СПОСОБ ОЦЕНКИ ПОЧЕЧНОЙ ВЫЖИВАЕМОСТИ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТОМ НА ОСНОВЕ ДАННЫХ О ПОЛИМОРФИЗМЕ ГЕНОВ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/574 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования течения хронического гломерулонефрита на протяжении всей жизни человека.

Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов интерлейкинов - это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции интерлейкинов, что может влиять на развитие хронического воспалительного процесса

В ряду паренхиматозных заболеваний почек гломерулонефрит занимает доминирующее место. Среди нефрологических заболеваний хронический гломерулонефрит (ХГН) составляет более 35% [1]. Очевидно, что это самый частый вид патологического процесса, который является одной из распространенных причин хронической почечной недостаточности, для лечения которой необходимы гемодиализ и пересадка почки [2]. Распространенность и заболеваемость терминальными стадиями хронической болезни почек неуклонно увеличивается в разных регионах мира [3]. Если в США в конце XX века более 340000 человек были включены в программы диализа или трансплантации почки, то уже к 2010 году ожидается значительное увеличение числа таких пациентов, которое может достигнуть 560000 человек [4].

Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в развитии ХГН играют интерлейкины и факторы роста [8]. Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам ХГН, в России немногочисленны и затрагивают в основном спектр генов вазоактивных гормонов [9], интегральных мембранных белков и некоторых интерлейкинов [6]. Исследования роли полиморфных маркеров ряда генов интерлейкинов в отношении ХГН до сих пор не проведены.

Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен способ оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом.

Задачей настоящего исследования является разработка способа оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом на основе данных о полиморфизме генов интерлейкинов.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки течения хронического гломерулонефрита, позволяющих в кратчайшие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом на основе анализа полиморфизма генов интерлейкинов, заключающийся в выделении ДНК из периферической венозной крови, по результатам которого делают вывод о снижении почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом в случае выявления:

- носительства аллеля -889С гена интерлейкина 1А -889С/T IL-1A;

- аллеля -592А гена интерлейкина 10 -592С/A IL-10;

- носительства аллеля -511Т гена интерлейкина 1В -511 С/Т IL-1B в сочетании с нефротическим синдромом на момент первого обследования и наличия артериальной гипертензии в течение ХГН;

- генотипа 4R/4R гена антагониста рецептора интерлейкина 1 VNTR IL-1Ra.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известна возможность определения особенностей течения хронического гломерулонефрита по наличию указанных выше аллелей и генотипов генов интерлейкинов.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов. На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С. Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров. Полимеразная цепная реакция (ПНР) синтеза полиморфных локусов интерлейкина 1А -889С/Т IL-1A, интерлейкина 1В -511 С/Т IL-1B, антагониста рецептора интерлейкина 1 VNTR IL-1Ra, интерлейкина 10 -592С/А IL-10 выполняется в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (рН=8,8), 1,25 мМ MgCl₂, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. Температурные режимы ПЦР и последовательности праймеров представлены в таблице 1. Амплификат, наработанный при ПЦР полиморфных локусов генов интерлейкинов, подвергают рестрикции (ПДРФ-анализ) путем добавления к 12,5 мкл амплификата 5 ед. активности рестриктазы и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 16 часов. Причем для анализа полиморфизма гена интерлейкина 1B -511C/T IL-1B используют эндонуклеазу рестрикции Ava I “СибЭнзим”, для анализа полиморфизма гена интерлейкина 1А -889С/Т IL-1A используют эндонуклеазу рестрикции Bsp 19I “СибЭнзим”, для анализа полиморфизма гена интерлейкина 10 -592С/A IL-10 используют эндонуклеазу рестрикции RsaI “СибЭнзим”.

Продукты ПДРФ-анализа оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ-буфера, окрашенном раствором бромистого этидия (0,01%). В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Визуализация фореграмм осуществляется в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция). Фрагменты длиной 304 п.н. соответствовали аллелю -511Т, 190 и 114 п.н. - -511С, а 304, 190 и 114 п.н. выявлены у гетерозигот -511 СТ. Мутантный аллель -511Т обусловливает повышение продукции интерлейкина 1В и, соответственно, обладает провоспалительным эффектом.

Фрагменты длиной 99 п.н. соответствовали аллелю -889С гена -889Т/С IL-1A, 83 и 16 п.н. - аллелю -889Т, фрагменты длиной 99, 83 и 16 п.н. наблюдались у гетерозигот -889СТ. Дикий аллель -889С обусловливает повышение продукции интерлейкина 1А и, соответственно, обладает провоспалительным эффектом.

Фрагменты длиной 412 п.н. соответствовали аллелю -592С гена IL-10, 236 и 176 п.н. - аллелю -592А, фрагменты длиной 412, 236 и 176 п.н. наблюдались у гетерозигот -592СА. Мутантный аллель -592А обусловливает повышение продукции интерлейкина 10 и IgE и, соответственно, обладает противовоспалительным и атопическим эффектами.

Продукты VNTR-анализа оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 3%-ном агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ-буфера, окрашенном раствором бромистого этидия (0,01%). В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Визуализация фореграмм осуществляется в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция). В результате амплификации идентифицируют фрагменты ДНК длиной 240-595 п.н., с 2, 3, 4, 5 или 6 копиями тандемных повторов. Эти аллели обозначаются как 2R, 3R, 4R, 5R и 6R, соответствуют аллелям IL-1Ra 2, 3, 1, 4 и 5.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использован критерий χ², наблюдаемая гетерозиготность, ожидаемая гетерозиготность, индекс фиксации Райта. Взаимосвязи между количественными патогенетически значимыми признаками ХГН и полиморфизмами генов цитокинов изучали с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа. Влияние генетических и средовых факторов на почечную выживаемость изучали с помощью метода множительных оценок Каплан-Майера и регрессионной модели Кокса.

В качестве конкретного примера проведен анализ результатов наблюдений 238 больных хроническим гломерулонефритом. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

Монофакторный анализ почечной выживаемости с использованием регрессионной модели Кокса подтвердил, что наличие аллеля -889С гена IL-1A или аллеля -592А гена IL-10 или артериальной гипертензии на протяжении ХГН ухудшают почечную выживаемость (табл.1).

Таблица 1 Монофакторный анализ влияния генетических и клинических факторов на почечную выживаемость у больных ХГН (регрессионная модель Кокса) Факторы Влияние фактора на выживаемость (p) Наличие аллеля -511Т гена IL-1B 0 Наличие аллеля -889С гена IL-1А Снижение почечной выживаемости; р=0,05 Наличие аллеля IL-1Ra*4 гена VNTR IL-1Ra 0 Наличие аллеля IL-1Ra*1 гена VNTR IL-1Ra 0 Наличие аллеля -703С гена IL-5 0 Наличие аллеля 113Т гена IL-9 0 Наличие аллеля -592А гена IL-10 Снижение почечной выживаемости; р=0,05 Наличие аллеля -4257А гена IL-13 0 Мужской пол 0 Снижение функции почек на момент первого обследования 0 Наличие нефротического синдрома на момент первого обследования 0 Наличие артериальной гипертензии на протяжении ХГН Снижение почечной выживаемости; р=0,01

Многофакторный регрессионный анализ подтвердил, что неблагоприятными прогностическими факторами является одновременно: носительство аллеля -511Т гена IL-1B (р=0,005), наличие нефротического синдрома на момент первого обследования (р=0,007), наличие артериальной гипертензии в течении ХГН (р=0,002).

Таблица 2 Многофакторный анализ влияния генетических и клинических факторов на почечную выживаемость у больных ХГН (регрессионная модель Кокса) Факторы Влияние фактора на выживаемость (р) Наличие аллеля -511Т гена IL-1B Снижение почечной выживаемости; р=0,005 Наличие аллеля -889С гена IL-1А 0 Наличие аллеля IL-1Ra*4 гена VNTR IL-1Ra 0 Наличие аллеля IL-IRa*1 гена VNTR IL-1Ra 0 Наличие аллеля -703С гена IL-5 0 Наличие аллеля 113Т гена IL-9 0 Наличие аллеля -592А гена IL-10 0 Наличие аллеля -4257А гена IL-13 0 Снижение функции почек на момент первого обследования 0 Наличие нефротического синдрома на момент первого обследования Снижение почечной выживаемости; р=0,007 Наличие артериальной гипертензии на протяжении ХГН Снижение почечной выживаемости: p=0,002

При исследовании длительности хронического гломерулонефрита до развития терминальной стадии хронической почечной недостаточности (ТХПН) в зависимости от генотипов VNTR-полиморфизма антагониста рецептора интерлейкина 1 (VNTR IL-1Ra) с использованием дисперсионного анализа (табл.3) установлено, что раньше всего терминальной стадии ХПН достигали индивидуумы с генотипом 4R/4R (р=0,04): у пациентов с данным генотипом ТХПН развивается через 5,99 лет против 8,25-11,50 лет при других генотипах по данному локусу. Степень влияния полиморфизма антагониста рецептора интерлейкина 1 (VNTR IL-1Ra) на характер прогрессирования ХГН, оцененная с использованием коэффициента детерминации, весьма существенна и составляет 10,31%.

Таблица 3 Время развития ТХПН от начала ХГН (лет) Ген Полиморфизм и его локализация в гене Генотипы Длительность заболевания до развития ТХПН (лет)     2R/2R 8,25±2,52 (4)     2R/4R 10,26±1,30(15)   VNTR 2R/5R 11,5±3,07 (4) IL-1Ra (2 интрон) 4R/4R 5,99±0,83 (36)   4R/5R 10,05±2,90 (5)     p 0,04     h², % 10,31

Таким образом, самостоятельными факторами риска ускоренного падения функции почек являются следующие:

- носительство аллеля -889С гена IL-1 А,

- носительство аллеля -592А гена IL-10,

- наличие артериальной гипертензии на протяжении ХГН.

Неблагоприятное прогностическое значение имеет одновременное сочетание аллеля -511Т гена IL-1B, наличие нефротического синдрома на момент первого обследования и артериальная гипертензия в течение ХГН.

Генотип 4R/4R VNTR IL-1Ra ассоциирован с высокой скоростью развития терминальной стадии ХПН.

Литература

Способ относится к области медицины и может быть использовано для оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом. Сущность способа: выделяют ДНК из периферической венозной крови, выявляют аллели и генотипы генов интерлейкинов. Вывод о снижении почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом делают в следующих случаях: - выявления носительства аллеля -889С гена интерлейкина 1А -889С/Т IL-1A или аллеля -592А гена интерлейкина 10 -592C/AIL-10; - выявления носительства аллеля -511Т гена интерлейкина 1В -511 С/Т IL-1B в сочетании с нефротическим синдромом на момент первого обследования и наличия артериальной гипертензии в течение ХГН; - выявления генотипа 4R/4R гена антагониста рецептора интерлейкина 1 VNTR IL-1Ra. Использование способа позволяет оценить дальнейшее течение хронического гломерулонефрита, что дает возможность в кратчайшие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания. 3 табл.

Способ оценки почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, выявление аллелей и генотипов генов интерлейкинов, отличающийся тем, что делают вывод о снижении почечной выживаемости у больных хроническим гломерулонефритом в следующих случаях: выявлении носительства аллеля -889С гена интерлейкина 1А -889С/Т IL-1A или аллеля -511ИТ гена интерлейкина 10 -592С/А IL-10 или выявлении носительства аллеля -592A гена интерлейкина 1В -511 С/Т IL-1В в сочетании с нефротическим синдромом на момент первого обследования и наличия артериальной гипертензии в течение ХГН, или выявления генотипа 4R/4R гена антагониста рецептора интерлейкина 1 VNTR IL-1Ra.