СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ОРИЕНТИРОВАННЫХ ПРИРОДНЫХ ПУРПУРНЫХ МЕМБРАН ГАЛОБАКТЕРИЙ НА ВНУТРЕННЕЙ ПОВЕРХНОСТИ ПРОЗРАЧНОЙ ПОРИСТОЙ ПОДЛОЖКИ ТРУБЧАТОЙ ФОРМЫ И ФОРМИРОВАНИЕ МНОГОСЛОЙНЫХ ПАКЕТОВ ФОТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ БИОСТРУКТУР Российский патент 2011 года по МПК C12N11/00 B82B3/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, электроники, альтернативной энергетики, нанобиофотоники и направлено на создание технологически простого и экономичного способа получения многослойных пакетов светочувствительных ориентированных природных пурпурных мембран (ОППМ) галобактерий с высоким содержанием бактериородопсина. Многослойные пакеты ориентированных природных пурпурных мембран могут быть использованы в различных фотоэлектронных устройствах, моделирующих природную организацию ориентированных светочувствительных мембран сетчатки глаза, в фотосенсорах, в фотоэлектрических преобразователях и генераторах водорода.

Пурпурные мембраны галобактерий (ПМ) - древнейшая на Земле фотобиосистема, обеспечивающая энергетические потребности живых клеток. Ключевым функциональным элементом ПМ является семиспиральный трансмембранный ретиналь-содержащий белок - бактериородопсин (БР). Под действием света (поглощая энергию фотона) БР способен осуществлять серию реакций, приводящую к переносу одного протона от Шиффова основания ретиналя во внеклеточное пространство, а второго протона - с внутренней поверхности ПМ на Шиффово основание. Образующийся в ходе ориентированного переноса протонов трансмембранный потенциал используется клетками для биосинтеза молекул АТФ.

Пурпурные мембраны галобактерий формируются по мере биосинтеза отдельных молекул БР и их встраивания в липидный бислой клеточной мембраны. Отдельные молекулы БР путем самосборки формируют тримеры, имеющие форму скругленной шестигранной призмы диаметром 6,2 нанометров. Тримеры молекул БР образуют на поверхности клеток галобактерий плотную квазикристаллическую решетку. Многочисленные и разноплановые исследования как БР, так и ПМ в целом позволили к настоящему времени достаточно точно установить детали и механизмы функционирования галобактериальной системы фиксации энергии солнечного света.

Фотобиосистемы на основе семиспиральных трансмембранных ретиналь-содержащих белков (и, в частности, бактериородопсина) являются древнейшими на Земле. По уровню эффективности связывания солнечной энергии эти системы несколько уступают более поздним (в эволюционном плане) системам фотосинтеза - фиксации энергии солнечного света с помощью хлорофиллсодержащих комплексов. Однако высочайшая чувствительность к малым потокам фотонов позволила закрепиться фотобиосистемам на основе семиспиральных трансмембранных ретиналь-содержащих белков в качестве фотосенсорных структур во многих классах живых организмов (от бактерий и грибов до высших растений и человека).

Фотобиосистемы на основе семиспиральных трансмембранных ретиналь-содержащих белков обеспечивают цветное зрение высших приматов и человека. В палочковидных клетках сетчатки глаза ретиналь-содержащие белки собраны в виде пакетов плотно упакованных ориентированных светочувствительных мембран - функционально родственных пурпурным мембранам галобактерий. Формирование светочувствительных мембран сетчатки глаза происходит в процессе синтеза зрительного родопсина. Как и в пурпурных мембранах галобактерий, этот белок способен осуществлять светозависимый трансмембранный перенос протонов (Н⁺) в сторону N-конца белка, что сопровождается формированием мембранного протонного потенциала. В отличие от галобактериальных клеток светочувствительные участки мембран клеток сетчатки глаза имеют огромное количество складчатых структур, что резко повышает внутриклеточное содержание семиспиральных трансмембранных ретиналь-содержащих белков. Многослойность светочувствительных структур позволяет также увеличить размеры эффективной зоны восприятия фотонов для повышения общей эффективности работы фотобиосистемы сетчатки, что позволяет человеческому глазу фиксировать сверхмалую освещенность.

С момента обнаружения у галобактерий фотозависимой протон-транспортной биосистемы начались попытки практического использования уникальных свойств как БР, так и ПМ в целом. Известен метод выделения ПМ и БР в чистом виде, предложенный Д. Остерхельтом в 1974 году. В результате применения данного классического метода получаются препараты, содержащие ПМ в виде плотного белково-липидного осадка, где компоненты пурпурных мембран хаотично перемешаны. Однако разнонаправленная ориентация молекул БР даже при высокой их концентрации является принципиальным недостатком данного способа, поскольку является труднопреодолимым препятствием для получения ориентированных монослоев БР, то есть для восстановления природной структурной и пространственной организации ПМ. Известны подходы иммобилизации ПМ на плоских подложках для восстановления природной ориентированности и регенерации их функциональности. Описано получение липосомальных структур с ориентированными фрагментами ПМ. Однако до настоящего времени отсутствуют данные о получении многослойных пакетов ориентированных природных пурпурных мембран, моделирующих природную организацию ориентированных светочувствительных мембран сетчатки глаза.

В качестве прототипа выбран патент США [Dyukova T.V., Vsevolodov N.N. Photochromic compositions and materials containing bacteriorhodopsin. US Patent, 5,518,858, 1996].

Существенные отличия предлагаемого способа в сравнении с прототипом следующие.

1. Пурпурные мембраны галобактерий иммобилизуют на внутренней поверхности трубчатой подложки, изготовленной из прозрачного пористого материала. Такая форма подложки позволяет замкнуть ориентированные ПМ, то есть надежно разобщить процессы, происходящие по разные стороны мембраны, подобно тому как это устроено в живых клетках. При этом для ПМ сохраняется возможность осуществлять транспорт протонов (Н⁺) в сторону N-конца бактериородопсина, что сопровождается формированием мембранного протонного потенциала.

- В прототипе: иммобилизация пурпурных мембран осуществляется на плоской поверхности.

2. Пурпурные мембраны, иммобилизованные на внутренней поверхности трубчатой подложки, могут быть уложены в многослойные пакеты строго упорядоченных светочувствительных мембран, моделирующих природную организацию ориентированных светочувствительных мембран сетчатки глаза.

- В прототипе: иммобилизация пурпурных мембран осуществляется в виде монослоя. Создание многослойных светочувствительных структур из монослойных пурпурных мембран трудоемко и не дает надежных результатов.

3. Площадь пурпурных мембран, иммобилизованных на внутренней поверхности трубчатой подложки, может быть сколь угодно большой, поскольку ограничена только линейными параметрами подложки.

- В прототипе: существуют ограничения площади, связанные с размерами оборудования для ориентированного осаждения фрагментов ПМ на плоские носители.

Существенные преимущества предложенного способа в сравнении с прототипом следующие:

способ позволяет замкнуть ориентированные пурпурные мембраны, то есть надежно разобщить процессы, происходящие по разные стороны мембраны;

способ позволяет использовать в качестве подложки селективные мембраны для разделения мелких и крупных молекул или молекулярных групп;

способ позволяет легко превращать пурпурные мембраны галобактерий, иммобилизованные на внутренней поверхности трубчатой подложки, изготовленной из прозрачного пористого материала, в многослойные пакеты строго упорядоченных светочувствительных мембран, моделирующих природную организацию ориентированных светочувствительных мембран сетчатки глаза;

способ позволяет получать иммобилизованные ориентированные пурпурные мембраны сколь угодно большой площади.

Задачей изобретения является получение многослойных пакетов строго упорядоченных светочувствительных мембран, моделирующих природную организацию ориентированных светочувствительных мембран сетчатки глаза.

Способ отличается тем, что монослои ориентированных природных ПМ галобактерий иммобилизировали на внутренней поверхности трубчатой подложки, изготовленной из прозрачного пористого материала. Трубчатая форма подложки позволяет получать замкнутые ориентированные ПМ, то есть надежно разобщить фотохимические процессы, происходящие по разные стороны подложки.

Способ позволяет изготовлять многослойные пакеты строго упорядоченных ориентированных природных ПМ, моделирующих природную организацию ориентированных светочувствительных мембран сетчатки глаза.

Сущность предложенного способа заключается в получении монослоев ПМ галобактерий, иммобилизованных на внутренней поверхности прозрачной пористой трубчатой подложки. При иммобилизации молекул бактериородопсина в природной ориентации осуществляется транспорт протонов (Н⁺) (в направлении N-конца бактериородопсина) вовне из внутренней полости трубчатой подложки (фиг.2). При противоположной ориентации пурпурных мембран транспорт протонов (Н⁺) направлен внутрь полости трубчатой подложки.

Осуществление изобретения

1. Внутреннюю поверхность прозрачной пористой подложки трубчатой формы (например, диализного мешка) обработать любым бифункциональным сшивающим реагентом, обеспечивающим условия для фиксации ПМ галобактерий, достаточно прочной для осуществления последующих этапов. Поскольку сохранение жизнеспособности клеток галобактерий не требуется, прочность фиксации может быть достигнута применением достаточно жестких условий и реагентов.

2. У трубчатой подложки заблокировать нижнее отверстие. Через верхнее отверстие трубку заполнить суспензией клеток галобактерий или суспензией ПМ (фиг.1.1).

3. После экспозиции, достаточной, чтобы обеспечить надежную фиксацию ПМ на внутренней стороне пористой трубчатой подложки, подложку тщательно промыть для удаления неиммобилизованных фрагментов.

4. При необходимости провести дополнительную фиксацию на внутренней поверхности подложки иммобилизованных фрагментов ПМ галобактерий.

5. Открыть нижнее отверстие трубчатой подложки (фиг.1.2).

6. Трубчатую подложку, изготовленную из прозрачного пористого материала и несущую на внутренней поверхности ориентированные ПМ, сложить в многослойные пакеты (фиг.1.3). Число плоских лучевых складок (фиг.2.4) определяет количество получаемых слоев в пакетах строго упорядоченных светочувствительных пурпурных мембран.

7. Способ предполагает возможность реализации любого из двух вариантов ориентации иммобилизованных ПМ галобактерий относительно трубчатой пористой подложки. Иммобилизация на носителе в природной ориентации достигается посредством фиксации внешней стороны ПМ, на которой расположен N-концевой участок БР (фиг.2). При иммобилизации посредством цитоплазматической стороны ПМ транспорт протонов имеет направление внутрь трубчатой пористой подложки.

8. В процессе получения многослойного пакета строго упорядоченных светочувствительных мембран в полость пакета через торцевые отверстия трубчатой подложки могут быть введены электроды или капилляры.

9. Полученные многослойные пакеты ориентированных ПМ галобактерий помещают для хранения в условия, препятствующие изменению их функциональной фотоактивности.

ПРИМЕР 1.

Промытый стерильным дистиллятом диализный мешок заблокировать с одного конца любым способом. Расположить диализный мешок вертикально и провести обработку внутренней поверхности, необходимую для иммобилизации ПМ, любым бифункциональным сшивающим реагентом. Заполнить внутренний объем диализного мешка суспензией клеток галобактерий или суспензией ПМ. После истечения времени, необходимого для осуществления достаточной фиксации ПМ на внутренней поверхности подложки, удалить неиммобилизированные фрагменты и разблокировать трубчатую подложку. При необходимости провести промывку и дополнительную фиксацию ориентированных ПМ галобактерий.

ПРИМЕР 2.

Чтобы превратить трубчатую подложку, изготовленную из прозрачного пористого материала с иммобилизированными на внутренней поверхности ПМ галобактерий, в многослойный пакет строго упорядоченных светочувствительных мембран, необходимо сформировать несколько плоских лучевых складок. Полученные складки сложить параллельно одна на одну в плоские структуры.

ПРИМЕР 3.

Перед формированием лучевых складок для получения многослойного пакета строго упорядоченных светочувствительных мембран через торцевые отверстия трубчатой подложки можно ввести в полость пакета электроды или капилляры.

Краткое описание чертежей.

Фиг.1.

Последовательность операций по получению пурпурных мембран, иммобилизованных на внутренней стороне прозрачной пористой подложки трубчатой формы.

А. Заполнение полости трубчатой подложки суспензией клеток галобактерий или пурпурных мембран через верхний открытый конец (1) при заблокированном нижнем отверстии (2).

Б. Вид трубчатой подложки с имммобилизованными пурпурными мембранами после удаления суспензии неиммобилизованных мембран.

В. Схема складывания трубчатого носителя для получения многослойного (в данном случае - десятислойного) пакета ориентированных пурпурных мембран. Представлена стадия, когда трубчатая подложка сложена в структуру, имеющую пять плоских лучевых складок.

Фиг.2.

Представлен вариант иммобилизации ориентированных пурпурных мембран на внутренней поверхности трубчатой пористой подложки (в поперечном разрезе) после формирования десятислойного пакета пурпурных мембран, состоящего из пяти плоских лучей (4) двухслойных пурпурных мембран.

Показана иммобилизация пурпурных мембран на трубчатой подложке (5) в природной ориентации - посредством внешней стороны бактериородопсина (6), с расположенным на ней N-концом полипептидной цепи. При данной (природной) ориентации пурпурных мембран относительно пористой подложки транспорт протонов (H⁺) имеет направление в сторону N-конца бактериородопсина. Между молекулами липидных бислоев пурпурных мембран (8) образуется внутреннее пространство полого трубчатого носителя (7), доступное для введения электродов или капилляров.

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины, электроники, альтернативной энергетики, нанобиофотоники и направлено на создание технологически простого и экономичного способа получения многослойных пакетов светочувствительных ориентированных природных пурпурных мембран галобактерий с высоким содержанием бактериородопсина. Многослойные пакеты ориентированных природных пурпурных мембран могут быть использованы в различных фотоэлектронных устройствах, моделирующих природную организацию ориентированных светочувствительных мембран сетчатки глаза, в фотосенсорах, в фотоэлектрических преобразователях, в генераторах водорода. Пурпурные мембраны иммобилизуются на внутренней поверхности прозрачной пористой подложки трубчатой формы. Трубчатая форма подложки позволяет замкнуть ориентированные пурпурные мембраны и, таким образом, надежно разобщить фотохимические процессы, происходящие по разные стороны мембраны. Торцевые отверстия трубчатой подложки позволяют вводить в полость пакета, покрытую изнутри ориентированными пурпурными мембранами, электроды или капилляры. 3 з.п. ф-лы, 2 ил.

1. Способ иммобилизации ориентированных природных пурпурных мембран галобактерий, характеризующийся тем, что он предусматривает использование трубчатой подложки, выполненной из прозрачного пористого материала, блокирование одного из концов вертикально расположенной трубчатой подложки, обработку внутренней поверхности трубчатой подложки для обеспечения условий прочной фиксации пурпурных мембран галобактерий на указанной поверхности, заполнение внутреннего объема трубчатой подложки суспензией клеток галобактерий или суспензией пурпурных мембран и, по истечении времени, достаточного для фиксации пурпурных мембран на внутренней поверхности трубчатой подложки, удаление неиммобилизованных фрагментов и разблокирование конца трубчатой подложки.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что трубчатая подложка выполнена из селективной мембраны, позволяющей разделять мелкие и крупные молекулы или молекулярные группы.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что трубчатую подложку с иммобилизованными пурпурными мембранами галобактерий складывают в многослойные пакеты путем формирования плоских лучевых складок и накладывания их параллельно одна на другую.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что перед формированием плоских лучевых складок через торцевые отверстия трубчатой подложки в ее полость вводят электроды или капилляры.