тоцилизумаба является мышиная последовательность, и такая последовательность, подобно адалимумабу, может иметь Т-клеточные эпитопы в CDR, которые могут вызывать риск развития иммуногенности. В клинических испытаниях тоцилизумаба антитела против тоцилизумаба не детектировались при эффективной дозе 8 мг/кг, но они наблюдались при дозах 2 мг/кг и 4 мг/кг (патентный документ 6). Это позволяет предположить, что иммуногенность тоцилизумаба может быть еще больше снижена. Однако в литературе отсутствуют какие-либо данные о снижении риска развития иммуногенности тоцилизумаба при аминокислотной замене.

Изотипом тоцилизумаба являются IgG1. Различия в изотипах определяются различиями в последовательностях константной области. Поскольку предполагается, что последовательность константной области оказывает значительное влияние на эффекторную функцию, фармакокинетику, физические свойства антител и т.п., то выбор последовательности константной области имеет очень важное значение для разработки фармацевтических препаратов на основе антител (непатентный документ 11). В последние годы безопасность фармацевтических препаратов на основе антител приобретает первостепенное значение. Взаимодействие Fc-части антитела и Fcγ-рецептора (эффекторная функция) может вызывать серьезные побочные эффекты в клинических испытаниях TGN1412 фазы I (непатентный документ 21). Для получения фармацевтических препаратов на основе антител в целях нейтрализации биологической активности антигена, связывание с Fcγ-рецептором, которое играет важную роль в эффекторных функциях, таких ADCC, не является необходимым. Связывание с Fcγ-рецептором может даже оказаться нежелательным с точки зрения побочных эффектов. Способ снижения уровня связывания с Fcγ-рецептором применяется для изменения изотипа антитела IgG с IgG1 на IgG2 или IgG4 (непатентный документ 22). IgG2 является более предпочтительным, чем IgG4, с точки зрения фармакокинетики и связывания с Fcγ-рецептором I (непатентный документ 11). Тоцилизумаб представляет собой антитело, нейтрализующее рецептор IL-6, а его изотипом является IgG1. Таким образом, с точки зрения минимизации возможных побочных эффектов, IgG2 может оказаться предпочтительным изотипом, поскольку для его действия не требуется эффекторных функций, таких как ADCC.

Тем не менее, при разработке фармацевтических препаратов на основе антител, очень важное значение имеют физико-химические свойства белков, а в частности, их гомогенность и стабильность. Сообщалось, что изотип IgG2 обладает значительной гетерогенностью, что обусловлено наличием дисульфидных связей в его шарнирной области (непатентный документ 23). Трудоемкость и высокая стоимость крупномасштабного промышленного производства фармацевтических препаратов на основе таких антител с сохранением нужных веществ/родственных веществ связано с их гетерогенностью, обусловленной различием дисульфидных связей в различных продуктах. Таким образом, если это возможно, желательно использовать одно вещество. Кроме того, сообщалось, что гетерогенность С-концевых последовательностей H-цепи антитела обусловлена делецией С-концевого лизинового аминокислотного остатка и амидированием С-концевой карбоксильной группы в результате делеции двух С-концевых аминокислот, глицина и лизина (непатентный документ 24). При разработке антител изотипа IgG2 в качестве фармацевтических препаратов, предпочтительно снижать такую гетерогенность и сохранять высокую стабильность. Для получения удобных в употреблении стабильных препаратов, имеющих высокую концентрацию и предназначенных для подкожного введения, предпочтительно, чтобы такие препараты обладали не только высокой стабильностью, но также и имели время полужизни в плазме, превышающее время полужизни IgG1, который является изотипом тоцилизумаба. Однако в настоящее время отсутствуют какие-либо данные о последовательностях константной области антител, имеющих константную область изотипа IgG2, имеющую пониженную гетерогенность, высокую стабильность и время полужизни в плазме, превышающее время полужизни антител с константной областью изотипа IgG1.

Предшествующие документы, относящиеся в настоящему изобретению, указаны ниже:

[Предшествующие документы]

[Патентные документы]

[Патентный документ 1] WO 92/19759

[Патентный документ 2] WO 96/11020

[Патентный документ 3] WO 96/12503

[Патентный документ 4] WO 2007/143168

[Патентный документ 5] WO 2007/114319

[Патентный документ 6] WO 2004/096273

[Непатентные документы]

[Непатентный документ 1] Janice M. Reichert, Clark J. Rosensweig, Laura B. Faden & Matthew C. Dewitz, Monoclonal antibody successes in the clinic, Nature Biotechnology 23, 1073-1078 (2005).

[Непатентный документ 2] Pavlou A.K., Belsey M.J., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr; 59(3):389-96.

[Непатентный документ 3] Nishimoto N., Kishimoto T., Interleukin 6: from bench to bedside., Nat Clin Pract Rheumatol. 2006 Nov; 2(11):619-26.

[Непатентный документ 4] Maini R.N., Taylor P.C., Szechinski J., Pavelka K., Broll J., Balint G., Emery P., Raemen F., Petersen J., Smolen J., Thomson D., Kishimoto T.; CHARISMA Study Group., Double-blind randomized controlled clinical trial of the interleukin-6 receptor antagonist, Tocilizumab, in European patients with rheumatoid arthritis who had an incomplete response to methotrexate., Arthritis Rheum. 2006 Sep; 54(9):2817-29.

[Непатентный документ 5] Nishimoto N., Kanakura Y., Aozasa K., Johkoh T., Nakamura M., Nakano S., Nakano N., Ikeda Y., Sasaki T., Nishioka K., Hara M., Taguchi H., Kimura Y., Kato Y., Asaoku H., Kumagai S., Kodama F., Nakahara H., Hagihara K., Yoshizaki K., Kishimoto T. Humanized anti-interleukin-6 receptor antibody treatment of multicentric Castleman disease. Blood. 2005 Oct 15; 106(8):2627-32.

[Непатентный документ 6] Kim S.J., Park Y., Hong H.J., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol Cells. 2005 Aug 31; 20(1):17-29. Review.

[Непатентный документ 7] Rothe A., Hosse R.J., Power B.E. Ribosome display for improved biotherapeutic molecules. Expert Opin Biol Ther. 2006 Feb; 6(2):177-87.

[Непатентный документ 8] Rajpal A., Beyaz N., Haber L., Cappuccilli G., Yee H., Bhatt R.R., Takeuchi T., Lerner R.A., Crea R., A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries., Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Jun 14; 102(24):8466-71. Epub 2005 Jun 6.

[Непатентный документ 9] Wu H., Pfarr D.S., Johnson S., Brewah Y.A., Woods R.M., Patel N.K., White W.I., Young J.F., Kiener P.A. Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody for the Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-665.

[Непатентный документ 10] Shire S.J., Shahrokh Z., Liu J. Challenges in the development of high protein concentration formulations. J Pharm Sci. 2004 Jun; 93(6):1390-402.

[Непатентный документ 11] Salfeld J.G. Isotype selection in antibody engineering.Nat Biotechnol. 2007 Dec; 25(12):1369-72.

[Непатентный документ 12] Hinton P.R., Xiong J.M., Johlfs М.G., Tang M.T., Keller S., Tsurushita N., An engineered human IgG1 antibody with longer serum half-life., J Immunol. 2006 Jan 1; 176(1):346-56.

[Непатентный документ 13] Ghetie V., Popov S., Borvak J., Radu C., Matesoi D., Medesan C., Ober R.J., Ward E.S., Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis., Nat Biotechnol. 1997 Jul; 15(7):637-40.

[Непатентный документ 14] Hwang W.Y., Almagro J.C., Buss T.N., Tan P., Foote J. Use of human germline genes in a CDR homology-based approach to antibody humanization. Methods. 2005 May; 36(1):35-42.

[Непатентный документ 15] Bartelds G.M., Wijbrandts C.A., Nurmohamed M.T., Stapel S., Lems W.F., Aarden L., Dijkmans B.A., Tak P., Wolbink G.J. Clinical response to adalimumab: The relationship with anti-adalimumab antibodies and serum adalimumab concentrations in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 2007 Mar 9; [Epub ahead of print].

[Непатентный документ 16] Bender N.K., Heilig C.E., Droll B., Wohlgemuth J., Armbruster F.P., Heilig B. Immunogenicity, efficacy and adverse events of adalimumab in RA patients. Rheumatol Int. 2007 Jan; 27(3):269-74.

[Непатентный документ 17] Van Walle I., Gansemans Y., Parren P.W., Stas P., Lasters I. Immunogenicity screening in protein drug development. Expert Opin Biol Ther. 2007 Mar; 7(3):405-18.

[Непатентный документ 18] Jones T.D., Phillips W.J., Smith B.J., Bamford C.A., Nayee P.D., Baglin T.P., Gaston J.S., Baker M.P. Identification and removal of a promiscuous CD4+ T cell epitope from the C1 domain of factor VIII. J Thromb Haemost. 2005 May; 3(5):991-1000.

[Непатентный документ 19] Chirino A.J., Ary M.L., Marshall S.A. Minimizing the immunogenicity of protein therapeutics. Drug Discov Today. 2004 Jan 15; 9(2):82-90.

[Непатентный документ 20] Sato K., Tsuchiya M., Saldanha J., Koishihara Y., Ohsugi Y., Kishimoto T., Bendig M.M. Reshaping a human antibody to inhibit the interleukin 6-dependent tumor cell growth. Cancer Res. 1993 Feb 15; 53(4):851-6.

[Непатентный документ 21] Strand V., Kimberly R., Isaacs J.D. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan; 6(1):75-92.

[Непатентный документ 22] Gessner J.E., Heiken H., Tamm A., Schmidt R.E. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. 1998 Jun; 76(6):231-48.

[Непатентный документ 23] Dillon T.M., Ricci M.S., Vezina C., Flynn G.C., Liu Y.D., Rehder D.S., Plant M., Henkle B., Li Y., Deechongkit S., Varnum B., Wypych J., Balland A., Bondarenko P.V. Structural and functional characterization of disulfide isoforms of the human IgG2 subclass. J Biol Chem. 2008 Jun 6; 283(23):16206-15.

[Непатентный документ 24] Johnson K.A., Paisley-Flango K., Tangarone B.S., Porter T.J., Rouse J.C. Cation exchange-HPLC and mass spectrometry reveal C-terminal amidation of an IgG1 heavy chain. Anal Biochem. 2007 Jan 1; 360(1):75-83.

Описание изобретения

[Проблемы, которые могут быть решены с помощью настоящего изобретения]

Настоящее изобретение может быть осуществлено исходя из вышеуказанных фактов. Целью настоящего изобретения является получение фармацевтических композиций, содержащих молекулы второго поколения, обладающие улучшенными свойствами по сравнению с гуманизированным антителом IgG1 против рецептора IL-6, а именно тоцилизумабом, путем модификации аминокислотных последовательностей вариабельных и константных областей тоцилизумаба в целях повышения его антиген-нейтрализующей способности и улучшения фармакокинетических свойств, с последующим достижением пролонгированного терапевтического эффекта с меньшей частотой введения указанных композиций, и снижением иммуногенности, повышением безопасности и улучшением физико-химических свойств (повышением стабильности и гомогенности) (такие фармацевтические композиции далее могут также называться «средствами» или «препаратами»). Другой целью настоящего изобретения является разработка способов продуцирования указанных фармацевтических композиций.

[Способы решения указанных проблем]

Авторами настоящего изобретения были проведены специальные исследования в целях получения молекул второго поколения, обладающих лучшими свойствами по сравнению с гуманизированным антителом IgG1 против рецептора IL-6, а именно, р тоцилизумабом первого поколения, путем модификации аминокислотных последовательностей вариабельной и константной областей тоцилизумаба для повышения его эффективности и улучшения фармакокинетических свойств в целях достижения пролонгированного терапевтического действия при меньшей частоте его введения, а также снижения иммуногенности, повышения его безопасности и улучшения его физико-химических свойств (повышения стабильности и гомогенности). В результате авторами настоящего изобретения было введено множество мутаций CDR в вариабельные области тоцилизумаба, улучшающих его способность связываться (аффинность) с антигеном. Таким образом, авторам настоящего изобретения удалось значительно повысить аффинность этого антитела с использованием комбинации таких мутаций. Авторам настоящего изобретения также удалось улучшить фармакокинетические свойства путем введения модификаций, снижающих величину изоэлектрической точки последовательности вариабельной области. Авторам настоящего изобретения также удалось улучшить фармакокинетические свойства путем обеспечения рН-зависимого связывания с антигеном рецептора IL-6, в результате чего одна молекула антитела может многократно нейтрализовать антиген. Кроме того, авторам настоящего изобретения удалось снизить риск развития иммуногенности путем полной гуманизации мышиных последовательностей, присутствующих в каркасной области тоцилизумаба, и снижения числа пептидов Т-клеточного эпитопа в вариабельных областях, предсказанных in silico. Кроме того, авторам настоящего изобретения также удалось выявить новые последовательности константной области для константной области тоцилизумаба, которые снижают уровень связывания с Fcγ-рецептором, повышают безопасность, улучшают фармакокинетические свойства по сравнению с последовательностями IgG1 и снижают гетерогенность, ассоциированную с дисульфидными связями в шарнирной области IgG2, а также снижают гетерогенность, ассоциированную с С-концом Н-цепи без снижения стабильности. Авторам настоящего изобретения удалось получить молекулы второго поколения, обладающие улучшенными свойствами по сравнению с тоцилизумабом, путем соответствующего объединения указанных модификаций аминокислотной последовательности в CDR, вариабельных областях и в константных областях.

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат гуманизированное антитело IgG против рецептора IL-6, обладающее повышенной способностью связываться с антигеном (рецептором IL-6), улучшенными фармакокинетическими свойствами, повышенной безопасностью и улучшенными физическими свойствами (повышенной стабильностью и гомогенностью), а также имеют пониженный риск развития иммуногенности, где указанные фармацевтические композиции получают путем модификации аминокислотных последовательностей вариабельных и константных областей гуманизированного антитела IgG1 против рецептора IL-6, а именно тоцилизумаба; а также к способам получения указанных фармацевтических композиций. Более конкретно, настоящее изобретение относится:

[1] к любому полипептиду, выбранному из:

(a) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73);

(b) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73);

(c) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83);

(d) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(e) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3); и

(f) полипептида, включающего CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5);

[2] к любому антителу, выбранному из:

(a) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(b) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3); и

(c) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5);

[3] к любой вариабельной области, выбранной из:

(a) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 19 (вариабельной области VH4-M73);

(b) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 20 (вариабельной области VH3-M73);

(c) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 21 (вариабельной области VH5-M83);

(d) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 22 (вариабельной области VL1);

(e) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 23 (вариабельной области VL3); и

(f) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 24 (вариабельной области VL5);

[4] к любому антителу, выбранному из:

(a) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 19 (вариабельную область VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 22 (вариабельную область VL1);

(b) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 20 (вариабельную область VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 23 (вариабельную область VL3); и

(c) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 21 (вариабельную область VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 24 (вариабельную область VL5);

[5] к любой тяжелой цепи или легкой цепи, выбранной из:

(a) тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 25 (VH4-M73);

(b) тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 26 (VH3-M73);

(c) тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 27 (VH5-M83);

(d) легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 28 (VL1);

(e) легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 29 (VL3); и

(f) легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 30 (VL5);

[6] к любому антителу, выбранному из:

(a) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 25 (VH4-M73), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 28 (VL1);

(b) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 26 (VH3-M73), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 29 (VL3); и

(c) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 27 (VH5-M83), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 30 (VL5);

[7] к гену, кодирующему полипептид по любому из пунктов [1]-[6];

[8] к вектору, несущему ген по пункту [7];

[9] к клетке-хозяину, несущей вектор по пункту [8];

[10] к способу продуцирования полипептида по любому из пунктов [1] - [6] путем культивирования клетки-хозяина по пункту [9]; и

[11] к фармацевтической композиции, содержащей полипептид по любому из пунктов [1]-[6] или полипептид, полученный способом по пункту [10].

[Осуществление настоящего изобретения]

Гуманизированные антитела IgG против рецептора IL-6, полученные способами согласно изобретению, обладают повышенной эффективностью и улучшенными фармакокинетическими свойствами, а поэтому они обладают пролонгированным терапевтическим действием при меньшей частоте введения.

Краткое описание графического материала

На фиг.1 представлен список сайтов мутаций, повышающих аффинность тоцилизумаба к рецептору IL-6. Последовательность HCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 81; последовательность HCDR2, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 82; последовательность HCDR2, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 83; последовательность HCDR3 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 84; последовательность HCDR3, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 85; последовательность HCDR3, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 86; последовательность LCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 87; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 88; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 89; последовательность LCDR3 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 90; последовательность LCDR3, полученная после введения мутации (верхняя строка), представлена в SEQ ID NO: 91; и последовательность LCDR3, полученная после введения мутации (нижняя строка), представлена в SEQ ID NO: 92.

На фиг.2 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба и RDC-23 в BaF/gp130.

На фиг.3 представлен список сайтов мутаций, которые могут снижать величину изоэлектрической точки вариабельной области без значительного снижения уровня связывания тоцилизумаба с рецепторм IL-6. Звездочки у сайтов мутаций означают сайт, который не оказывает влияния на величину изоэлектрической точки, но который был мутирован для превращения этой последовательности в человеческую последовательность. Последовательность HFR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 93; последовательность HFR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 94; последовательность HCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 95; последовательность HCDR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 96; последовательность HFR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 97; последовательность HFR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 98; последовательность HCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 81; последовательность HCDR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 99; последовательность HFR4 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 100; последовательность HFR4, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 101; последовательность LFR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 102; последовательность LFR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 103; последовательность LCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 87; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 104; последовательность LFR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 105; последовательность LFR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 106; последовательность LCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 107; последовательности LCDR2, полученные после введения мутации, представлены в SEQ ID NO: 108 и 109; последовательность LFR3 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 110; последовательность LFR3, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 111; последовательность LFR4 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 112, а последовательность LFR4, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 113.

На фиг. 4 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба и H53/L28 в BaF/gp130.

На фиг. 5 представлен график, иллюстрирующий концентрацию тоцилизумаба и H53/L28 в плазме мышей в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 6 представлен график, иллюстрирующий концентрацию тоцилизумаба и H53/L28 в плазме мышей в зависимости от времени после подкожного введения.

На фиг. 7 схематически показано, что молекула IgG может снова связываться с другим антигеном в результате диссоциации из антигена мембранного типа в эндосоме.

На фиг. 8 представлен список сайтов мутаций, которые могут сообщать тоцилизумабу способность к рН-зависимому связыванию с рецептором IL-6 (связывание при pH 7,4 и диссоциация при pH 5,8). Последовательность HFR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 93; последовательность HFR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 114; последовательность HCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 95; последовательность HCDR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 115; последовательность LCDR1 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 87; последовательность LCDR1, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 116; последовательность LCDR2 тоцилизумаба представлена в SEQ ID NO: 107, а последовательность LCDR2, полученная после введения мутации, представлена в SEQ ID NO: 117.

На фиг. 9 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба и H3pI/L73 в BaF/gp130.

На фиг. 10 представлен график, иллюстрирующий концентрацию тоцилизумаба и H3pI/L73 в плазме собакоподобных обезьян в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 11 представлен график, иллюстрирующий концентрацию тоцилизумаба и H3pI/L73 в плазме мышей, трансгенных по человеческому рецептору IL-6, в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 12 представлена диаграмма, иллюстрирующая результаты анализа C-концевой гетерогенности тоцилизумаба (TOCILIZUMAB), TOCILIZUMABΔK и TOCILIZUMABΔGK, проводимого с помощью катионообменной хроматографии.

На фиг. 13 представлена диаграмма, иллюстрирующая результаты анализа ассоциированной с дисульфидной связью гетерогенности тоцилизумаба-IgG1, тоцилизумаба-IgG2 и тоцилизумаба-SKSC, проводимого с помощью катионообменной хроматографии.

На фиг. 14 представлена диаграмма, иллюстрирующая кривые денатурации для тоцилизумаба-IgG1, тоцилизумаба-IgG2 и тоцилизумаба-SKSC, полученные с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), и величину Tm для каждого Fab-домена.

На фиг. 15 представлен график, иллюстрирующий концентрации тоцилизумаба-IgG1, тоцилизумаба-M44, тоцилизумаба-M58 и тоцилизумаба-M73 в плазме у мышей, трансгенных по человеческому FcRn, в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 16 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба, контроля и Fv5-M83 в BaF/gp130.

На фиг. 17 представлен график, иллюстрирующий нейтрализующую активность тоцилизумаба, Fv3-M73 и Fv4-M73 в BaF/gp130.

На фиг. 18 представлен график, иллюстрирующий концентрации тоцилизумаба, контроля, Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 у собакоподобных обезьян в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 19 представлен график, иллюстрирующий концентрацию CRP для тоцилизумаба, контроля, Fv3-M73, Fv4-M73 или Fv5-M83 у собакоподобных обезьян в зависимости от времени после внутривенного введения.

На фиг. 20 представлен график, иллюстрирующий процент свободного растворимого рецептора IL-6 у собакоподобных обезьян в зависимости от времени после внутривенного введения тоцилизумаба, контроля, Fv3-M73, Fv4-M73 или Fv5-M83.

На фиг. 21 представлен график, иллюстрирующий ингибирующее действие тоцилизумаба и Fv4-M73 на продуцирование МСР-1 из синовиальных клеток человека, страдающего ревматоидным артритом (РА).

На фиг. 22 представлен график, иллюстрирующий ингибирующее действие тоцилизумаба и Fv4-M73 на продуцирование VEGF из синовиальных клеток человека, страдающего ревматоидным артритом (РА).

Способ осуществления настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к нижеуказанным полипептидам (a)-(f):

(a) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73);

(b) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73);

(c) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83);

(d) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(e) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3); и

(f) полипептиду, включающему CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5).

Полипептиды согласно изобретению не имеют конкретных ограничений, однако, предпочтительно, они представляют собой антигенсвязывающие молекулы, обладающие активностью, направленной на связывание с рецептором IL-6. Такими антигенсвязывающими молекулами являются, например, вариабельные области тяжелой цепи антитела (VH), вариабельные области легкой цепи антитела (VL), тяжелые цепи антитела, легкие цепи антитела и антитела.

Из указанных выше полипептидов (a)-(f) предпочтительными примерами вариабельных областей тяжелой цепи антитела являются полипептиды (a)-(c), а предпочтительными примерами вариабельных областей легкой цепи антитела являются полипептиды (d)-(f).

Такие вариабельные области могут быть использованы как часть антитела против человеческого рецептора IL-6. Антитела против человеческого рецептора IL-6, в которых используется такая вариабельная область, обладают повышенной связывающей активностью, превосходными фармакокинетическими свойствами, высокой степенью безопасности, пониженной иммуногенностью и/или улучшенными физико-химическими свойствами. В настоящем изобретении «превосходные фармакокинетические свойства» или «улучшенные фармакокинетические свойства» означают любое из таких свойств, как: снижение уровня «клиренса (CL)», увеличение «площади под кривой (AUC)», увеличение «среднего времени пребывания» и увеличение «времени полужизни в плазме (t_1/2)», где указанные свойства представляют собой фармакокинетические параметры, определяемые исходя из зависимости концентрации в плазме от времени при введении антитела в организм. В настоящем изобретении «превосходные физико-химические свойства» или «улучшенные физико-химические свойства» означают, но не ограничиваются ими, повышенную стабильность, пониженную гетерогенность или т.п.

Каркасные области человеческого антитела (FR), связывающиеся с CDR, выбирают так, чтобы CDR образовывала желательный антигенсвязывающий сайт. FR, используемые для вариабельных областей согласно изобретению, не имеют конкретных ограничений, и может быть использована любая FR; однако предпочтительными являются человеческие FR. Могут быть использованы человеческие FR, имеющие природную последовательность. Альтернативно, при необходимости, в каркасную область, имеющую природную последовательность, могут быть введены замены, делеции, добавления и/или инсерции или т.п. одной или нескольких аминокислот, так чтобы CDR могла образовывать адекватный антигенсвязывающий сайт. Мутантные последовательности FR, обладающие нужными свойствами, могут быть отобраны, например, путем измерения и оценки активности связывания антигена с антителом, имеющим FR с аминокислотными заменами (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Кроме того, в последовательности CDR, описанной выше, могут быть заменены, делетированы, добавлены и/или встроены одна или несколько аминокислот. При этом, предпочтительно, чтобы последовательность CDR, после замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или нескольких аминокислот, обладала активностью, эквивалентной активности немодифицированной последовательности CDR, то есть связывающей активностью и нейтрализующей активностью, а также обладала соответствующей стабильностью и иммуногенностью и/или соответствующими фармакокинетическими свойствами. Число аминокислот, которые должны быть заменены, делетированы, добавлены и/или встроены, не имеет конкретных ограничений; однако число таких аминокислот предпочтительно составляет три или менее, более предпочтительно две или менее, а еще более предпочтительно одна аминокислота на CDR.

Методами замены одного или нескольких аминокислотных остатков другими представляющими интерес аминокислотами являются, например, сайт-направленный мутагенез (Hashimoto-Gotoh, T., Mizuno, T., Ogasahara, Y., and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275; Zoller, M.J., and Smith, M. (1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W., Drutsa, V., Jansen, H.W., Kramer, B., Pflugfelder, M., and Fritz, H.J. (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456; Kramer W., and Fritz H.J. (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; Kunkel, T.A. (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 82, 488-492). Этот метод может быть применен для замены нужных аминокислот в антителе другими представляющими интерес аминокислотами. Кроме того, аминокислоты в каркасных областях и CDR могут быть заменены другими соответствующими аминокислотами методами с использованием библиотек, такими как перестановка цепей в каркасной области (Mol. Immunol. 2007 Apr; 44(11):3049-60) и репарация CDR (US 2006/0122377).

Настоящее изобретение также относится к нижеуказанным антителам (a)-(c):

(а) антителу, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 3 (CDR3 VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 12 (CDR3 VL1);

(b) антителу, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 6 (CDR3 VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 13 (CDR1 VL3), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 15 (CDR3 VL3); и

(c) антителу, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO: 9 (CDR3 VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO: 16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 17 (CDR2 VL5), и CDR3 содержащую последовательность SEQ ID NO: 18 (CDR3 VL5).

Антитела, описанные выше, могут быть использованы в качестве антител против человеческого рецептора IL-6, обладающих повышенной связывающей активностью, превосходными фармакокинетическими свойствами, высокой степенью безопасности, пониженной иммуногенностью и/или улучшенными физико-химическими свойствами.

Каркасные области человеческого антитела, связывающиеся с CDR согласно изобретению, выбирают так, чтобы CDR образовывала желательный антигенсвязывающий сайт. FR, используемые для вариабельных областей согласно изобретению, не имеют конкретных ограничений, и может быть использована любая FR, однако предпочтительными являются человеческие FR. При этом могут быть использованы человеческие FR, имеющие природную последовательность. Альтернативно, при необходимости, в каркасную область, имеющую природную последовательность, могут быть введены замены, делеции, добавления и/или инсерции или т.п. одной или нескольких аминокислот, так чтобы CDR могли образовывать адекватный антигенсвязывающий сайт. Мутантные последовательности FR, обладающие нужными свойствами, могут быть отобраны, например, путем измерения и оценки активности связывания антигена с антителом, имеющим FR с аминокислотными заменами (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

При этом константные области, используемые для антитела согласно изобретению, не имеют конкретных ограничений, и может быть использована любая константная область. Предпочтительными константными областями, используемыми для антител согласно изобретению, являются, например, человеческие константные области (константные области, происходящие от IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, Cκ, Cλ и т.п.). В человеческих константных областях могут быть заменены, делетированы, добавлены и/или встроены одна или несколько аминокислот. Предпочтительными человеческими константными областями тяжелой цепи являются, например, константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 (константная область VH4-M73), константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32 (константная область VH3-M73), константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 (константная область VH5-M83), а предпочтительными человеческими константными областями легкой цепи являются, например, константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 (VL1), константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 (VL3), и константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 (VL5).

Кроме того, в последовательности CDR, описанной выше, могут быть заменены, делетированы, добавлены и/или встроены одна или несколько аминокислот. При этом, предпочтительно, чтобы последовательность CDR, после замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или нескольких аминокислот, обладала активностью, эквивалентной активности немодифицированной последовательности CDR, то есть связывающей активностью и нейтрализующей активностью, а также соответствующей стабильностью и иммуногенностью и/или соответствующими фармакокинетическими свойствами. Число аминокислот, которые должны быть заменены, делетированы, добавлены и/или встроены, не имеет конкретных ограничений; однако, предпочтительно, чтобы таких аминокислот было три или менее, более предпочтительно две или менее, а еще более предпочтительно одна аминокислота на CDR.

Аминокислоты могут быть также заменены, делетированы, добавлены и/или встроены методами, описанными выше.

Настоящее изобретение также относится к нижеуказанным вариабельным областям (a)-(f):

(a) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 19 (вариабельной области VH4-M73);

(b) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 20 (вариабельной области VH3-M73);

(c) вариабельной области тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 21 (вариабельной области VH5-M83);

(d) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 22 (вариабельной области VL1);

(e) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 23 (вариабельной области VL3); и

(f) вариабельной области легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 24 (вариабельной области VL5).

Вариабельные области, описанные выше, могут быть использованы как часть антитела против человеческого рецептора IL-6. Антитела против человеческого рецептора IL-6, в которых используются такие вариабельные области, обладают повышенной связывающей активностью, превосходными фармакокинетическими свойствами, высокой степенью безопасности, пониженной иммуногенностью и/или улучшенными физико-химическими свойствами.

Вариабельные области, описанные выше, могут также содержать замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или более аминокислот (например, пять аминокислот или менее, а предпочтительно три аминокислоты или менее). Методами замены одного или нескольких аминокислотных остатков другими представляющими интерес аминокислотами являются, например, методы, описанные выше.

Настоящее изобретение также относится к полипептидам, содержащим вариабельные области, описанные выше.

Кроме того, настоящее изобретение относится к нижеуказанным антителам (a)-(c):

(a) антителу, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 19 (вариабельную область VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 22 (вариабельную область VL1);

(b) антителу, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 20 (вариабельную область VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 23 (вариабельную область VL3); и

(c) антителу, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 21 (вариабельную область VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO: 24 (вариабельную область VL5).

Вариабельные области, описанные выше, могут быть использованы как часть антитела против человеческого рецептора IL-6. Антитела против человеческого рецептора IL-6, в которых используются такие вариабельные области, обладают повышенной связывающей активностью, превосходными фармакокинетическими свойствами, высокой степенью безопасности, пониженной иммуногенностью и/или улучшенными физико-химическими свойствами.

Вариабельные области, описанные выше, могут также содержать замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или более аминокислот (например, пять аминокислот или менее, а предпочтительно три аминокислоты или менее). Методами замены одного или нескольких аминокислотных остатков другими представляющими интерес аминокислотами являются, например, методы, описанные выше.

При этом константные области, используемые для антитела согласно изобретению, не имеют конкретных ограничений, и может быть использована любая константная область. Предпочтительными константными областями, используемыми для антител согласно изобретению, являются, например, человеческие константные области (константные области, происходящие от IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, цепи κ, цепи λ и т.п.). В человеческих константных областях могут быть заменены, делетированы, добавлены и/или встроены одна или несколько аминокислот. Предпочтительными человеческими константными областями тяжелой цепи являются, например, константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31 (константная область VH4-M73), константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 32 (константная область VH3-M73), константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33 (константная область VH5-M83), а предпочтительными человеческими константными областями легкой цепи являются, например, константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 (VL1), константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 (VL3), и константные области, содержащие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 (VL5).

Настоящее изобретение также относится к указанным ниже тяжелой или легкой цепям (a)-(f):

(a) тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 25 (VH4-M73);

(b) тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 26 (VH3-M73);

(c) тяжелой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 27 (VH5-M83);

(d) легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 28 (VL1);

(e) легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 29 (VL3); и

(f) легкой цепи, содержащей последовательность SEQ ID NO: 30 (VL5).

Тяжелые и легкие цепи, описанные выше, могут быть использованы как часть антитела против человеческого рецептора IL-6. Антитела против человеческого рецептора IL-6, в которых используются такие тяжелые и легкие цепи, обладают повышенной связывающей активностью, превосходными фармакокинетическими свойствами, высокой степенью безопасности, пониженной иммуногенностью и/или улучшенными физико-химическими свойствами.

Тяжелые и легкие цепи, описанные выше, могут также содержать замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или более аминокислот (например, десять аминокислот или менее, предпочтительно пять аминокислот или менее, а более предпочтительно три аминокислоты или менее). Методами замены одного или нескольких аминокислотных остатков другими представляющими интерес аминокислотами являются, например, методы, описанные выше.

В вариабельных областях, в константных областях или в тех и других областях могут быть сделаны замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или нескольких аминокислот.

Настоящее изобретение также относится к указанным ниже антителам (a)-(c):

(a) антителу, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 25 (VH4-M73), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 28 (VL1);

(b) антителу, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 26 (VH3-M73), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 29 (VL3); и

(c) антителу, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 27 (VH5-M83), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO: 30 (VL5).

Описанными выше антителами являются антитела против человеческого рецептора IL-6, которые обладают повышенной связывающей активностью, превосходными фармакокинетическими свойствами, высокой степенью безопасности, пониженной иммуногенностью и/или улучшенными физико-химическими свойствами.

Описанные выше антитела могут также содержать замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или более аминокислот (например, 20 аминокислот или менее, предпочтительно десять аминокислот или менее, а более предпочтительно пять аминокислот или менее). Методами замены одного или нескольких аминокислотных остатков другими представляющими интерес аминокислотами являются, например, методы, описанные выше.

В вариабельных областях, в константных областях или в тех и других областях могут быть сделаны замены, делеции, добавления и/или инсерции одной или нескольких аминокислот.

Антителами согласно изобретению предпочтительно являются гуманизированные антитела.

Гуманизированные антитела также называются «реконструированными человеческими антителами». Такое гуманизированное антитело получают путем присоединения гипервариабельной области (CDR), происходящей от млекопитающего, не являющегося человеком, к CDR человеческого антитела. Стандартные методы генетической рекомбинации, применяемые для получения таких антител, также известны специалистам (см. Европейскую патентную заявку № EP 125023 и WO 96/02576).

В частности, например, последовательность ДНК, сконструированную так, чтобы представляющая интерес CDR была связана с представляющей интерес каркасной областью (FR), синтезируют с помощью ПЦР, проводимой с использованием нескольких олигонуклеотидов, которые имеют перекрывающиеся части с концами CDR и FR и используются в качестве праймеров (см. метод, описанный в WO 98/13388). Гуманизированное антитело получают путем лигирования полученной ДНК с ДНК, кодирующей константную область человеческого антитела или модифицированную константную область человеческого антитла; встраивания указанной ДНК в экспрессионный вектор; и введения этого вектора хозяину для продуцирования у него антитела (см. Европейскую патентную заявку № EP 239400 и публикацию Международной патентной заявки № WO 96/02576).

Каркасные области человеческого антитела, связывающиеся с CDR, выбирают так, чтобы CDR образовывала желательный антигенсвязывающий сайт. При необходимости в каркасную область вариабельной области антитела могут быть введены аминокислотные замены, делеции, добавления и/или инсерции.

В качестве константной области гуманизированного антитела может быть использована константная область человеческого антитела или модифицированная константная область человеческого антитела, в которой могут быть сделаны одна или несколько аминокислотных замен, делеций, добавлений и/или инсерций.

Так, например, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cµ, Cδ, Cα1, Cα2 и Cε могут быть использованы для H-цепи, а Cκ и Cλ могут быть использованы для L-цепи. Аминокислотная последовательность Cκ представлена в SEQ ID NO: 38, а нуклеотидная последовательность, кодирующая эту аминокислотную последовательность, представлена в SEQ ID NO: 37. Аминокислотная последовательность Cγ1 представлена в SEQ ID NO: 40, а нуклеотидная последовательность, кодирующая эту аминокислотную последовательность, представлена в SEQ ID NO: 39. Аминокислотная последовательность Cγ2 представлена в SEQ ID NO: 42, а нуклеотидная последовательность, кодирующая эту аминокислотную последовательность, представлена в SEQ ID NO: 41. Аминокислотная последовательность Cγ4 представлена в SEQ ID NO: 44, а нуклеотидная последовательность, кодирующая эту аминокислотную последовательность, представлена в SEQ ID NO: 43.

Кроме того, С-области человеческого антитела могут быть модифицированы в целях повышения стабильности антитела или стабильности антитела при его продуцировании. Для гуманизации антитела могут быть использованы человеческие антитела любых изотипов, таких как IgG, IgM, IgA, IgE или IgD, однако, в настоящем изобретении предпочтительно используется IgG. В качестве IgG могут быть использованы IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или т.п.

После получения антитела аминокислоты в вариабельной области (например, в CDR и FR) и в константной области гуманизированного антитела могут быть делетированы, добавлены, встроены и/или заменены. Антителами согласно изобретению также являются такие гуманизированные антитела, которые содержат аминокислотные замены и т.п.

Антителами согласно изобретению являются не только двухвалентные антитела, представляющие собой IgG, но также и одновалентные антитела и мультивалентные антитела, представляющие собой IgM, при условии, что они обладают активностью связывания с рецептором IL-6 и/или нейтрализующей активностью. Мультивалентными антителами согласно изобретению являются мультивалентные антитела, в которых все антигенсвязывающие сайты являются идентичными, и мультивалентные антитела, в которых все или некоторые антигенсвязывающие сайты отличаются друг от друга. Антителами согласно изобретению являются не только целые молекулы антител, но также и мини-антитела и их модифицированные продукты, при условии, что они связываются с белком рецептора IL-6.

Мини-антителами являются антитела, содержащие фрагмент антитела, в котором отсутствует часть целого антитела (например, целого IgG или т.п.), и такие антитела не имеют конкретных ограничений, при условии, что они обладают активностью связывания с рецептором IL-6 или нейтрализующей активностью, и содержат фрагмент антитела, в котором отсутствует часть целого антитела (например, целого IgG или т.п.). Мини-антитела согласно изобретению не имеют конкретных ограничений, при условии, что они содержат часть целого антитела. Однако мини-антитела предпочтительно содержат VH или VL, а особенно предпочтительно VH и VL. Другими предпочтительными мини-антителами согласно изобретению являются, например, мини-антитела, содержащие CDR антитела. Мини-антитела могут содержать все шесть CDR антитела или некоторые из этих CDR.

Мини-антитела согласно изобретению предпочтительно имеют меньшую молекулярную массу, чем целые антитела. Однако мини-антитела могут образовывать мультимеры, например, димеры, тримеры или тетрамеры, а поэтому их молекулярная масса иногда превышает молекулярную массу целых антител.

В частности, фрагментами антител являются, например, Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv. Кроме того, мини-антителами являются, например, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, scFv (одноцепочечный Fv), диантитела и sc(Fv)₂ (одноцепочечный (Fv)₂). В соответствии с настоящим изобретением мини-антителами также являются мультимеры (например, димеры, тримеры, тетрамеры и полимеры) этих антител.

Фрагменты антител могут быть получены, например, путем обработки антител ферментами с продуцированием фрагментов антител. Ферментами, которые, как известно, могут быть использованы для продуцирования фрагментов антител, являются, например, папаин, пепсин и плазмин. Альтернативно ген, кодирующий такой фрагмент антитела, может быть сконструирован, введен в экспрессионный вектор и экспрессирован в соответствующих клетках-хозяевах (см., например, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669; Bird, R.E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

Гидролизующие ферменты расщепляют фрагмент авнтитела в специфических сайтах, в результате чего образуются фрагменты антител со специфическими структурами, описанными ниже. Для делеции любой части антитела могут быть использованы методы генной инженерии, которые могут быть применены к таким ферментативно продуцированным фрагментам антител.

Фрагментами антител, полученными с использованием вышеуказанных гидролизующих ферментов, являются нижеследующие фрагменты:

Гидролиз папаином: F(ab)₂ или Fab

Гидролиз пепсином: F(ab')₂ или Fab'

Гидролиз плазмином: Facb

Мини-антителами согласно изобретению являются фрагменты антител, в которых отсутствует какая-либо область, при условии, что они обладают активностью связывания с рецептором IL-6 и/или нейтрализующей активностью.

Термин «диантитело» означает фрагмент двухвалентного антитела, сконструированный посредством сцепления генов (Holliger P. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; EP 404097; WO 93/11161, и т.п.). Диантителами являются димеры, состоящие из двух полипептидных цепей. В каждой из полипептидных цепей, образующих димер, VL и VH обычно связаны посредством линкера в одной и той же цепи. В общих чертах, линкер в диантителе является достаточно коротким, а поэтому VL и VH не могут связываться друг с другом. В частности, число аминокислотных остатков, составляющих линкер, равно, например, приблизительно пяти остаткам. Таким образом, кодируемые VL и VH, присутствующие на одном и том же полипептиде, не могут образовывать одноцепочечный фрагмент вариабельной области, а будут образовывать димер с другим одноцепочечным фрагментом вариабельной области. В результате такое диантитело имеет два антигенсвязывающих сайта.

Антителами scFv являются одноцепочечные полипептиды, полученные путем присоединения VH и VL посредством линкера или т.п. (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883; Pluckthun “The Pharmacology of Monoclonal Antibodies” Vol. 113, eds., Resenburg & Moore, Springer Verlag, New York, pp. 269-315, (1994)). V-область Н-цепи и V-область L-цепи scFv могут происходить от любого антитела, описанного в настоящей заявке. Пептидный линкер для связывания V-областей не имеет конкретных ограничений. Так, например, в качестве линкера может быть использован любой одноцепочечный пептид, содержащий примерно от 3 до 25 остатков. В частности, могут быть использованы пептидные линкеры, описанные ниже, или т.п.

V-области двух цепей могут быть присоединены, например, с помощью ПЦР, описанной выше. Сначала, для связывания V-областей с помощью ПЦР, в качестве матрицы используют ДНК, кодирующую полноразмерную аминокислотную последовательность или нужную неполную аминокислотную последовательность, кодируемую одной из ДНК, представленных ниже, а именно последовательностью ДНК, кодирующей Н-цепь или V-область Н-цепи антитела, и последовательностью ДНК, кодирующей L-цепь или V-область L-цепи антитела.

ДНК, кодирующие V-область Н-цепи или L-цепи, амплифицируют с помощью ПЦР с использованием пары праймеров, содержащих последовательности, соответствующие двум концам амплифицируемой ДНК. Затем получают ДНК, кодирующую часть пептидного линкера. ДНК, кодирующая пептидный линкер, может быть также синтезирована с помощью ПЦР. Нуклеотидную последовательность, которая может быть использована для присоединения отдельно синтезированных продуктов амплификации V-области, присоединяют к 5'-концу используемых праймеров. Затем проводят ПЦР с использованием каждой ДНК в цепи [ДНК V-области Н-цепи]-[ДНК пептидного линкера]-[ДНК V-области L-цепи] и осуществляют сборку ПЦР-праймеров.

Собранные ПЦР-праймеры содержат комбинацию праймера, который гибридизуется с 5'-концом молекулы [ДНК V-области Н-цепи], и праймера, который гибридизуется с 3'-концом молекулы [ДНК V-области L-цепи]. Другими словами, собранные ПЦР-праймеры представляют собой набор праймеров, которые могут быть использованы для амплификации ДНК, кодирующих полноразмерную последовательность, синтезированного scFv. Кроме того, нуклеотидные последовательности, которые могут быть использованы для присоединения к каждой ДНК V-области, присоединяют к молекуле [ДНК пептидного линкера]. Затем эти ДНК присоединяют друг к другу, после чего весь scFv, в конечном счете, продуцируется как продукт амплификации с использованием собранных ПЦР-праймеров. После продуцирования scFv-кодирующих ДНК могут быть получены экспрессионные векторы, содержащие эти ДНК, и могут быть продуцированы рекомбинантные клетки, трансформированные этими экспрессионными векторами, с применением стандартных методов. Затем scFv может быть получен посредством экспрессии scFv-кодирующих ДНК путем культивирования полученных рекомбинантных клеток.

Порядок присоединения VH и VL не имеет конкретных ограничений, а поэтому они могут располагаться в любом порядке. Примеры такого расположения представлены ниже:

[VH]-линкер-[VL]

[VL]-линкер-[VH].

sc(Fv)₂ представляет собой одноцепочечное мини-антитело, полученное путем присоединения двух VH и двух VL с использованием линкеров и т.п. (Hudson et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:177-189). sc(Fv)₂ может быть получен, например, путем присоединения scFv с помощью линкера.

Предпочтительно две VH и две VL антитела расположены в следующем порядке: VH, VL, VH и VL ([VH]-линкер-[VL]-линкер-[VH]-линкер-[VL]), начиная с N-конца одноцепочечного полипептида, однако, порядок расположения двух VH и двух VL не ограничивается вышеуказанным порядком расположения, и они могут располагаться в любом порядке. Примеры такого расположения представлены ниже:

[VL]-линкер-[VH]-линкер-[VH]-линкер-[VL]

[VH]-линкер-[VL]-линкер-[VL]-линкер-[VH]

[VH]-линкер-[VH]-линкер-[VL]-линкер-[VL]

[VL]-линкер-[VL]-линкер-[VH]-линкер-[VH]

[VL]-линкер-[VH]-линкер-[VL]-линкер-[VH]

Аминокислотная последовательность VH или VL мини-антитела может содержать замены, делеции, добавления и/или инсерции. Кроме того, если собранные VH и VL обладают антигенсвязывающей активностью, то часть их может быть делетирована, либо могут быть добавлены другие полипептиды. Кроме того, вариабельные области могут быть химерными или гуманизированными.

В настоящем изобретении линкерами, которые могут быть использованы для связывания вариабельных областей антитела, являются любые пептидные линкеры, которые могут быть введены методом генной инженерии, и синтетические линкеры, например, линкеры, описанные в публикации Protein Engineering (1996) 9(3), 299-305.

Предпочтительными линкерами согласно изобретению являются пептидные линкеры. Длина пептидных линкеров не имеет конкретных ограничений, и специалист в данной области может самостоятельно выбрать длину линкера в зависимости от цели его применения. Длина линкера обычно составляет от одной до 100 аминокислот, предпочтительно от 3 до 50 аминокислот, более предпочтительно от 5 до 30 аминокислот, а особенно предпочтительно от 12 до 18 аминокислот (например, 15 аминокислот).

Так, например, аминокислотными последовательностями для пептидных линкеров являются следующие последовательности:

Ser

Gly Ser

Gly Gly Ser

Ser Gly Gly

Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 45)

Ser Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 46)

Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 47)

Ser Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 48)

Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 49)

Ser Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 50)

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NO: 51)

Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly (SEQ ID NO: 52)

(Gly Gly Gly Gly Ser [SEQ ID NO: 47])_n

(Ser Gly Gly Gly Gly [SEQ ID NO: 48])_n,

где n равно целому числу от 1 или более.

Аминокислотные последовательности пептидных линкеров могут быть соответствующим образом выбраны самим специалистом в зависимости от поставленных целей. Так, например, вышеуказанное число «n», которое определяет длину пептидного линкера, обычно равно 1-5, предпочтительно 1-3, а более предпочтительно 1 или 2.

Синтетическими линкерами (химическими перекрестно связывающимися агентами) являются, например, перекрестно связывающиеся агенты, обычно используемые для перекрестного связывания пептидов, например, N-гидроксисукцинимид (NHS), дисукцинимидилсуберат (DSS), бис(сульфосукцинимидил)суберат (BS3), дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP), дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат) (DTSSP), бис(сукцинимидилсукцинат) этиленгликоля (EGS), бис(сульфосукцинимидилсукцинат) этиленгликоля (сульфо-EGS), дисукцинимидилтартрат (DST), дисульфосукцинимидилтартрат (сульфо-DST), бис[2-(сукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфон (BSOCOES) и бис[2-(сульфосукцинимидооксикарбонилокси)этил]сульфон (сульфо-BSOCOES). Такие перекрестно связывающиеся агенты являются коммерчески доступными.

В общих чертах, для связывания четырех вариабельных областей антитела необходимо три линкера. Многие из таких линкеров могут быть одинаковыми или различными.

Антителами согласно изобретению также являются антитела, в аминокислотную последовательность которых были добавлены один или несколько аминокислотных остатков. Кроме того, антителами согласно изобретению также являются гибридные белки, в которых вышеописанное антитело связано с другим пептидом или белком. Гибридный белок может быть получен путем лигирования полинуклеотида, кодирующего антитело согласно изобретению, и полинуклеотида, кодирующего другой пептид или полипептид с сохранением рамки считывания, введения такого гибрида в экспрессионный вектор и его экспрессии у хозяина. При этом могут быть применены методы, известные специалистам. Пептидом или полипептидом, образующим гибрид с антителом согласно изобретению, может быть известный пептид, например, FLAG (Hopp, T. P. et al., BioTechnology 6, 1204-1210 (1988)), 6×His, состоящий из шести остатков His (гистидинов), 10×His, гемагглютинин вируса гриппа (HA), фрагмент человеческого c-myc, фрагмент VSV-GP, фрагмент p18HIV, T7-метка, HSV-метка, E-метка, фрагмент Т-антигена SV40, lck-метка, фрагмент α-тубулина, B-метка и фрагмент белка C. Полипептидами, образующими гибрид с антителами согласно изобретению, являются, например, GST (глутатион-S-трансфераза), HA (гемагглютинин вируса гриппа), константная область иммуноглобулина, β-галактозидаза и MBP (белок, связывающийся с мальтозой). Коммерчески доступные полинуклеотиды, кодирующие такие пептиды или полипептиды, могут образовывать гибрид с полинуклеотидом, кодирующим антитело согласно изобретению. Гибридный полипептид может быть получен посредством экспрессии полученного таким образом гибридного полинуклеотида.

Кроме того, антитела согласно изобретению могут также представлять собой конъюгированные антитела, связанные с различными молекулами, такими как полимеры, включая полиэтиленгликоль (ПЭГ) и гиалуроновую кислоту; радиоактивные вещества; флуоресцентные вещества; люминесцентные вещества; ферменты и токсины. Такие конъюгированные антитела могут быть получены путем химической модификации продуцированных антител. Методы модификации антител хорошо известны специалистам (см., например, патенты США № 5057313 и 5156840). Термин «антитела» согласно изобретению также включает указанные конъюгированные антитела.

Кроме того, антителами согласно изобретению являются антитела с модифицированными сахарными цепями.

Кроме того, антителами, используемыми в настоящем изобретении, могут быть биспецифические антитела. Термин «биспецифическое антитело» означает антитело, имеющее вариабельные области, распознающие различные эпитопы в одной и той же молекуле антитела. Биспецифическим антителом согласно изобретению может быть биспецифическое антитело, распознающее различные эпитопы на молекуле рецептора IL-6, или биспецифическое антитело, в котором один из антигенсвязывающих сайтов распознает рецептор IL-6, а другой антигенсвязывающий сайт распознает другое вещество. Примерами антигенов, связывающихся с другим антигенсвязывающим сайтом биспецифического антитела, которое включает антитело согласно изобретению, распознающее рецептор IL-6, являются IL-6, TNF-α, TNFR1, TNFR2, CD80, CD86, CD28, CD20, CD19, IL-1α, IL-β, IL-1R, RANKL, RANK, IL-17, IL-17R, IL-23, IL-23R, IL-15, IL-15R, BlyS, лимфотоксин α, лимфотоксин β, лиганд LIGHT, LIGHT, VLA-4, CD25, IL-12, IL-12R, CD40, CD40L, BAFF, CD52, CD22, IL-32, IL-21, IL-21R, GM-CSF, GM-CSFR, M-CSF, M-CSFR, IFN-альфа, VEGF, VEGFR, EGF, EGFR, CCR5, APRIL и APRILR.

Методы продуцирования биспецифических антител известны специалистам. Биспецифические антитела могут быть получены, например, путем связывания антител двух типов, распознающих различные антигены. Такими связываемыми антителами может быть половина молекулы, каждая из которых содержит Н-цепь и L-цепь, или четверть молекулы, содержащая только одну Н-цепь. Альтернативно слитые клетки, продуцирующие биспецифические антитела, могут быть получены путем слияния гибридом, продуцирующих различные моноклональные антитела. Кроме того, биспецифические антитела могут быть получены методами генной инженерии.

Как описано ниже, антитела согласно изобретению могут отличаться по своим аминокислотным последовательностям, молекулярным массам, изоэлектрическим точкам, присутствию/отсутствию сахарных цепей и по своей конформации, в зависимости от метода очистки или типа клетки или хозяина, используемого для продуцирования антител. Однако настоящее изобретение включает любое полученное антитело, при условии, что оно является функционально эквивалентным антителу согласно изобретению. Так, например, если антитело согласно изобретению экспрессируется в прокариотических клетках, например, в Escherichia coli, то к N-концу аминокислотной последовательности исходного антитела присоединяют метиониновый остаток. Такие антитела также являются антителами согласно изобретению.

Полипептиды антител против рецептора IL-6 и т.п. согласно изобретению могут быть получены методами, известными специалистам.

Антитело против рецептора IL-6 может быть получено, например, известными методами генетической рекомбинации исходя из последовательности полученного антитела против рецептора IL-6. В частности, антитело против рецептора IL-6 может быть получено путем конструирования антитело-кодирующего полинуклеотида исходя из последовательности антитела, распознающего рецептор IL-6, встраивания этого полинуклеотида в экспрессионный вектор и его экспрессии в соответствующей клетке-хозяине (см., например, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. и Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. и Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R. E. & Walker, B. W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137).

Таким образом, настоящее изобретение относится к способам продуцирования (i) полипептида согласно изобретению или (ii) полипептида, кодируемого геном, кодирующим полипептид согласно изобретению, где указанные способы включают стадию культивирования клетки-хозяина, включающей вектор, в который встроен полинуклеотид, кодирующий полипептид согласно изобретению.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам получения полипептида согласно изобретению, где указанный способ включает стадии:

(a) культивирования клетки-хозяина, содержащей вектор, в который встроен ген, кодирующий полипептид согласно изобретению; и

(b) получения полипептида, кодируемого этим геном.

Примерами векторов являются векторы типа M13, векторы типа pUC, pBR322, pBluescript и pCR-Script. Альтернативно, если необходимо субклонировать и вырезать кДНК, то помимо вышеуказанных векторов могут быть использованы и другие векторы, включая, например, pGEM-T, pDIRECT и pT7. Экспрессионные векторы являются особенно подходящими для продуцирования антител согласно изобретению. Так, например, если экспрессионный вектор используется для экспрессии в E.coli, то такой вектор должен обладать отличительными признаками, позволяющими данному вектору амплифицироваться в E.coli. Кроме того, если хозяином является E.coli, такая как JM109, DH5α, HB101 или XL1-Blue, то важно, чтобы такой вектор содержал промотор, позволяющий данному вектору эффективно экспрессироваться в E.coli, например, промотор lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), промотор araB (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043), промотор T7 или т.п. Такими векторами, помимо вышеописанных векторов, являются pGEX-5X-1 (Pharmacia), «QIAexpress system» (Quiagen), pEGFP и pET (в данном случае, хозяином предпочтительно является BL21, экспрессирующий РНК-полимеразу T7).

Кроме того, плазмидные экспрессионные векторы могут содержать сигнальные последовательности для секреции антитела. Для продуцирования в периплазме E.coli, в качестве сигнальной последовательности для секреции антитела, может быть использована сигнальная последовательность pelB (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Векторы могут быть введены в клетки-хозяева, например, методами с использованием хлорида кальция или методами электропорации.

Помимо векторов для E. coli, векторами для продуцирования антител согласно изобретению являются, например, экспрессионные векторы млекопитающих (например, pcDNA3 (Invitrogen), pEF-BOS (Nucleic Acids. Res. (1990) 18(17), p5322), pEF и pCDM8), экспрессионные векторы клеток насекомых (например, бакуловирусная экспрессионная система «Bac-to-BAC» (Gibco-BRL) и pBacPAK8), экспрессионные векторы растений (например, pMH1 и pMH2), экспрессионные векторы вирусов животных (например, pHSV, pMV и pAdexLcw), экспрессионные векторы ретровирусов (например, pZIPneo), экспрессионные векторы дрожжей (например, «набор для экспрессии в Pichia» (Invitrogen), pNV11 и SP-Q01) и экспрессионные векторы Bacillus subtilis (например, pPL608 и pKTH50).

Если плазмидный экспрессионный вектор используется для экспрессии в клетках животных, таких как клетки CHO, COS и NIH3T3, то он должен иметь промотор, необходимый для экспрессии в этих клетках, например, промотор SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), промотор MMLV-LTR, промотор EF1α (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) или промотор CMV. Еще более предпочтительным вектором является вектор, имеющий ген для отбора трансформированных клеток (например, ген резистентности к лекарственному средству, который может быть идентифицирован с использованием соответствующего средства (неомицина, G418 или т.п.). Векторами, обладающими такими свойствами, являются, например, pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV и pOP13.

Кроме того, если необходимо стабильно экспрессировать гены и амплифицировать число копий генов в клетках, то может быть применен метод, в котором клетки CHO, дефицитные по каскаду реакций синтеза нуклеиновых кислот, вводят вместе с вектором, имеющим ген DHFR, который компенсирует такой дефицит (например, pSV2-dhfr (“Molecular Cloning 2nd edition” Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)), а затем этот вектор амплифицируют с использованием метотрексата (MTX). Кроме того, если необходима временная экспрессия гена, то может быть применен метод, в котором клетки COS, несущие на своей хромосоме ген, экспрессирующий Т-антиген SV40, трансформируют вектором, несущим ориджин репликации SV40 (pcD и т.п.). Могут быть использованы ориджины репликации, происходящие от полиомавируса, аденовируса, вируса бычьей папилломы (BPV) и т.п. Кроме того, для амплификации ряда копий генов в линиях клеток-хозяев, экспрессионные векторы могут содержать ген аминогликозид-трансферазы (APH), ген тимидинкиназы (TK), ген ксантингуанин-фосфорибозилтрансферазы E. coli (Ecogpt), ген дигидрофолат-редуктазы (dhfr) и т.п., используемые в качестве селективного маркера.

Полученные антитела согласно изобретению могут быть выделены из клеток-хозяев или их окружения (среды или т.п.) и очищены с получением по существу чистых и гомогенных антител. Антитела могут быть выделены и очищены стандартными методами разделения и очистки антител, которые не имеют каких-либо ограничений. Так, например, антитела могут быть выделены и очищены с помощью конкретно выбранных и комбинированных методов, таких как колоночная хроматография, фильтрация, ультрафильтрация, высаливание, осаждение растворителем, экстракция растворителем, дистилляция, иммунопреципитация, электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН, изоэлектрическое фокусирование, диализ, перекристаллизация и т.п.

Хроматографическими методами являются, например, аффинная хроматография, ионообменная хроматография, гидрофобная хроматография, гель-фильтрация, обращенно-фазовая хроматография и адсорбционная хроматография (Strategies for Protein Purification и Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Такие хроматографические методы могут быть осуществлены с помощью жидкостной хроматографии, например, ВЭЖХ и ЖЭХБ. Колонками, используемыми для аффинной хроматографии, являются колонки с белком А и колонки с G-белком. Примерами колонок с белком А являются колонки с Hyper D, POROS и сефарозой FF (GE Amersham Biosciences). Настоящее изобретение также включает антитела высокой степени очистки, полученные указанными методами очистки.

Активность связывания полученных антител с рецептором IL-6 может быть измерена методами, известными специалистам. Методами измерения антигенсвязывающей активности антител являются, например, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммуноанализ (РИА) и методы с использованием флуоресцентных антител. Так, например, при использовании иммуноферментного анализа, в планшеты, покрытые антигеном, добавляют антитело-содержащие образцы, такие как очищенные антитела и супернатанты культур антитело-продуцирующих клеток. Затем добавляют «второе» антитело, меченное ферментом, таким как щелочная фосфатаза, и планшеты инкубируют. После промывки добавляют субстрат фермента, такой как п-нитрофенилфосфат, и считывают оптическую плотность для оценки антигенсвязывающей активности.

Фармацевтические композиции

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим вышеописанный полипептид в качестве активного ингредиента. Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть использованы для лечения IL-6-ассоциированных заболеваний, таких как ревматоидный артрит. Таким образом, настоящее изобретение также относится к средствам для лечения заболеваний, таких как ревматоидный артрит, где указанные средства содержат вышеописанное антитело в качестве активного ингредиента. Предпочтительными примерами заболеваний, которые могут быть подвергнуты лечению в соответствии с настоящим изобретением, являются, но не ограничиваются ими, ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, системный ювенильный идиопатический артрит, болезнь Каслмана, системная красная волчанка (СКВ), волчаночный нефрит, болезнь Крона, лимфома, язвенный колит, анемия, васкулиты, болезнь Кавазаки, болезнь Стилла, амилоидоз, рассеянный склероз, заболевания, ассоциированные с трансплантацией, возрастная дегенерация желтого пятна, анкилозирующий спондилит, псориаз, псориатический артрит, хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), IgA-нефропатия, остеоартрит, астма, диабетическая нефропатия, реакция «трансплантат против хозяина» (GVHD), эндометриоз, гепатит (NASH), инфаркт миокарда, артериосклероз, сепсис, остеопороз, диабет, множественная миелома, рак предстательной железы, рак почек, B-клеточная неходжкинская лимфома, рак поджелудочной железы, рак легких, рак пищевода, рак толстой кишки, кахексия при раке, нейроинвазия при раке, инфаркт миокарда, миопическая хороидальная неоваскуляризация, идиопатическая хороидальная неоваскуляризация, увеит, хронический тиреоидит, гиперчувствительность замедленного типа, контактный дерматит, атопический дерматит, мезотелиома, полимиозит, дерматомиозит, панувеит, увеит передней доли, промежуточный увеит, склерит, кератит, воспаление глазницы, нейрит зрительного нерва, диабетическая ретинопатия, пролиферативная ретинопатия стекловидного тела, синдром «сухой глаз» и послеоперационное воспаление.

Выражение «содержит антитело против рецептора IL-6 в качестве активного ингредиента» означает, что данное средство содержит антитело против рецептора IL-6 в качестве, по меньшей мере, одного из активных ингредиентов в количестве, не имеющем конкретных ограничений. Кроме того, фармацевтические композиции согласно изобретению могут содержать другие активные ингредиенты в комбинации с полипептидами, описанными выше.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть использованы не только в терапевтических целях, но также и в профилактических целях.

Полипептиды согласно изобретению могут быть получены стандартными методами (см., например, руководство Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA). При необходимости такие полипептиды могут содержать фармацевтически приемлемые носители и/или добавки. Так, например, они могут содержать детергенты (например, ПЭГ и твин), наполнители, антиоксиданты (например, аскорбиновую кислоту), красители, ароматизаторы, консерванты, стабилизаторы, забуферивающие вещества (например, фосфорную кислоту, лимонную кислоту и другие органические кислоты), хелатообразующие вещества (например, EDTA), суспендирующие агенты, агенты, придающие изотоничность, связующие вещества, дезинтегрирующие вещества, замасливатели, стимуляторы текучести и корригенты. Однако агенты согласно изобретению, используемые для предупреждения или лечения воспалительных заболеваний, не ограничиваются вышеуказанными агентами и могут при необходимости содержать другие стандартные носители. Конкретными примерами являются легкая безводная кремниевая кислота, лактоза, кристаллическая целлюлоза, маннит, крахмал, кальций-содержащая кармеллоза, натрий-содержащая кармеллоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, диэтиламиноацетат поливинилацеталя, поливинилпирролидон, желатин, триглицерид жирной кислоты со средней длиной цепи, гидрированное полиоксиэтиленом касторовое масло 60, сахароза, карбоксиметилцеллюлоза, кукурузный крахмал и неорганические соли. Они могут также содержать и другие низкомолекулярные полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин и иммуноглобулин; и аминокислоты. При получении водных растворов для инъекций, антитела против рецептора IL-6 растворяют, например, в изотоничных растворах, содержащих физиологический раствор, глюкозу или другие адъюванты. Адъювантами являются, например, D-сорбит, D-манноза, D-маннит и хлорид натрия. Кроме того, соответствующие солюбилизирующие агенты, например, спирт (этанол и т.п.), многоатомный спирт (пропиленгликоль, ПЭГ и т.п.) и неионогенные поверхностно-активные вещества (полисорбат 80 и HCO-50) могут быть объединены друг с другом.

Если это необходимо, то полипептиды могут быть инкапсулированы в микрокапсулы (микрокапсулы, изготовленные из гидроксицеллюлозы, желатина, поли(метиленакрилата) и т.п.), либо они могут быть включены в коллоидальную систему для доставки лекарственных средств (в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы нанокапсулы и т.п. (см., например, “Remington's Pharmaceutical Science 16th edition”, Oslo Ed. (1980)). Кроме того, специалистам известны методы получения лекарственных средств в виде препаратов пролонгированного действия, и такие методы могут быть применены для получения полипептидов (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. (1982) 12:98-105; патент США № 3773919; European Patent Application (EP) № 58481; Sidman et al., Biopolymers (1983) 22:547-56; EP № 133988). Кроме того, объем жидкости для подкожного введения может быть увеличен путем добавления гуалуронидазы к данному средству или смешивания с ней (см., например, WO 2004/078140).

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут быть введены перорально или парентерально, а предпочтительно парентерально. В частности, указанные композиции могут быть введены пациенту путем инъекции или чрескожно. Такими инъекциями являются, например, системные и местные инъекции, вводимые внутривенно, внутримышечно или подкожно и т.п. Композиции могут быть инъецированы локально в участок, подвергаемый лечению, или в периферические области, в частности, путем внутримышечной инъекции. Лекарственными формами для чрескожного введения являются, например, мази, гели, кремы, припарки и пластыри, которые могут быть введены местно или системно. Кроме того, способы введения могут быть соответствующим образом выбраны в зависимости от возраста пациента и симптомов заболевания. Вводимая доза может, например, составлять в пределах от 0,0001 мг до 100 мг активного ингредиента на кг массы тела для каждого введения. Альтернативно, при введении композиций человеку, доза активного ингредиента может составлять, например, в пределах от 0,001 до 1000 мг на кг массы тела для каждого пациента. Доза для разового введения предпочтительно содержит, например, антитело согласно изобретению в количестве примерно от 0,01 до 50 мг/кг массы тела. Однако доза антитела согласно изобретению не ограничивается указанными дозами.

Аминокислоты, содержащиеся в аминокислотных последовательностях согласно изобретению, могут быть посттрансляционно модифицированы (например, специалистам хорошо известна модификация N-концевого глутамина с образованием пироглутаминовой кислоты, проводимая посредством пироглутамилирования). Само собой разумеется, что такие посттрансляционно модифицированные аминокислоты входят в состав аминокислотных последовательностей согласно изобретению.

Кроме того, сахарные цепи, связанные с антителами согласно изобретению, могут иметь любую структуру. Сахарная цепь в положении 297 (в соответствии с Европейской системой нумерации (EU)) может иметь любую структуру (предпочтительно фукозилированная сахарная цепь), или сахарная цепь может быть не связана с антителом (например, это может быть достигнуто путем продуцирования антител в Escherichia coli, либо путем введения модификации, при которой сахарная цепь не присоединяется в положении 297, в соответствии с EU).

Все цитируемые здесь документы вводятся в настоящее описание посредством ссылки.

Примеры

Ниже приводится более подробное описание настоящего изобретения со ссылками на примеры, которые не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.

[Пример 1]. Идентификация сайтов мутации в вариабельных областях в целях повышения аффинности тоцилизумаба по отношению к рецептору IL-6

Была сконструирована библиотека последовательностей CDR, в которые были введены мутации и которые были проанализированы на их способность повышать аффинность тоцилизумаба (H-цепи дикого типа (WT)-IgG1/SEQ ID NO: 53; L-цепи дикого типа (WT)-каппа/SEQ ID NO: 54) по отношению к рецептору IL-6. Скрининг библиотеки мутаций в CDR выявил мутации, повышающие аффинность к рецептору IL-6. Эти мутации показаны на фиг. 1. Комбинация этих мутаций позволяла получить высокоаффинный тоцилизумаб, такой как RDC-23 (H-цепь RDC23H-IgG1/SEQ ID NO: 55; L-цепь RDC-23L-каппа/SEQ ID NO: 56). Было проведено сравнение аффинностей к растворимому рецептору IL-6 и биологических активностей RDC-23 и тоцилизумаба, определенных с использованием BaF/gp130 (см. сравнительные примеры для данного метода).

Результат измерения аффинности представлен в таблице 1. Результат определения биологической активности, проводимого с использованием BaF/gp130 (конечная концентрация IL-6 составляла 30 нг/мл), представлен на фиг. 2. Результаты показали, что по сравнению с тоцилизумабом аффинность RDC-23 была примерно в 60 раз выше, а активность, выраженная как концентрация, дающая 100% ингибирование BaF/gp130, была выше примерно в 100 раз.

Таблица 1   k_a (1/Мс) k_d (1/с) K_D(M) Тоцилизумаб 4,9E+05 2,0E-03 4,0E-09 RDC-23 6,4E+05 4,3E-05 6,7E-11

[Пример 2]. Идентификация мутаций, способствующих улучшению фармакокинетических свойств тоцилизумаба, посредством снижения величины его изоэлектрической точки

Для улучшения фармакокинетических свойств тоцилизумаба было проведено исследование, целью которого является идентификация сайтов мутации, способствующих снижению величины изоэлектрической точки вариабельных областей без значительного снижения уровня связывания с рецептором IL-6. Скрининг сайтов мутации в вариабельных областях, которые были предсказаны исходя из моделей трехмерной структуры тоцилизумаба, выявил сайты мутации, способствующие снижению величины изоэлектрической точки вариабельных областей без значительного снижения уровня его связывания с рецептором IL-6. Данные представлены на фиг. 3. Комбинация этих мутаций позволяла получить тоцилизумаб с уменьшенной величиной изоэлектрической точки, включая, например, H53/L28 (H-цепь H53-IgG1/SEQ ID NO: 57; L-цепь L28-каппа/SEQ ID NO: 58). Было проведено сравнение аффинностей к растворимому рецептору IL-6, величин изоэлектрических точек, фармакокинетических свойств у мышей и биологических активностей для H53/L28 и тоцилизумаба, определенных с использованием BaF/gp130 (см. сравнительные примеры для данного метода).

Результат измерения аффинности представлен в таблице 2. Результат определения биологической активности, проводимого с использованием BaF/gp130 (конечная концентрация IL-6 составляла 30 нг/мл), представлен на фиг. 4. Результаты показали, что по сравнению с тоцилизумабом аффинность H53/L28 была примерно в шесть раз выше, а активность, выраженная как концентрация, дающая 100% ингибирование BaF/gp130, была примерно в несколько раз выше.

Таблица 2   k_a (1/Мс) k_d (1/с) K_D(M) Тоцилизумаб 4,9E+05 2,0E-03 4,0E-09 H53/L28 7,6E+05 5,2E-04 6,8E-10

Результаты определения величины изоэлектрической точки известным методом электрофореза с изоэлектрическим фокусированием показали, что изоэлектрические точки тоцилизумаба и H53/L28 составляли примерно 9,3 и 6,5-6,7, соответственно. Таким образом, изоэлектрическая точка H53/L28 была ниже изоэлектрической точки тоцилизумаба примерно на 2,7. Кроме того, теоретическая изоэлектрическая точка вариабельных областей VH/VL была вычислена с использованием GENETYX (GENETYX CORPORATION). Полученный результат показал, что теоретические изоэлектрические точки тоцилизумаба и H53/L28 составляли 9,20 и 4,52, соответственно. Таким образом, изоэлектрическая точка H53/L28 была ниже изоэлектрической точки тоцилизумаба примерно на 4,7.

Для оценки фармакокинетических свойств модифицированного антитела H53/L28, которое имеет более низкую величину изоэлектрической точки, было проведено сравнение фармакокинетических свойств тоцилизумаба и H53/L28 у нормальных мышей. Для оценки зависимости концентрации тоцилизумаба или H53/L28 в плазме от времени мышам (C57BL/6J; Charles River Japan, Inc.) внутривенно (i.v.) или подкожно (s.c.) вводили одну дозу тоцилизумаба или H53/L28 в количестве 1 мг/кг. Зависимость концентрации тоцилизумаба и H53/L28 в плазме от времени после внутривенного или подкожного введения показана на фиг. 5 и 6, соответственно. Фармакокинетические параметры (клиренс (CL) и время полужизни (T_1/2)), полученные с использованием WinNonlin (Pharsight), представлены в таблице 3. Время полужизни (T_1/2) H53/L28 в плазме после внутривенного введения приблизительно в 1,3 раза превышало время полужизни тоцилизумаба, а клиренс снижался примерно в 1,7 раза. Время полужизни (T_1/2) H53/L28 после подкожного введения приблизительно в два раза превышало время полужизни тоцилизумаба, а клиренс снижался примерно в 2,1 раза. Таким образом, было обнаружено, что фармакокинетические свойства могут быть значительно улучшены путем уменьшения величины изоэлектрической точки тоцилизумаба после введения аминокислотных замен.

Таблица 3   i.v. s.c.   CL, мл/ч/кг Т_1/2, день CL/F, мл/ч/кг Т_1/2, день Тоцилизумаб 0,177 18,5 0,18 14,7 Н53/L28 0,102 23,5 0,086 29,7

[Пример 3] Идентификация сайтов мутации, способствующих снижению иммуногенности тоцилизумаба

Идентификация мутаций, способствующих снижению риска иммуногенности Т-клеточных эпитопов, присутствующих в вариабельных областях

T-клеточные эпитопы, присутствующие в последовательности вариабельной области тоцилизумаба, анализировали с использованием TEPITOPE (Methods. 2004 Dec; 34(4):468-75). В результате было высказано предположение, что CDR2 L-цепи имеет множество Т-клеточных эпитопов, которые должны связываться с HLA (то есть эта цепь имеет последовательность, ответственную за высокий риск иммуногенности). Таким образом, был проведен анализ TEPITOPE для оценки аминокислотных замен, которые будут снижать риск иммуногенности CDR2 L-цепи, но не будут снижать стабильность, активность связывания или нейтрализующую активность.

Как описано ниже, результаты скрининга продемонстрировали, что риск иммуногенности может быть снижен без снижения стабильности, активности связывания или нейтрализующей активности путем замены треонина в положении L51 (нумерация по Кабату; Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH)) CDR2 L-цепи (SEQ ID NO: 59) тоцилизумаба на глицин, и аргинина в положении L53 на глутаминовую кислоту (SEQ ID NO: 60):

CDR2 L-цепи тоцилизумаба (SEQ ID NO: 59)

CDR2 L-цепи тоцилизумаба с удаленными T-клеточными эпитопами (SEQ ID NO: 60)

[Пример 4]. Снижение риска иммуногенности путем полной гуманизации каркасных последовательностей вариабельной области тоцилизумаба

В способе гуманизации тоцилизумаба некоторые мышиные последовательности оставляют в каркасной последовательности в целях сохранения связывающей активности (Cancer Res. 1993 Feb 15; 53(4):851-6). Такими последовательностями являются H27, H28, H29 и H30 в FR1 Н-цепи и H71 в FR3 Н-цепи (нумерация по Кабату; Kabat E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH)) последовательности вариабельной области тоцилизумаба. Мышиные последовательности, которые были сохранены, могут повышать риск иммуногенности. Таким образом, был проведен анализ для того, чтобы определить, может ли полностью гуманизированная каркасная последовательность способствовать дальнейшему снижению риска иммуногенности тоцилизумаба.

Полученные результаты показали, что вся каркасная последовательность тоцилизумаба может быть полностью гуманизирована без снижения стабильности, связывающей активности или нейтрализующей активности путем замены FR1 H-цепи (SEQ ID NO: 61) тоцилизумаба на гуманизированную FR1-A Н-цепи (SEQ ID NO: 62), представленной ниже, и замены FR3 H-цепи (SEQ ID NO: 63) на гуманизированную FR3 H-цепи (SEQ ID NO: 64), представленной ниже:

FR1 H-цепи тоцилизумаба (SEQ ID NO: 61)

Гуманизированная FR1-A H-цепи (SEQ ID NO: 62) (происходящая от зародышевой линии IMGT hVH_4)

FR3 H-цепи тоцилизумаба (SEQ ID NO: 63)

Гуманизированная FR3 H-цепи (SEQ ID NO: 64) (полученная как описано в Mol. Immunol. 2007, 44(4):412-422).

[Пример 5]. Идентификация сайтов мутации в целях улучшения фармакокинетических свойств, проводимая исходя из pH-зависимого связывания тоцилизумаба с рецептором IL-6

Один из способов улучшения фармакокинетических свойств тоцилизумаба заключается в улучшении свойств молекулы, так чтобы одна молекула тоцилизумаба могла несколько раз связываться с рецептором IL-6 и нейтрализовать несколько молекул рецептора IL-6. Было высказано предположение, что после связывания с рецептором IL-6 мембранного типа тоцилизумаб поглощается внутриклеточными эндосомами посредством интернализации при связывании с рецептором IL-6 мембранного типа, а затем, при связывании с рецептором IL-6 мембранного типа, он переносится в лизосомы и разлагается этими лизосомами. В частности, одна молекула тоцилизумаба обычно связывается с одной или с двумя молекулами рецептора IL-6 мембранного типа (по одновалентному или двухвалентному механизму) и разлагается в лизосомах после интернализации. Поэтому одна молекула тоцилизумаба может связываться только с одной или двумя молекулами рецептора IL-6 мембранного типа и нейтрализовать только одну или две такие молекулы.

Таким образом, авторы настоящего изобретения считают, что, если возможно получение тоцилизумаба, который связывается в зависимости от рН, где указанное связывание тоцилизумаба поддерживается в нейтральных условиях, но значительно снижается в кислотных условиях, то тоцилизумаб, который связывается в зависимости от рН, будет диссоциироваться из рецептора IL-6 мембранного типа (антигена) в эндосомах и возвращаться в плазму благодаря связыванию с FcRn, присутствующим в эндосомах, как проиллюстрировано на фиг.7. После возвращения в плазму тоцилизумаб, связывание которого зависит от рН, может снова связываться с рецептором IL-6 мембранного типа. Очевидно, что в результате повторного связывания в плазме и диссоциации в эндосомах одна молекула тоцилизумаба может несколько раз связываться с несколькими молекулами рецептора IL-6/нейтрализовать несколько молекул рецептора IL-6. Таким образом, считается, что тоцилизумаб, связывание которого зависит от рН, обладает улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению со стандартным тоцилизумабом.

Для того чтобы тоцилизумаб диссоциировался из рецептора IL-6 в кислотных условиях в эндосоме, связывание в кислотных условиях должно быть значительно слабее, чем в нейтральных условиях. На клеточной поверхности для нейтрализации необходимо сильное связывание с рецептором IL-6, а поэтому, при pH 7,4, который представляет собой рН клеточной поверхности, антитело должно связываться с рецептором IL-6 с такой же силой, как и тоцилизумаб, или более. Сообщалось, что рН в эндосоме обычно составляет 5,5-6,0 (Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004 Feb;5(2):121-32). Таким образом, если тоцилизумаб, связывание которого зависит от рН, был модифицирован в целях ослабления его связывания с рецептором IL-6 при pH 5,5-6,0, то можно предположить, что он будет диссоциироваться из рецептора IL-6 в кислотных условиях в эндосомах. В частности, если тоцилизумаб, связывание которого зависит от рН, был модифицирован в целях усиления его связывания с рецептором при pH 7,4, который представляет собой рН клеточной поверхности, и в целях ослабления его связывания с рецептором IL-6 при pH 5,5-6,0, который является эндосомным pH, то одна молекула тоцилизумаба может связываться с несколькими молекулами рецептора IL-6 и нейтрализовать несколько молекул рецептора IL-6, а поэтому она может обладать улученными фармакокинетическими свойствами.

Возможным методом сообщения тоцилизумабу способности к pH-зависимому связыванию с рецептором IL-6 является введение гистидиновых остатков в вариабельную область тоцилизумаба, поскольку pKa гистидинового остатка составляет примерно 6,0-6,5, и его уровни диссоциации протонов в нейтральных условиях (pH 7,4) и в кислотных условиях (pH 5,5-6,0) отличаются. Таким образом, был проведен скрининг для идентификации сайтов введения гистидина в вариабельных областях исходя из трехмерной структурной модели тоцилизумаба. Кроме того, в выбранных последовательностях вариабельной области тоцилизумаба были сделаны произвольные замены гистидином в целях конструирования библиотеки для скрининга. Скрининг осуществляли путем связывания с рецептором IL-6 при pH 7,4 и диссоциации из рецептора IL-6, или путем снижения аффинности при pH 5,5-5,8, где указанные параметры используются как индикаторы.

В результате авторами настоящего изобретения были идентифицированы сайты мутации, сообщающие тоцилизумабу способность к pH-зависимому связыванию с рецептором IL-6 (способность связываться при pH 7,4 и диссоциироваться при pH 5,8). Результаты представлены на фиг. 8. На фиг. 8 заменой тирозина гистидином в положении H27 является модификация в FR1 H-цепи, но не в CDR. Однако, как описано в публикации Eur. J. Immunol. (1992) 22:1719-1728, последовательностью с гистидином в положении H27 является человеческая последовательность (SEQ ID NO: 65). Таким образом, данное антитело может быть полностью гуманизировано в нижеследующей каркасной последовательности в комбинации с гуманизацией, описанной в примере 4, с получением гуманизированной FR1-B H-цепи (SEQ ID NO: 65).

Комбинация мутаций, включая, например, H3pI/L73 (H-цепь H3pI-IgG1/SEQ ID NO: 66; L-цепь L73-каппа/SEQ ID NO: 67), может сообщать тоцилизумабу способность к pH-зависимому связыванию. H3pI/L73 и тоцилизумаб сравнивали по их аффинности к растворимому рецептору IL-6 при pH 7,4, скорости диссоциации из рецептора IL-6 мембранного типа при pH 7,4 и pH 5,8, биологической активности, оцениваемой с использованием BaF/gp130, и фармакокинетическим свойствам у собакоподобных обезьян и мышей, трансгенных по человеческому рецептору IL-6 (см. сравнительные примеры для данного метода).

Результаты анализа на аффинность связывания с растворимым рецептором IL-6 при pH 7,4 представлены в таблице 4. Результаты анализов на биологическую активность, проводимых с использованием BaF/gp130 (конечная концентрация IL-6 равна 30 нг/мл), представлена на фиг. 9. Эти результаты показали, что аффинность связывания H3pI/L73 с растворимым рецептором IL-6 при pH 7,4 и активность, оцениваемая с использованием BaF/gp130, были сравнимы с указанными параметрами для тоцилизумаба.

Таблица 4   k_a (1/Мс) k_d (1/с) K_D(M) Тоцилизумаб 5,1E+05 1,0E-03 2,1E-09 H3pI/L73 5,4E+05 7,4E-04 1,4E-09

Результаты измерения скорости диссоциации тоцилизумаба или H3pI/L73 из рецептора IL-6 мембранного типа при pH 7,4 и pH 5,8 представлены в таблице 5. По сравнению с тоцилизумабом скорость диссоциации H3pI/L73 при pH 5,8 была выше, а скорость диссоциации из рецептора IL-6 мембранного типа в зависимости от рН была выше примерно в 2,6 раза.

Таблица 5   pH 7,4
k_d (1/с) pH 5,8
k_d (1/с) K_d(рН5,8)/ K_d(рН7,4)
рН-зависимость Тоцилизумаб 2,5E-04 2,5E-04 1,00 H3pI/L73 2,6E-04 6,7E-04 2,59

Для оценки зависимости концентрации тоцилизумаба или H3pI/L73 в плазме от времени собакоподобным обезьянам внутривенно вводили одну дозу тоцилизумаба или H3pI/L73 в количестве 1 мг/кг. Зависимость концентрации тоцилизумаба или H3pI/L73 в плазме от времени после внутривенного введения представлена на фиг. 10. Результаты показали, что у собакоподобных обезьян фармакокинетические свойства H3pI/L73 были значительно лучше, чем фармакокинетические свойства тоцилизумаба.

Для оценки зависимости концентрации тоцилизумаба или H3pI/L73 в плазме от времени мышам, трансгенным по человеческому рецептору IL-6 (hIL-6R-трансгенным мышам; Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23; 92(11):4862-6), внутривенно вводили одну дозу тоцилизумаба или H3pI/L73, составляющую 25 мг/кг. Зависимость концентрации тоцилизумаба или H3pI/L73 в плазме от времени после внутривенного введения представлена на фиг. 11. Результаты показали, что у мышей, трансгенных по человеческому рецептору IL-6, фармакокинетические свойства H3pI/L73 были значительно лучше, чем фармакокинетические свойства тоцилизумаба.

H3pI/L73, который представляет собой тоцилизумаб, обладающий способностью к pH-зависимому связыванию, обнаруживал значительно лучшие фармакокинетические свойства у собакоподобных обезьян и у мышей, трансгенных по человеческому рецептору IL-6, по сравнению с тоцилизумабом. Это позволяет предположить, что одна молекула может связываться с несколькими молекулами IL-6 и нейтрализовать несколько молекул IL-6 при сообщении ей способности к связыванию с антигеном при pH 7,4 и к диссоциации из антигена при pH 5,8. Также считается, что фармакокинетические свойства могут быть еще больше улучшены при сообщении еще более выраженной зависимости связывания от рН, чем это наблюдается у H3pI/L73.

[Пример 6]. Оптимизация константной области тоцилизумаба

Снижение гетерогенности С-конца H-цепи тоцилизумаба

Кроме того, сообщалось, что гетерогенность С-концевых последовательностей H-цепи антитела обусловлена делецией С-концевого лизинового аминокислотного остатка и амидированием С-концевой карбоксильной группы в результате делеции двух С-концевых аминокислот, глицина и лизина (Anal. Biochem. 2007 Jan. 1; 360(1):75-83). Кроме того, в тоцилизумабе главным компонентом является последовательность, в которой С-концевая аминокислота лизин была делетирована в нуклеотидной последовательности в результате посттрансляционной модификации; однако субкомпоненты, в которых лизин сохраняется, и субкомпоненты, в которых С-концевая карбоксильная группа амидирована в результате делеции глицина и лизина, также являются признаками гетерогенности. Трудоемкость и высокая стоимость крумномасштабного промышленного производства фармацевтических препаратов на основе таких антител с сохранением нужных веществ/родственных веществ связаны с гетерогенностью различных продуктов. По возможности, желательно использовать одно вещество, а при разработке антител, используемых в качестве фармацевтических средств, такое вещество должно обладать пониженной гетерогенностью. Таким образом, при разработке антител, используемых в качестве фармацевтических средств, предпочтительно, чтобы С-концевая гетерогенность Н-цепи отсутствовала.

Для снижения гетерогенности С-концевых аминокислот такие С-концевые аминокислоты были модифицированы. Полученные данные показали, что С-концевая гетерогенность может быть предотвращена путем предварительной делеции, сделанной в нуклеотидной последовательности для удаления лизинового и глицинового остатков у С-конца константной области Н-цепи тоцилизумаба. Тоцилизумаб, тоцилизумаб, в котором отсутствует С-концевой лизиновый остаток (TOCILIZUMABΔK: H-цепь WT-IgG1ΔK/SEQ ID NO: 68; L-цепь WT-каппа/SEQ ID NO: 54), и тоцилизумаб, в котором отсутствуют С-концевые лизиновый и глициновый остатки (TOCILIZUMABΔGK: H-цепь WT-IgG1ΔGK/SEQ ID NO: 69; L-цепь WT-каппа/SEQ ID NO: 54), оценивали на гетерогенность с помощью катионообменной хроматографии. Была использована колонка ProPac WCX-10, 4×250 мм (Dionex), где подвижная фаза A представляла собой 25 ммоль/л MES/NaOH (pH 6,1), а подвижная фаза В представляла собой 25 ммоль/л MES/NaOH, 250 ммоль/л NaCl (pH 6,1). Хроматографию проводили при соответствующей скорости потока и в соответствующем градиенте. Результаты анализа, проводимого с помощью катионообменной хроматографии, представлены на фиг. 12. Полученные результаты показали, что гетерогенность С-концевых аминокислот может быть снижена путем предварительной делеции, сделанной в нуклеотидной последовательности для удаления лизинового и глицинового остатков у С-конца константной области Н-цепи, но не путем предварительной делеции только лизинового остатка у С-конца константной области Н-цепи. Все С-концевые последовательности константной области человеческих антител IgG1, IgG2 и IgG4 содержат лизин и глицин в положениях 447 и 446, соответственно, согласно Европейской системе нумерации (см. Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242). Поэтому предполагается, что метод снижения гетерогенности С-концевых аминокислот, обнаруженной в настоящем исследовании, может быть также применим к константным областям IgG2 и IgG4 и к их вариантам.

Снижение гетерогенности, обусловленной дисульфидными связями, в тоцилизумабе изотипа IgG2

Изотипом тоцилизумаба является IgG1. Поскольку тоцилизумаб является нейтрализующим антителом, то связывание с Fcγ-рецептором может оказаться нежелательным с точки зрения продуцирования иммуногенности и побочных эффектов. Возможным способом снижения уровня связывания с Fcγ-рецептором является превращение изотипа антитела IgG с IgG1 на IgG2 или IgG4 (Ann Hematol. 1998 Jun; 76(6):231-48). С точки зрения уровня связывания с Fcγ-рецептором I и фармакокинетики считается, что IgG2 является более предпочтительным, чем IgG4 (Nat. Biotechnol. 2007 Dec; 25(12):1369-72). Кроме того, физико-химические свойства белков, а в частности, гомогенность и стабильность, имеют очень важное значение при разработке антител в качестве фармацевтических препаратов. Сообщалось, что антитело изотипа IgG2 является в высокой степени гетерогенным, что обусловлено дисульфидными связями в шарнирной области (J. Biol. Chem. 2008 Jun. 6; 283(23):16206-15). Трудоемкость и высокая стоимость крупномасштабного промышленного производства фармацевтических препаратов на основе таких антител при сохранении нужных веществ/родственных веществ связаны с гетерогенностью, обусловленной различием дисульфидных связей в различных продуктах. Таким образом, по-возможности, желательно использовать одно вещество. Так, например, при разработке антител изотипа IgG2 в качестве фармацевтических препаратов, предпочтительно, чтобы гетерогенность, обусловленная дисульфидными связями, была снижена, но так, чтобы это не приводило к снижению стабильности.

Для снижения гетерогенности антитела изотипа IgG2 была проведена оценка различных вариантов. В результате было обнаружено, что гетерогенность может быть снижена без снижения стабильности с использованием константной области WT-SKSC (SEQ ID NO: 70), где в последовательностях константной области IgG2, цистеиновый остаток в положении 131 и аргининовый остаток в положении 133 (в соответствии с Европейской нумерацией) в домене CH1 H-цепи были заменены серином и лизином, соответственно, а цистеиновый остаток в положении 219 (в соответствии с Европейской нумерацией) в верхней шарнирной области Н-цепи был заменен серином. Тоцилизумаб-IgG1 (H-цепь WT-IgG1/SEQ ID NO: 53; L-цепь WT-каппа/SEQ ID NO: 54), тоцилизумаб-IgG2 (H-цепь WT-IgG2/SEQ ID NO: 71; L-цепь WT-каппа/SEQ ID NO: 54) и тоцилизумаб-SKSC (H-цепь WT-SKSC/SEQ ID NO: 70; L-цепь WT-каппа/SEQ ID NO: 54) были получены и проанализированы на гетерогенность и стабильность. Гетерогенность оценивали с помощью катионообменной хроматографии. Была использована колонка ProPac WCX-10 (Dionex), где подвижная фаза A представляла собой 20 мМ ацетата натрия (pH 5,0), а подвижная фаза В представляла собой 20 мМ ацетата натрия, 1М NaCl (pH 5,0). Хроматографию проводили при соответствующей скорости потока и в соответствующем градиенте. Результаты анализа, проводимого с помощью катионообменной хроматографии, представлены на фиг. 13. Стабильность оценивали исходя из промежуточного значения температуры при тепловой денатурации (значения Tm), определенного с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) (VP-DSC; Microcal). Результаты ДСК-измерения в 20 мМ ацетата натрия, 150 мМ NaCl, pH 6,0 и величины Tm Fab-домена представлены на фиг. 14.

Результаты показали, что гетерогенность тоцилизумаба-IgG2 заметно возрастала по сравнению с тоцилизумабом-IgG1; однако гетерогенность может быть значительно снижена путем превращения в тоцилизумаб-SKSC. Кроме того, при сравнении с тоцилизумабом-IgG1, ДСК тоцилизумаба-IgG2 давала компонент плеча пика (Fab*) с низкой стабильностью, то есть с низкой Tm, в пиках для тепловой денатурации Fab-домена, что, предположительно, обусловлено наличием гетерогенного компонента. Однако, при превращении в тоцилизумаб-SKSC, плечо пика (с низкой Tm), которое, как считается, обусловлено наличием гетерогенного компонента, исчезало, а величина Tm составляла примерно 94°C и была эквивалентна величине Tm Fab-домена тоцилизумаба-IgG1 и тоцилизумаба-IgG2. Таким образом, было обнаружено, что тоцилизумаб-SKSC обладает высокой стабильностью.

Идентификация сайтов мутаций, улучшающих фармакокинетические свойства, в константной области тоцилизумаба.

Как описано выше, исходя из IgG1, который является изотипом тоцилизумаба, может быть достигнуто снижение С-концевой гетерогенности и снижение гетерогенности антител с константными областями изотипа IgG2, а также снижение уровня связывания с Fcγ-рецептором и сохранение высокой стабильности. Кроме того, предпочтительно, чтобы константная область обладала улучшенными фармакокинетическими свойствами по сравнению с IgG1, который представляет собой изотип тоцилизумаба.

Для идентификации константных областей, которые имеют более продолжительное время полужизни в плазме, чем константные области антител изотипа IgG1, проводили скрининг для идентификации сайтов мутации в целях улучшения фармакокинетических свойств тоцилизумаба-SKSC, который имеет высокую стабильность и более низкую гетерогенность по сравнению с антителами, содержащими константные области изотипа IgG2, как упоминалось выше. В результате было обнаружено WT-M58 (SEQ ID NO: 72 (аминокислотная последовательность)), в котором по сравнению с WT-SKSC глутаминовая кислота в положении 137, согласно Европейской нумерации, была заменена глицином, серин в положении 138 был заменен глицином, гистидин в положении 268 был заменен глутамином, аргинин в положении 355 был заменен глутамином, глутамин в положении 419 был заменен глутаминовой кислотой, а глицин в положении 446 и лизин в положении 447 были делетированы в целях снижения гетерогенности С-конца Н-цепи. Кроме того, было получено WT-M44 (SEQ ID NO: 73 (аминокислотная последовательность)), в котором по сравнению с IgG1 аргинин в положении 434 был заменен аланином. Кроме того, WT-M83 (SEQ ID NO: 74 (аминокислотная последовательность)) было получено путем делеции глицина в положении 446 и лизина в положении 447 антитела M44 в целях снижения гетерогенности С-конца Н-цепи. Кроме того, антитело WT-M73 (SEQ ID NO: 75 (аминокислотная последовательность)) было продуцировано путем замены аспарагина в положении 434 на аланин в WT-M58.

Тоцилизумаб-M44 (H-цепь WT-M44/SEQ ID NO: 73; L-цепь WT-каппа/SEQ ID NO: 54), тоцилизумаб-M58 (H-цепь WT-M58/SEQ ID NO: 72; L-цепь WT-каппа/SEQ ID NO: 54) и тоцилизумаб-M73 (H-цепь WT-M73/SEQ ID NO: 75; L-цепь WT-каппа/SEQ ID NO: 54) получали и оценивали на аффинность связывания с человеческим FcRn и на фармакокинетические свойства у мышей, трансгенных по человеческому FcRn (см. сравнительные примеры для данного метода).

Связывание тоцилизумаба-IgG1, тоцилизумаба-M44, тоцилизумаба-M58 и тоцилизумаба-M73 с человеческим FcRn оценивали с помощью Biacore. Как показано в таблице 6, уровень связывания тоцилизумаба-M44, тоцилизумаба-M58 и тоцилизумаба-M73 примерно в 2,7 раза, 1,4 раза и 3,8 раза превышал уровень связывания тоцилизумаба-IgG1, соответственно.

Таблица 6   K_D (мкМ) тоцилизумаб-IgG1 1,62 тоцилизумаб-M44 0,59 тоцилизумаб-M58 1,17 тоцилизумаб-M73 0,42

Тоцилизумаб-IgG1, тоцилизумаб-M44, тоцилизумаб-M58 и тоцилизумаб-M73 оценивали на фармакокинетические свойства у мышей, трансгенных по человеческому FcRn. Результаты представлены на фиг.15. Было обнаружено, что все антитела, а именно тоцилизумаб-M44, тоцилизумаб-M58 и тоцилизумаб-M73, по сравнению с тоцилизумабом-IgG1 обладают улучшенными фармакокинетическими свойствами, как показано на фиг. 15. Эффект улучшения фармакокинетических свойств коррелирует со способностью связываться с человеческим FcRn. В частности, концентрация тоцилизумаба-M73 в плазме через 28 дней приблизительно в 16 раз превышала концентрацию тоцилизумаба-IgG1. Таким образом, было также высказано предположение, что антитела, имеющие константную область M73, обладают значительно лучшими фармакокинетическими свойствами у человека по сравнению с антителами, имеющими константную область IgG1.

[Пример 7] Получение полностью гуманизированных антител против рецептора IL-6, обладающих улучшенными ФК/ФД-свойствами

Варианты тоцилизумаба получали путем объединения множества мутаций в вариабельных и константных областях тоцилизумаба, идентифицированных, как описано выше в примерах. Полностью гуманизированные антитела против рецептора IL-6, идентифицированные различными методами скрининга, представляют собой: Fv3-M73 (H-цепь VH4-M73/SEQ ID NO: 25; L-цепь VL1-каппа/SEQ ID NO: 28), Fv4-M73 (H-цепь VH3-M73/SEQ ID NO: 26; L-цепь VL3-каппа/SEQ ID NO: 29) и Fv5-M83 (H-цепь VH5-M83/SEQ ID NO: 27; L-цепь VL5-каппа/SEQ ID NO: 30).

Аффинности полученных Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 против рецептора IL-6 сравнивали с аффинностью тоцилизумаба (см. сравнительный пример для этого метода). Аффинности указанных антител к растворимому рецептору IL-6, определенные при pH 7,4, представлены в таблице 7. Кроме того, их BaF/gp130- нейтрализующие активности сравнивали с соответствующими активностями тоцилизумаба и контроля (известного высокоаффинного антитела против рецептора IL-6, описанного в сравнительном примере, и VQ8F11-21 hIgG1, описанного в заявке США 2007/0280945) (см. сравнительный пример для этого метода). Результаты, полученные при определении биологической активности указанных антител с использованием BaF/gp130, представлены на фиг. 16 (тоцилизумаб, контрольное антитело и Fv5-M83 с конечной концентрацией IL-6, равной 300 нг/мл) и фиг. 17 (тоцилизумаб, Fv3-M73 и Fv4-M73 с конечной концентрацией IL-6, равной 30 нг/мл). Как показано в таблице 7, аффинность Fv3-M73 и Fv4-M73 примерно в 2-3 раза превышала аффинность тоцилизумаба, а аффинность Fv5-M83 примерно в 100 раз превышала аффинность тоцилизумаба (из-за трудности измерения аффинности Fv5-M83, такую аффинность определяли с использованием Fv5-IgG1 (H-цепь VH5-IgG1/SEQ ID NO: 76; L-цепь VL5-каппа/SEQ ID NO: 30), которое имело константную область типа IgG1; причем обычно считается, что константная область не оказывает какого-либо влияния на аффинность). Как показано на фиг. 17, Fv3-M73 и Fv4-M73 обладали несколько более высокой активностью, чем тоцилизумаб. Как показано на фиг. 16, Fv5-M83 обладало очень высокой активностью, которая более чем в 100 раз превышала активность тоцилизумаба с точки зрения 50%-ной ингибирующей концентрации. Fv5-M83 также обладало нейтрализующей активностью, которая примерно в 10 раз превышала нейтрализующую активность контрольного антитела с точки зрения 50%-ной ингибирующей концентрации (известного высокоаффинного антитела против рецептора IL-6).

Таблица 7   k_a (1/Мс) k_d (1/с) K_D (M) Тоцилизумаб 4,0E+05 1,1E-03 2,7E-09 Fv3-M73 8,5E+05 8,7E-04 1,0E-09 Fv4-M73 7,5Е+05 1,0Е-03 1,4Е-09 Fv5-M83 1,1Е+06 2,8Е-05 2,5Е-11

Была определена скорость диссоциации тоцилизумаба, Fv3-M73 и Fv4-M73 из рецептора IL-6 мембранного типа при pH 7,4 и 5,8. Как показали результаты, представленные в таблице 8 (см. сравнительный пример для данного метода), рН-зависимая скорость диссоциации Fv3-M73 и Fv4-M73 из рецептора IL-6 мембранного типа была примерно в 11 раз и в 10 раз выше, соответственно, по сравнению с тоцилизумабом. Значительное увеличение pH-зависимой скорости диссоциации по отношению к H3pI/L73, описанное в примере 5, дает основание предположить, что фармакокинетические свойства Fv3-M73 и Fv4-M73 были значительно лучше, чем фармакокинетические свойства H3pI/L73.

Таблица 8   pH 7,4
k_d (1/с) pH 5,8
k_d (1/с) K_d(рН5,8)/ K_d(рН7,4)
рН-зависимость Тоцилизумаб 2,5E-04 2,5E-04 1,00 Fv3-M73 4,9E-04 5,3E-03 10,88 Fv4-M73 5,1Е-04 5,1Е-03 10,06

Изоэлектрические точки тоцилизумаба, контроля, Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 определяли с помощью электрофореза с изоэлектрическим фокусированием, проводимого методом, известным специалистам. Результаты показали, что изоэлектрическая точка составляла примерно 9,3 для тоцилизумаба; примерно 8,4-8,5 для контроля; примерно 5,7-5,8 для Fv3-M73; примерно 5,6-5,7 для Fv4-M73; и 5,4-5,5 для Fv5-M83. Таким образом, каждое из указанных антител имело значительно меньшую величину изоэлектрической точки по сравнению с величиной изоэлектрической точки для тоцилизумаба и контроля. Кроме того, теоретическое значение изоэлектрической точки вариабельных областей VH/VL вычисляли с помощью GENETYX (GENETYX CORPORATION). Результаты показали, что теоретическое значение изоэлектрической точки составляло 9,20 для тоцилизумаба; 7,79 для контроля; 5,49 для Fv3-M73; 5,01 для Fv4-M73; и 4,27 для Fv5-M83. Таким образом, каждое антитело имело значительно более низкое значение изоэлектрической точки по сравнению со значениями для тоцилизумаба и контроля. Поскольку, как показано в примере 2, фармакокинетические свойства были улучшены путем снижения величины изоэлектрической точки, то очевидно, что фармакокинетические свойства Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 были лучше фармакокинетических свойств тоцилизумаба и контроля.

T-клеточные эпитопы в последовательности вариабельной области тоцилизумаба, Fv3-M73, Fv4-M73 или Fv5-M83 анализировали с использованием TEPITOPE (Methods. 2004 Dec; 34(4):468-75). В результате было высказано предположение, что тоцилизумаб имеет Т-клеточные эпитопы, многие из которых могут связываться с HLA, как указано в примере 3. В противоположность этому, число последовательностей в Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83, которые, как было предсказано, связываются с Т-клеточными эпитопами, значительно снижено. Кроме того, каркасная область Fv3-M73, Fv4-M73 или Fv5-M83 не имеет мышиной последовательности и является полностью гуманизированной. Было высказано предположение, что риск иммуногенности в Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 может быть значительно снижен по сравнению с тоцилизумабом.

[Пример 8] Анализ фармакокинетических/фармакодинамических свойств (ФК/ФД) полностью гуманизированных антител против рецептора IL-6 у обезьян

Каждое из антител, таких как тоцилизумаб, контрольное антитело, Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 внутривенно вводили собакоподобным обезьянам в одной дозе 1 мг/кг для оценки зависимости концентрации этих антител в плазме от времени (см. сравнительный пример для данного метода). Концентрации тоцилизумаба, Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 в плазме в зависимости от времени после внутривенного введения представлены на фиг.18. Полученные результаты показали, что каждое из антител, а именно Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83, обладало значительно улучшенными фармакокинетическими свойствами у собакоподобных обезьян по сравнению с фармакокинетическими свойствами тоцилизумаба и контрольного антитела. Среди этих антител Fv3-M73 и Fv4-M73 обладали гораздо лучшими фармакокинетическими свойствами по сравнению с тоцилизумабом.

Была оценена эффективность каждого антитела в отношении нейтрализации рецептора IL-6 мембранного типа у собакоподобных обезьян. IL-6 собакоподобных обезьян подкожно вводили в нижнюю область спинки в концентрации 5 мкг/кг каждый день со дня 6 до дня 18 после введения антитела (день 3-день 10 для тоцилизумаба), и через 24 часа определяли концентрацию CRP у каждого животного (см. сравнительный пример для этого метода). Концентрации CRP в зависимости от времени после введения каждого антитела представлены на фиг.19. Для оценки эффективности каждого антитела в отношении нейтрализации растворимого рецептора IL-6 у собакоподобных обезьян определяли концентрацию свободного растворимого рецептора IL-6 в плазме собакоподобных обезьян и вычисляли процент свободного растворимого рецептора IL-6 (см. сравнительный пример для данного метода). Проценты свободного растворимого рецептора IL-6 в зависимости от времени после введения каждого антитела представлены на фиг. 20.

Каждое из Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 обладало более продолжительным нейтрализующим действием по отношению к рецептору IL-6 мембранного типа у собакоподобных обезьян и ингибировало повышение уровня CRP в течение более длительного периода времени по сравнению с тоцилизумабом и контролем (известным высокоаффинным антителом против рецептора IL-6). Кроме того, каждое из Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 обладало более продолжительным нейтрализующим действием по отношению к растворимому рецептору IL-6 у собакоподобных обезьян и ингибировало повышение уровня свободного растворимого рецептора IL-6 у собакоподобных обезьян в течение более длительного периода времени по сравнению с тоцилизумабом и контролем. Полученные данные показали, что все антитела, а именно Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83, обладали более длительным нейтрализующим действием в отношении рецептора IL-6 мембранного типа и растворимого рецептора IL-6 по сравнению с тоцилизумабом и контролем. Из этих антител особенно длительным нейтрализующим действием обладали Fv3-M73 и Fv4-M73. Кроме того, Fv5-M83 ингибировало CRP и свободный растворимый рецептор IL-6 собакоподобных обезьян в более высокой степени, чем Fv3-M73 и Fv4-M73. Таким образом, считается, что Fv5-M83 обладает более сильным нейтрализующим действием по отношению к рецептору IL-6 мембранного типа и растворимого рецептора IL-6, чем антитела Fv3-M73, Fv4-M73 и контрольное антитело (известное высокоаффинное антитело против рецептора IL-6). Считается, что результаты in vivo, полученные для собакоподобных обезьян, показали, что Fv5-M83 обладает более высокой аффинностью по отношению к рецептору IL-6 и более сильной биологической активностью в аналитической системе BaF/gp130 по сравнению с контролем.

Полученные результаты дают основание предположить, что Fv3-M73 и Fv4-M73, по сравнению с тоцилизумабом и контрольным антителом, обладают значительно более длительной активностью как антитела, нейтрализующие рецептор IL-6, а поэтому они могут быть введены в значительно меньшей дозе и с меньшей частотой. Кроме того, было продемонстрировано, что Fv5-M83, используемое в качестве антитела, нейтрализующего рецептор IL-6, обладает гораздо большей активностью и сохраняет эту активность в течение более длительного периода времени. Таким образом, предполагается, что антитела Fv3-M73, Fv4-M73 и Fv5-M83 могут быть использованы в качестве фармацевтических антагонистов IL-6.

[Пример 9]

Известно, что белок, являющийся хемоаттрактантом для моноцитов, (MCP)-1, участвует в клеточной инвазии моноцитов, Т-клеток, NK-клеток и базофилов. Сообщалось, что MCP-1 в высокой степени экспрессируется в синовиальных тканях/синовиальной жидкости пациентов с РА (J. Clin. Invest., Sep. 1992, 90(3):772-779), и считается, что он участвует в развитии патологического состояния типа РА (Inflamm. Allergy Drug Targets, Mar 2008, 7(1):53-66).

VEGF представляет собой сильный ангиогенный фактор, и известно, что он продуцируется, например, макрофагами, фибробластами и синовиальными клетками в синовиальной оболочке пациентов с РА (J. Rheumatol., Sep 1995, 22(9):1624-1630). Кроме того, уровень VEGF в сыворотке пациентов с РА коррелирует с патологической активностью и ростом ее показателей на рентгенограмме (Arthritis Rheum., Jun. 2003, 48(6):1521-1529; и Arthritis Rheum., Sep 2001, 44(9):2055-2064), при этом уровень VEGF в сыворотке снижается при лечении пациентов с РА анти-IL-6R антителом тоцилизумабом, а поэтому считается, что VEGF также играет важную роль в развитии патологического состояния при РА (Mod. Rheumatol. 2009, 19(1):12-19; и Mediators Inflamm. 2008, 2008:129873).

Таким образом, был проведен анализ для того, чтобы определить, могут ли тоцилизумаб и Fv4-M73 ингибировать продуцирование MCP-1 и VEGF в синовильных клетках человека с РА, которое происходит в результате sIL-6R- и IL-6-стимуляции.

Синовиальные клетки человека с PA (TOYOBO) высевали на 96-луночные планшеты в среде IMDM, содержащей 5% FCS, при плотности 2×10⁴ клеток/0,05 мл/лунку, и высевали в течение 90 минут в CO₂-инкубаторе (37°C, 5% CO₂). Затем добавляли 0,05 мл тоцилизумаба и Fv4-M73, разведенных до соответствующих концентраций, и планшеты оставляли на 15 минут, после чего добавляли 0,05 мл растворимого рецептора IL-6 (SR344: полученного методом, описанным в сравнительных примерах). Затем планшеты оставляли еще на 30 минут, после чего добавляли еще 0,05 мл IL-6 (TORAY) (конечные концентрации растворимого рецептора IL-6 и рецептора IL-6 составляли 50 нг/мл для каждого). После культивирования в течение двух дней супернатанты культуры собирали и концентрации MCP-1 и VEGF в этих супернатантах определяли с помощью набора для ELISA (Biosource and Pierce Biotechnology). Результаты представлены на фиг. 21 и 22. Тоцилизумаб и Fv4-M73 ингибировали продуцирование MCP-1 и VEGF в синовиальных клетках человека с РА после стимуляции растворимым рецептором IL-6 и рецептором IL-6 в зависимости от концентрации.

В соответствии с этим продолжительность эффекта Fv4-M73 как антитела, нейтрализующего рецептор IL-6 (эффекта связывания с рецептором IL-6 и блокирования сигналов, передаваемых рецептором IL-6 мембранного типа и растворимым рецептором IL-6), была значительно выше, чем у тоцилизумаба, а поэтому частота введения и доза могут быть значительно снижены по сравнению с частотой введения и дозой тоцилизумаба, и кроме того, было обнаружено, что Fv4-M73 ингибирует продуцирование MCP-1 и VEGF в синовиальных клетках человека с РА. Таким образом, было показано, что Fv4-M73 является наиболее эффективным терапевтическим средством для лечения РА.

Сравнительные примеры

Получение растворимого рекомбинантного человеческого рецептора IL-6

Растворимый рекомбинантный человеческий рецептор IL-6, происходящий от человеческого рецептора IL-6, который является антигеном, получали, как описано ниже. Была получена клеточная линия CHO, конститутивно экспрессирующая растворимый человеческий рецептор IL-6, содержащий последовательность, начинающуюся от первой N-концевой аминокислоты и заканчивающуюся 344-й аминокислотой, как описано в публикации J. Biochem. (1990) 108, 673-676 (Yamasaki et al., Science (1988) 241, 825-828 (GenBank #X12830)). Растворимый человеческий рецептор IL-6 очищали от супернатанта культуры SR344-экспрессирующих клеток СНО путем проведения колоночной хроматографии трех типов: колоночной хроматографии на сефарозе Blue Sepharose 6 FF, аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным на ней антителом, специфичным к SR344, и колоночной хроматографии типа гель-фильтрации. Фракции, элюированные как главный пик, использовали в качестве конечного очищенного образца.

Получение растворимого рекомбинантного рецептора IL-6 собакоподобных обезьян (cIL-6R)

Олиго-ДНК-праймеры получали исходя из описанной последовательности генов для рецептора IL-6 макак-резусов (Birney et al., Ensembl 2006, Nucleic Acids Res. 2006 Jan 1; 34 (Database issue):D556-61). ДНК-фрагмент, имеющий полноразмерный ген рецептора IL-6 собакоподобных обезьян, получали с помощью ПЦР с использованием праймеров, а в качестве матрицы использовали кДНК, выделенную из поджелудочной железы собакоподобных обезьян. Полученный ДНК-фрагмент встраивали в экспрессионный вектор клеток млекопитающих, и с использованием этого вектора достигалась стабильная экспрессия указанного фрагмента в клеточной линии CHO (cyno.sIL-6R-продуцирующей клеточной линии CHO). Культуральную среду cyno.sIL-6R-продуцирующих клеток CHO очищали на колонке HisTrap (GE Healthcare Bioscience), а затем концентрировали с помощью адсорбента Amicon Ultra-15 Ultracel-10k (Millipore). Конечный очищенный образец растворимого рецептора IL-6 собакоподобных обезьян (называемого далее cIL-6R) получали после дополнительной очистки с помощью гель-фильтрации на колонке с Superdex200pg16/60 (GE Healthcare Bioscience).

Получение рекомбинантного IL-6 собакоподобных обезьян (cIL-6)

IL-6 собакоподобных обезьян получали методом, описанным ниже. Была получена нуклеотидная последовательность, кодирующая 212 аминокислот и депонированная в SWISSPROT рег. № P79341, а затем эту последовательность клонировали в экспрессионный вектор клеток млекопитающих. Полученный вектор вводили в клетки CHO в целях получения клеточной линии со стабильной экспрессией (cyno.IL-6R-продуцирующей клеточной линии CHO). Культуральную среду cyno.IL-6R-продуцирующих клеток CHO очищали на колонке с SP-сефарозой/FF (GE Healthcare Bioscience), а затем концентрировали с помощью адсорбента Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore). Конечный очищенный образец IL-6 собакоподобных обезьян (называемого далее cIL-6R) получали после дополнительной очистки с помощью гель-фильтрации на колонке с Superdex75pg26/60 (GE Healthcare Bioscience) с последующим концентрированием адсорбентом Amicon Ultra-15 Ultracel-5k (Millipore).

Получение известного высокоаффинного антитела против рецептора IL-6

Экспрессионный вектор клеток млекопитающих конструировали для экспрессии VQ8F11-21 hIgG1, известного высокоаффинного антитела против рецептора IL-6. VQ8F11-21 hIgG1 описано в заявке на патент США 2007/0280945 A1 (US 2007/0280945 A1; аминокислотные последовательности H-цепи и L-цепи представлены в SEQ ID NO: 77 и 78, соответственно). Вариабельную область антитела конструировали с помощью ПЦР с использованием комбинации синтетических олиго-ДНК (полученных путем ПЦР-сборки), и для константной области использовали IgG1. Вариабельные и константные области антитела объединяли путем ПЦР-сборки, а затем встраивали в экспрессионный вектор млекопитающих в целях конструирования экспрессионных векторов для представляющей интерес H-цепи и L-цепи. Нуклеотидные последовательности полученных экспрессионных векторов определяли методом, известным специалистам. Высокоаффинное антитело против рецептора IL-6 (далее называемое «контрольным антителом») экспрессировали и очищали с использованием сконструированных экспрессионных векторов методом, описанным в примере 1.

Получение, экспрессия и очистка вариантов тоцилизумаба

Варианты тоцилизумаба получали с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene) методом, описанным в прилагаемой к руководству инструкции. Полученные плазмидные фрагменты встраивали в экспрессионные векторы клеток млекопитающих в целях конструирования экспрессионных векторов для представляющих интерес H-цепей и L-цепей. Нуклеотидные последовательности полученных экспрессионных векторов определяли методом, известным специалистам. Антитела экспрессировали методом, описанным ниже. Клеточные линии HEK293H, происходящие от раковых клеток почек человеческого эмбриона (Invitrogen), суспендировали в среде DMEM (Invitrogen), в которую была добавлена 10% фетальная бычья сыворотка (Invitrogen). Клетки высевали в объеме 10 мл на чашку в чашки для адгезивных клеток (диаметром 10 см; CORNING) при плотности клеток 5-6×10⁵ клеток/мл и культивировали в CO₂-инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение одного дня и одной ночи. Затем среду удаляли отсасыванием и добавляли 6,9 мл среды CHO-S-SFM-II (Invitrogen). Полученную плазмиду вводили в клетки методом липофекции. Полученные супернатанты культуры собирали, центрифугировали (приблизительно 2000×g, 5 минут при комнатной температуре) для удаления клеток и стерилизовали путем фильтрации через 0,22-мкм фильтр MILLEX(R)-GV (Millipore) с получением супернатантов. Антитела очищали из полученных супернатантов культуры известным методом с использованием рекомбинантного белка А - сефарозы™ Fast Flow (Amersham Biosciences). Для определения концентрации очищенного антитела оптическую плотность измеряли при длине волны 280 нм с помощью спектрофотометра. Концентрации антитела определяли исходя из величин, вычисленных с использованием коэффициентов поглощения, измеренных методом PACE (Protein Science 1995; 4:2411-2423).

Получение клеточной линии BaF3, экспрессирующей человеческий gp130

Клеточную линию BaF3, экспрессирующую человеческий gp130, получали в соответствии с процедурой, описанной ниже, в результате чего была продуцирована клеточная линия, пролиферирующаяся в зависимости от IL-6.

Полноразмерную кДНК человеческого gp130 (Hibi et al., Cell (1990) 63:1149-1157 (GenBank #NM_002184)) амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в экспрессионный вектор pCOS2Zeo для конструирования pCOS2Zeo/gp130. pCOS2Zeo представляет собой экспрессионный вектор, сконструированный путем удаления области экспрессии гена DHFR из pCHOI (Hirata et al., FEBS Letter (1994) 356:244-248) и встраивания экспрессионной области гена резистентности к зеоцину. Полноразмерную кДНК человеческого IL-6R амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в pcDNA3.1(+) (Invitrogen) в целях конструирования hIL-6R/pcDNA3.1(+).

10 мкг pCOS2Zeo/gp130 смешивали с клетками BaF3 (0,8×10⁷ клеток), суспендированными в PBS, а затем подавали импульс 0,33 кВ и 950 мкФ с помощью устройства Gene Pulser (Bio-Rad). Клетки BaF3, имеющие ген, встроенный путем электропорации, культивировали в течение одного дня и одной ночи в среде RPMI 1640 (Invitrogen), в которую были добавлены 0,2 нг/мл мышиного интерлейкина-3 (Peprotech) и 10% фетальной бычьей сыворотки (далее обозначаемой FBS, HyClone), а затем отбирали путем добавления среды RPMI 1640, в которую были добавлены 100 нг/мл человеческого интерлейкина-6 (R&D systems) 100 нг/мл растворимого рецептора человеческого интерлейкина-6 (R&D systems), и 10% FBS, с получением клеточной линии BaF3, экспрессирующей человеческий gp130 (далее называемой «BaF3/gp130»). Эти клетки BaF/gp130 пролиферируются в присутствии человеческого интерлейкина-6 (R&D systems) и растворимого рецептора человеческого IL-6, а поэтому они могут быть использованы для оценки рост-ингибирующей активности (или активности, нейтрализующей рецептор IL-6) антитела против рецептора IL-6.

Оценка биологической активности с использованием клеток BaF3, экспрессирующих человеческий gp130 (BaF/gp130)

Активность, направленную на нейтрализацию рецептора IL-6, оценивали с использованием клеток BaF3/gp130, которые пролиферируются в зависимости от IL-6/рецептора IL-6. После трех промывок средой RPMI1640, в которую была добавлена 10% FBS, клетки BaF3/gp130 при плотности 5×10⁴ клеток/мл суспендировали в среде RPMI1640, в которую были добавлены 600 нг/мл или 60 нг/мл человеческого интерлейкина-6 (TORAY) (в конечной концентрации 300 нг/мл или 30 нг/мл), соответствующее количество растворимого человеческого рецептора IL-6 и 10% FBS. Клеточные суспензии распределяли (50 мкл/лунку) по 96-луночным планшетам (CORNING). Затем очищенные антитела разводили средой RPMI1640, содержащей 10% FBS, и добавляли в каждую лунку (50 мкл/лунку). Клетки культивировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ в течение трех дней. Реагент WST-8 (набор для подсчета клеток - 8; Dojindo Laboratories) двукратно разводили PBS. Затем в каждую лунку сразу добавляли 20 мкл указанного реагента и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм (эталонная длина волны: 620 нм) на устройстве SUNRISE CLASSIC (TECAN). После культивирования в течение двух часов снова измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм (эталонная длина волны: 620 нм). Активность, нейтрализующую рецептор IL-6, оценивали по изменению оптической плотности в течение двух часов в качестве индикатора.

Анализ Biacore на связывание с растворимым человеческим рецептором IL-6

Кинетику реакции «антиген-антитело» анализировали с помощью Biacore T100 (GE Healthcare). Взаимодействие антитела с растворимым человеческим рецептором IL-6 оценивали путем иммобилизации соответствующего количества белка А или белка A/G или анти-IgG F(ab')₂ (специфичного к γ-цепи) на сенсорном чипе методом связывания с амином, связывания представляющих интерес антител на чипе при pH 7,4 и анализа действия растворимого рецептора IL-6 в различных концентрациях при pH 7,4 на чипе в качестве аналита. Все измерения проводили при 37°C. Кинетические параметры, константы скорости ассоциации k_a (1/мс) и константы скорости диссоциации k_d (1/с) вычисляли по сенсограммам, построенным по результатам измерений. Затем, исходя из констант скоростей ассоциации и диссоциации, определяли K_D (M). Соответствующие параметры определяли с помощью компьютерной программы Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare).

Оценка pH-зависимой диссоциации из рецептора IL-6 мембранного типа с помощью Biacore

Мониторинг реакции «антиген-антитело» с рецептором IL-6 мембранного типа при pH 5,8 и pH 7,4 проводили с помощью Biacore T100 (GE Healthcare). Связывание с рецептором IL-6 мембранного типа анализировали путем оценки связывания растворимого человеческого рецептора IL-6, иммобилизованного на сенсорном чипе. SR344 подвергали биотинилированию методом, известным специалистам. Биотинилированный растворимый человеческий рецептор IL-6 иммобилизовали на сенсорном чипе посредством стрептавидина исходя из аффинности связывания биотина и стрептавидина. Все измерения проводили при 37°C. Буфер для подвижной фазы представлял собой 10 мМ MES (pH 5,8), 150 мМ NaCl и 0,05% твин 20. Клон, обнаруживающий рН-зависимое связывание, вводили при pH 7,4 для связывания с растворимым человеческим рецептором IL-6 (буфер для инжекции образца представлял собой 10 мМ MES (pH 7,4), 150 мМ NaCl и 0,05% твин 20). Затем проводили мониторинг рН-зависимой диссоциации каждого клона при pH 5,8, который соответствует рН подвижной фазы. Константу скорости диссоциации (K_d (1/с)) при pH 5,8 вычисляли с помощью программы Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare) путем построения кривой только для фазы диссоциации при pH 5,8. Концентрация образца составляла 0,25 мкг/мл. Связывание осуществляли в 10 мМ MES (pH 7,4), 150 мМ NaCl и 0,05% твине 20 а диссоциацию осуществляли в 10 мМ MES (pH 5,8), 150 мМ NaCl и 0,05% твине 20. Аналогичным образом, константу скорости диссоциации (K_d (1/с)) при pH 7,4 вычисляли с помощью программы Biacore T100 Evaluation Software (GE Healthcare) путем построения кривой только для фазы диссоциации при pH 7,4. Концентрация образца составляла 0,5 мкг/мл. Связывание осуществляли в 10 мМ MES (pH 7,4), 150 мМ NaCl и 0,05% твине 20, и диссоциацию также осуществляли в 10 мМ MES (pH 7,4), 150 мМ NaCl и 0,05% твине 20.

Оценка связывания с человеческим FcRn

FcRn представляет собой комплекс FcRn и β2-микроглобулина. Олиго-ДНК-праймеры получали исходя из описанной последовательности человеческого гена FcRn (J. Exp. Med. (1994) 180(6):2377-2381). ДНК-фрагмент, соответствующий полноразмерному гену, получали с помощью ПЦР с использованием человеческой кДНК (Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech) в качестве матрицы и с использованием полученных праймеров. С использованием полученного ДНК-фрагмента в качестве матрицы этот ДНК-фрагмент, кодирующий внеклеточный домен, содержащий сигнальную область (Met1-Leu290), амплифицировали с помощью ПЦР и встраивали в экспрессионный вектор клеток млекопитающих (аминокислотная последовательность человеческого FcRn представлена в SEQ ID NO: 79). Аналогичным образом, олиго-ДНК-праймеры получали исходя из описанной последовательности гена человеческого β2-микроглобулина (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2002) 99(26):16899-16903). ДНК-фрагмент, соответствующий полноразмерному гену, получали с помощью ПЦР с использованием человеческой кДНК (Hu-Placenta Marathon-Ready cDNA, CLONTECH) в качестве матрицы и с использованием полученных праймеров. С использованием полученного ДНК-фрагмента в качестве матрицы этот ДНК-фрагмент, кодирующий полноразмерный β2-микроглобулин, содержащий сигнальную область (Met1-Met119), амплифицировали с помощью ПЦР и встраивали в экспрессионный вектор клеток млекопитающих (аминокислотная последовательность человеческого β2-микроглобулина представлена в SEQ ID NO: 80).

Растворимый человеческий FcRn экспрессировали в соответствии с нижеследующей процедурой. Плазмиды, сконструированные для человеческого FcRn и β2-микроглобулина, вводили путем липофекции в клетки клеточной линии HEK293H, происходящей от раковых клеток почек человеческого эмбриона (Invitrogen), с использованием 10% FBS (Invitrogen). Полученный супернатант культуры собирали, и FcRn очищали с использованием IgG-сефарозы 6 Fast Flow (Amersham Biosciences) методом, описанным в J. Immunol. 2002 Nov 1; 169(9):5171-80, а затем снова очищали на колонке HiTrap Q HP (GE Healthcare).

Определение концентрации антитела в плазме мышей

Концентрации антител в плазме мышей определяли с помощью ELISA методом, известным специалистам.

ФК/ФД-тест для определения концентрации антитела, концентрации CRP и свободного растворимого рецептора IL-6 в плазме обезьян

Концентрации антител в плазме собакоподобных обезьян определяли с помощью ELISA методом, известным специалистам.

Концентрацию CRP определяли на автоматизированном анализаторе (TBA-120FR; Toshiba Medical Systems Co.) с использованием Cias R CRP (KANTO CHEMICAL CO., INC.).

Концентрацию свободного растворимого рецептора IL-6 в плазме собакоподобных обезьян определяли методом, описанном ниже. Все антитела типа IgG (IgG собакоподобных обезьян, антитело против человеческого рецептора IL-6 и комплекс «антитело против человеческого рецептора IL-6-растворимый рецептор IL-6 собакоподобных обезьян») в плазме адсорбировали на белке А путем загрузки 30 мкл плазмы собакоподобных обезьян на соответствующее количество смолы, а именно рекомбинантного белка А-сефарозы Fast Flow (GE Healthcare), осушенной в 0,22-мкл фильтре с колпачком (Millipore). Затем раствор, находящийся в фильтре с колпачком, центрифугировали на высокоскоростной центрифуге для сбора раствора, проходящего через центрифугу. Пропущенный раствор не содержал комплекса «связанное с белком А антитело против человеческого рецептора IL-6-растворимый рецептор IL-6 собакоподобных обезьян». Поэтому концентрация свободного растворимого рецептора IL-6 может быть определена путем измерения концентрации растворимого рецептора IL-6 собакоподобных обезьян в растворе, проходящем через белок А. Концентрацию растворимого рецептора IL-6 собакоподобных обезьян определяли известным методом измерения концентраций растворимого человеческого рецептора IL-6. В качестве стандарта использовали растворимый рецептор IL-6 собакоподобных обезьян (cIL-6R), полученный, как описано выше. Процентное содержание свободного растворимого рецептора IL-6 вычисляли по следующей формуле:

Концентрация свободного растворимого рецептора IL-6 после введения антитела

----------------------------------------------------------------------------- ×100

Концентрация растворимого рецептора IL-6 до введения антитела

Настоящее изобретение относится к области иммунологии и биотехнологии. Предложенье антитело к рецептору IL-6, кодирующий его ген, вектор и клетка-хозяин для получения антитела, способ продуцирования антитела и фармацевтическая композиция для лечения связанного с IL-6 заболевания, содержащая антитело. Использование изобретения обеспечивает новые гуманизированные антитела к рецептору IL-6, что может найти дальнейшее применение в терапии IL-6-опосредованных заболеваний. 8 н.п. ф-лы, 22 ил., 8 табл.

1. Любое антитело к рецептору IL-6, выбранное из:
(a) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO:1 (CDR1 VH4-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO:2 (CDR2 VH4-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO:3 (CDR3 VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO:10 (CDR1 VL1), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO: 11 (CDR2 VL1), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO:12 (CDR3 VL1);
(b) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO:4 (CDR1 VH3-M73), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO:5 (CDR2 VH3-M73), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO:6 (CDR3 VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO:13 (CDR1 VL3), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO:14 (CDR2 VL3), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO:15 (CDR3 VL3); и
(c) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO:7 (CDR1 VH5-M83), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO:8 (CDR2 VH5-M83), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO:9 (CDR3 VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи,
включающую CDR1, содержащую последовательность SEQ ID NO:16 (CDR1 VL5), CDR2, содержащую последовательность SEQ ID NO:17 (CDR2 VL5), и CDR3, содержащую последовательность SEQ ID NO:18 (CDR3 VL5).

2. Любое антитело к рецептору IL-6, выбранное из:
(a) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO:19 (вариабельную область VH4-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO:22 (вариабельную область VL1);
(b) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO:20 (вариабельную область VH3-M73), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO:23 (вариабельную область VL3); и
(c) антитела, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO:21 (вариабельную область VH5-M83), и вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность SEQ ID NO:24 (вариабельную область VL5).

3. Любое антитело к рецептору IL-6, выбранное из:
(a) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO:25 (VH4-M73), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO:28 (VL1);
(b) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO:26 (VH3-M73), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO:29 (VL3); и
(c) антитела, которое содержит тяжелую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO:27 (VH5-M83), и легкую цепь, включающую последовательность SEQ ID NO:30 (VL5).

4. Ген, кодирующий антитело к рецептору IL-6 по любому из пп.1-3.

5. Вектор для получения антитела к рецептору IL-6, несущий ген по п.4.

6. Клетка-хозяин для получения антитела к рецептору IL-6, несущая вектор по п.5, где клетка-хозяин представляет собой клетку E.coli или клетку животного.

7. Способ продуцирования антитела к рецептору IL-6 по любому из пп.1-3, который включает стадии (а) культивирования клетки-хозяина по п.6 и (b) получения антитела из клетки-хозяина или вне клетки.

8. Фармацевтическая композиция для лечения связанного с IL-6 заболевания, содержащая в качестве активного ингредиента эффективное количество антитела к рецептору IL-6 по любому из пп.1-3 или антитела к рецептору IL-6, полученного способом по п.7.