СПОСОБ ОЦЕНКИ ОСОБЕННОСТЕЙ КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования течения хронического гломерулонефрита на протяжении всей жизни человека.

В настоящее время хронический гломерулонефрит (ХГН) представляет серьезную проблему современной медицины в связи с тяжестью болезни и широкой распространенностью в разных регионах мира [1]. В нашей стране ежегодно с диагнозом хронический гломерулонефрит госпитализируется около 1-2% от всех терапевтических больных. В структуре всей почечной патологии, составляющей около 200 случаев на 100 тыс. населения, ХГН является наиболее частым заболеванием, доля которого достигает 40% [2]. Следует отметить, что заболевание поражает преимущественно лица трудоспособного возраста, что наносит значительный социальный и экономический ущерб [3]. ХГН нередко приводит к летальности в связи с достижением терминальной стадии хронической почечной недостаточности [4, 5].

Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в развитии ХГН играют интерлейкины и факторы роста [6]. Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам ХГН, в России немногочисленны и затрагивают в основном интегральные мембранные белки [7], ряд интерлейкинов [6], факторы некроза опухоли [8]. Исследования роли полиморфных маркеров ряда генов интерлейкинов в отношении ХГН до сих пор не проведены.

Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов интерлейкинов - это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции интерлейкинов, что может влиять на развитие хронического воспалительного процесса.

Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен способ оценки клинического течения хронического гломерулонефрита.

Задачей настоящего исследования является разработка способа оценки патогенетической значимости полиморфизмов генов интерлейкинов в течение хронического гломерулонефрита.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки течения хронического гломерулонефрита, позволяющих в кратчайшие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ особенностей клинического течения хронического гломерулонефрита на основе данных о полиморфизме генов интерлейкинов, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом, выявление полиморфизмов генов интерлейкинов и в случае:

- выявления генотипа - 4257АА гена IL-13 делают вывод о вероятности формирования тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания;

- в случае выявления аллеля - 4257А гена IL-13 делают вывод о вероятности протекания ХГН с умеренной протеинурией.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность определения особенностей течения хронического гломерулонефрита по наличию аллелей и генотипов генов интерлейкинов.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом методом фенол-хлороформной экстракции.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза полиморфных локусов интерлейкина 13-4257G/A IL-13 выполняется в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH=8,8), 1,25 мМ MgCl₂, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы.

Амплификат, наработанный при ПЦР полиморфных локусов генов интерлейкинов, подвергают рестрикции (ПДРФ-анализ) путем добавления к 12,5 мкл. амплификата 5 ед. активности рестриктазы и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 16 часов. Для анализа полиморфизма гена интерлейкина 13-4257G/A IL-13 используют эндонуклеазу рестрикции BspLI ("СибЭнзим").

Продукты ПДРФ-анализа оцениваются путем разделения при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на основе ТВЕ-буфера, окрашенном раствором бромистого этидия (0,01%). В качестве электрофорезного буфера используют 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Визуализация фореграмм осуществляется в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция).

Фрагменты длиной 156 п.н. соответствовали аллелю - 4257А гена IL-13, 138 и 18 п.н. - аллелю - 4257G, фрагменты длиной 156, 138 и 18 п.н. наблюдались у гетерозигот - 4257AG. Мутантный аллель - 4257А обусловливает повышение продукции интерлейкина 13 и IgE и, соответственно, обладает противовоспалительным и атопическим эффектами.

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществляют с использованием программы «STATISTICA 6.0». Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использован критерий χ², наблюдаемая гетерозиготность, ожидаемая гетерозиготность, индекс фиксации Райта. Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с предрасположенностью к хроническому гломерулонефриту, а также с качественными признаками, характеризующими его клинические особенности, оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI). Взаимосвязи между количественными патогенетически значимыми признаками ХГН и полиморфизмами генов цитокинов изучали с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа.

Возможность использования предложенного способа для определения клинического прогноза и стратегии терапии данного заболевания подтверждает анализ результатов наблюдений 238 больных хроническим гломерулонефритом и 241 человек популяционного контроля. Пациенты включались в соответствующую группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования. Контрольную группу составили индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Белгородской области и не имеющие родства между собой.

Впервые выявлено, что генотип - 4257АА гена IL-13 является маркером:

- тяжелой артериальной гипертензии, частота встречаемости которого у больных с уровнем артериального давления >160/110 более чем в 3 раза превысила долю этого генотипа в контрольной группе (20,69% и 6,54% соответственно; χ²=3,99, р=0,05) (табл.1);

- высокого уровня среднесуточной протеинурии (4,70 г/сут. против 2,03 г/сут. и 2,37 г/сут. у пациентов с генотипами - 4257GG и - 4257AG соответственно; р=0,05), что подтверждает анализ ассоциации генотипов полиморфных генетических маркеров интерлейкинов со среднесуточной протеинурией у больных ХГН, проведенный с использованием дисперсионного анализа (табл.2). Коэффициент детерминации, показывающий какая доля изменчивости протеинурии обусловлена генотипами гена интерлейкина 13, составил 5,08% (табл.2).

Полученные данные согласуются с результатами анализа распределения генов и генотипов изучаемых полиморфных генетических систем в группах больных ХГН с разным уровнем протеинурии (незначительная протеинурия - до 1 г/сут, умеренная - 1-3 г/сут, выраженная - более 3 г/сут).

Таблица 1 Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов интерлейкинов у больных ХГН в зависимости от уровня артериального давления (%) (начало) ен Аллели, генотипы Контрольная группа (n=241) Уровень АД Критерий различий, χ² (p) <140/90 (n=79) 140/90-159/109 (n=92) >160/110 (n=52) 1 2 3 4 1-2 1-3 1-4 -4257G/A IL-13 -4257G 76,10 76,74 74,60 65,52 0,00 (1,00) 0,00 (1,00) 1,97 (0,16) -4257А 23,90 23,26 25,40 34,48 -4257GG 59,56 65,12 58,73 51,72 0,22 (0,64) 0,00 (1,00) 0,32 (0,57) -4257AG 33,09 23,26 31,75 27,59 1,06 (0,30) 0,00 (0,98) 0,13 (0,72) -4257АА 6,54 11,63 9,52 20,69* 0,32 (0,57) 0,06 (0,81) 3,99 (0,05) * - различия достоверны между больными и контрольной группой (р<0,05)

Таблица 2 Средний уровень протеинурии в зависимости от полиморфных маркеров генов интерлейкинов Гены Полиморфизм и его локализация в гене Генотипы Среднесуточная протеинурия (г) IL-13 -4257G/A (4 экзон) -4257GG 2,01±0,34 -4257AG 2,37±0,43 -4257АА 4,70±1,10 h² 5,08 Р 0,05 Примечание: h² - коэффициент детерминации (%)

Также впервые выявлено, что аллель - 4257А гена IL-13 является маркером умеренного уровня протеинурии. Пациенты с умеренной протеинурией характеризуются наибольшей частотой аллеля - 4257А гена IL-13 по сравнению с больными с незначительной протеинурией и выраженной протеинурией (42,86% против 22,73% и 26,76% соответственно; χ²=4,95-8,16, р=0,03-0,005) (табл.3).

Таблица 3 Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов интерлейкинов у больных ХГН в зависимости от степени протеинурии (%) (начало) Гены Аллели, генотипы Уровень протеинурии Критерий различий, χ² (р) <1 г/сут 1-3 г/сут >3 г/сут 1 2 3 1-2 1-3 2-3 -4257G/A IL-13 -4257G 77,27 57,14* 73,33 8,16 (0,005) 0,24 (0,62) 4,95 (0,03) -4257А 22,73 42,86* 26,67 -4257GG 68,18 42,86 60,0 0,57 (0,45) 0,03 (0,87) 0,09 (0,77) -4257AG 18,18 28,57 26,67 0,00 (0,96) 0,04 (0,84) 0,00 (1,00) -4257АА 13,64 28,57 13,33 0,11 (0,74) 0.00 (1,00) 0,07 (0,79) *- различия достоверны (р<0,05)

Таким образом, наличие у больных ХГН генотипа - 4257АА гена IL-13 обусловливает формирование тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания.

Аллель - 4257А гена IL-13 ассоциирован с умеренной протеинурией.

Литература.

1. Полещук Л.А. Характеристика почечной гемодинамики у детей с заболеваниями почек (Обзор литературы) // Нефрология и диализ. - 2006. - Т.8, №3. - С.225-232.

2. Мартынов С.А., Швецов М.Ю., Кутырина И.М. Нарушения суточного ритма артериального давления у больных хроническим гломерулонефритом // Терапевтический архив. - 2006. - Том 78, №1. - С.23-28.

3. Кутырина И.М., Руденко Т.Е., Швецов М.Ю., Кушнир В.В. Факторы риска сердечно-сосудистых осложнений у больных на додиализной стадии хронической почечной недостаточности // Терапевтический архив. - 2006. - Том 78, №5. - С.45-50.

4. Картамышева Н.Н., Чумакова О.В., Кучеренко А.Г., Сергеева Т.В. Прогрессирование хронического гломерулонефрита: клинико-морфологические взаимосвязи // Нефрология и диализ. - 2003. - т.5, №4. - С.395-398.

5. Ермоленко В.М., Козлова Т.А., Михайлова Н.А. Значение малобелковой диеты в замедлении прогрессирования хронической почечной недостаточности: обзор литературы // Нефрология и диализ. - 2006. - Т.8, №4. - С.310-321.

6. Петросян Э.К., Цыгин А.Н., Шестаков А.Е., Носиков В.В. Роль генетического полиморфизма интерлейкинов 4 и 13 в развитии нефротического синдрома с минимальными изменениями у детей и подростков // Педиатрия. - 2006. - №5. - С.7-10.

7. Шестаков А.Е., Камышова Е.С., Кутырина И.М. и др. Ассоциация полиморфных маркеров D6S2414 и D6S1271, расположенных в локусе МНС (6р21.31), с хроническим гломерулонефритом среди русских г.Москвы // Генетика. - 2006. - Т.42, №12. - С.1727-1730.

8. Некипелова Е.В., Чурносов М.И. Влияние генетических факторов на скорость прогрессирования хронического гломерулонефрита // Нефрология и диализ. - 2007. - Т.9, №3. - С.340.

Изобретение относится к области медицины. Для оценки особенностей клинического течения хронического гломерулонефрита выделяют ДНК из периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом. В случае выявления генотипа 4257АА гена IL-13 делают вывод о вероятности формирования тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания. В случае выявления аллеля 4257А гена IL-13 делают вывод о вероятности протекания хронического гломерулонефрита с умеренной протеинурией. Способ позволяет в кратчайшие сроки осуществить прогнозирование течения хронического гломерулонефрита и определить стратегию терапии данного заболевания. 3 табл.

Способ оценки особенностей клинического течения хронического гломерулонефрита, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови больных хроническим гломерулонефритом, выявление полиморфизмов генов интерлейкинов, отличающийся тем, что в случае выявления генотипа - 4257АА гена IL-13 делают вывод о вероятности формирования тяжелой артериальной гипертензии и высокого уровня среднесуточной протеинурии в течение заболевания, а в случае выявления аллеля - 4257А гена IL-13 делают вывод вероятности протекания ХГН с умеренной протеинурией.