ШТАММ БАКТЕРИЙ HALOBACTERIUM SALINARUM - ПРОДУЦЕНТ БАКТЕРИОРОДОПСИНА Российский патент 2008 года по МПК C12N1/20 C07K14/215 C12P1/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, микробиологии и биотехнологии, а именно к производству физиологически активных соединений, и касается получения белка, бактериородопсина путем микробиологического синтеза.

Область возможного применения бактериородопсина поразительна по своему разнообразию. Она включает двухстороннюю топографическую память, ультрабыстрое оперативное запоминающее устройство, пространственную модуляцию света, нелинейные оптические фильтры, распознавательные системы, высококонтрастные дисплеи, оптические переключатели и пикосекундные детекторы. Бактериородопсин находит применение в производстве материалов, которые предохраняют ценные бумаги от подделок, а также в качестве антиоксиданта в медицине, фармацевтике, косметологии и сельском хозяйстве в качестве стимулятора роста растений [1].

Самым изученным и приближенным к практическому использованию является бактериородопсин - ретинальсодержащий трансмембранный белок пурпурных мембран галофильных бактерий рода Halobacterium. [2].

Известен штамм Halobacterium halobium ЦМПМ В-1739, способный синтезировать бактериородопсин в количестве до 52 мг/л (2,5 мкмоль/л) культуральной жидкости [3].

Среди штаммов Halobacterium salinarum наиболее широко изучается штамм D96N (ВКПМ В-9026) [5-13]. Он синтезирует бактериородопсин в количестве до 47 мг/л (2,3 мкмоль/л) культуральной жидкости и выбран в качестве ближайшего аналога [4].

Задача заявляемого изобретения - получить штамм Halobacterium salinarum с повышенным уровнем синтеза бактериородопсина.

Задача решена путем получения штамма бактерий Halobacterium salinarum ST 1, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) как Halobacterium salinarum ВКПМ В-9451 и способного синтезировать бактериородопсин в количестве 50-112 мг/л культуральной жидкости. Заявляемый штамм получен путем многоступенчатой селекции штамма галофильных бактерий Halobacterium salinarum ВКПМ В-9025, без предварительной обработки химическими реагентами.

Штамм ВКПМ В-9451 имеет следующие характеристики:

Культурально-морфологические признаки.

Величина клеток трехсуточной культуры 2-5×0,5-0,9 мкм, одиночные палочки, иногда объединены по 2-3 палочки.

Подвижен, максимум подвижности на 4 сутки роста. Спор не образует, газовых вакуолей не содержит.

Колонии полупрозрачные, гладкие с гладким краем, темно-красного цвета, в среду не врастают, легко снимаются петлей. Культура является экстремальным галофилом - требует присутствия в среде 25% NaCl. При содержании хлористого натрия ниже 20% клетки теряют свою окраску, а при попадании в среду с содержанием NaCl менее 15% клетки очень быстро лизируются.

Хорошо растет при 36-40°С, в солевой жидкой среде, имеющей состав (мас.%): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, KCl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, CaCl₂ - 0,02, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,4. а также солевой агаризованной среде, имеющей состав (мас.%): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, KCl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, CaCl₂ - 0,02, агар - 1,5, вода - остальное, рН среды 7,2-7,4.

Отношение к температуре: хорошо растет при 36-40°С, оптимальная температура 38°С.

Отношение к рН среды: хорошо растет при 7,2-7,4, оптимум рН 7,3.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный аэроб, прототроф, сахарозу, мальтозу, лактозу, фруктозу не подкисляет, не растет на картофеле. Желатину не разжижает. Антагонистических свойств не обнаружено.

Как и все представители рода Halobacterium заявляемый штамм непатогенен и может быть отнесен к группе безопасности №1 (на основании заключения Коллекции АТСС). Работа с ним не требует специальных мер предосторожности.

Не является генетически модифицированным штаммом.

Хранение штамма: Хорошо хранится на агаризованной среде в бакпечатках и на косяках в условиях холодильника в течение года. Для длительного хранения штамма используется лиофилизация свежей биомассы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-9451 при выращивании в колбах.

Заявляемый штамм ВКПМ В-9451, а также используемые в качестве контрольных штаммы ВКПМ В-9025, ВКПМ В-9026 и ЦМПМ В-1739 выращивали в колбах емкостью 750 мл в объеме среды выращивания 300 мл при освещении люминесцентными лампами дневного света (L 18 W/530, «Osram», Germany) до стационарной стадии роста (6 суток) на круговой качалке при 37°С и встряхивании 100 об/мин. Для выращивания использовали среду следующего состава (мас.%): пептон - 1, дрожжевой экстракт - 0,5, NaCl - 25, MgSO₄ - 2, KCl - 0,2, цитрат натрия - 0,3, глицерин - 0,1, CaCl₂ - 0,02, вода - остальное, рН среды - 7,2-7,4.

Осадок отделяли центрифугированием при 7000 g 10 мин и взвешивали полученную биомассу.

Затем к осадку приливали дистиллированную воду в количестве, равном объему среды выращивания, и инкубировали при встряхивании в условиях комнатной температуры в течение 3 часов.

Осадок отделяли центрифугированием, супернатант использовали для определения количества бактериородопсина при длине волны 570 нм. Концентрацию бактериородопсина определяли по следующей формуле:

,

где:

D - оптическая плотность раствора при длине волны 570 нм;

М_r - молекулярная масса бактериородопсина (26700);

V_p-pa - общий объем раствора бактериородопсина;

V_кюв - объем раствора бактериородопсина в спектрофотометрической кювете;

Е_бр - коэффициент молярного поглощения бактериородопсина (63000 М^-1см^-1);

V_пробы - объем пробы бактериородопсина в спектрофотометрической кювете.

Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1.Исследуемые штаммы.Вес биомассы (г/л)Концентрация бактериородопсина (мг/л)ВКПМ В-94511650ВКПМ В-9025618ВКПМ В-9026322ЦМПМ В-1739930

Из приведенных в таблице 1 результатов видно, что заявляемый штамм ВКПМ В-9451 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9025, ближайший аналог ВКПМ В-9026 и контрольный ЦМПМ В-1739 как по количеству биомассы, так и по концентрации бактериородопсина в культуральной среде.

ПРИМЕР 2. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-9451 при выращивании в плоской кювете.

Штамм ВКПМ В-9451 и контрольные штаммы ВКПМ В-9025, ВКПМ В-9026 и ЦМПМ В-173 9 выращивали в плоских кюветах объемом 15 л с заполнением 10 л при освещении люминесцентными лампами дневного света, непрерывной подачи воздуха в кюветы (скорость подачи воздуха 1,5 л/мин) для аэрации и перемешивания до стационарной стадии роста в среде выращивания как в примере 1.

Далее осадок отделяли центрифугированием при 7000 g 10 мин и к осадку приливали дистиллированную воду в количестве, равном объему среды выращивания, инкубировали и определяли содержание бактериородопсина как в примере 1.

Данные, представленные в таблице 2, позволяют сделать вывод, что и при выращивании в плоских кюветах заявляемый штамм ВКПМ В-9451 значительно превосходит родительский штамм ВКПМ В-9025, ближайший аналог ВКПМ В-9026 и контрольный ЦМПМ В-173 9 по концентрации бактериородопсина в культуральной среде и биомассе выращенной культуры.

Таблица 2.Исследуемые штаммы.Вес биомассы (г/л)Концентрация бактериородопсина (мг/л)ВКПМ В-94512888ВКПМ В-90251132ВКПМ В-90261546ЦМПМ В-17391755

ПРИМЕР 3. Продуктивность штамма Halobacterium salinarum ВКПМ В-9451 при выращивании в ферментере.

Заявляемый штамм ВКПМ В-9451, контрольные (исходный, сравнения и прототип) штаммы ВКПМ В-9025, ВКПМ В-9026 и ЦМПМ В-1739 выращивали в в ферментере Anglicon (Anglicon, USA) в объеме среды выращивания 1500 мл. В качестве среды выращивания использовали среду как в примере 1. В ферментере поддерживали постоянную температуру 37°С, перемешивание: первые 24 часа 400 об/мин, на вторые сутки 600 об/мин, на 3 сутки 800 об/мин, на 7 сутки 1000 об/мин. Аэрация во время ферментации - 0,75 л/л·мин. Исследуемые штаммы выращивали до стационарной стадии роста. Далее определяли вес биомассы и содержание бактериородопсина в среде выращивания как в примере 1. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3.Исследуемые штаммы.Вес биомассы (г/л)Концентрация бактериородопсина (мг/л)ВКПМ В-945135112ВКПМ В-90252050ВКПМ В-90261264ЦМПМ В-17392570

Как следует из результатов, приведенных в таблицах 1, 2 и 3, заявляемый штамм ВКПМ В-9451 значительно превосходит ближайший аналог, так и другие, выбранные в качестве контролей штаммы, по количеству синтезируемого при различных условиях культивирования бактериородопсина и биомассы.

Источники информации

1. Заявка на патент РФ №2005129525 от 23 сентября 2005 года.

2. Rosa Margesin, Franz Schinner, Extremophiles, 5, (2001), pp.73-83.

3. Патент РФ №770184.

4. Миронова Е.В. «Биосинтетическое получение аналогов бактериородопсина». Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук, Москва, 2002.

5. Патент USA №16616964.

6. Miller A., Oesterhelt D., BBA, 1020 (1990), p.57-64.

7. Otto H., Marti Т., Holz M., Mogi Т., Lindau M., Khorana H.G. and Heyn M.P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86 (1989), p.9228-9232.

8. Thorgeirsson Т.Е., Milder S.J., Milreke L.J.W., Betlach M.C., Shand R.F., Stroud R.M. and Kliger D.S., Biochemistry, 30 (1991), p.9133-9142.

9. Патент USA №4927180.

10. Патент USA №5518858.

11. Патент USA №5807625.

12. Патент USA №5872648.

13. Патент USA №5920058.

Штамм бактерий Halobacterium salinarum ВПКМ В-9451 выделен путем многоступенчатой селекции штамма бактерий Halobacterium salinarum ВПКМ В-9025. Штамм характеризуется повышенным уровнем синтеза бактериородопсина. Синтез бактериородопсина составляет 50-112 мг/л в культуральной жидкости. 3 табл.

Штамм бактерий Halobacterium salinarum ВПКМ В-9451 - продуцент бактериородопсина.