УСИЛИТЕЛЬ ВЫРАБОТКИ ТЕСТОСТЕРОНА Российский патент 2011 года по МПК A61K31/122 A23L1/302 A61P5/26 A61P15/10 A61P3/02 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

[0001]

Настоящее открытие связано с усилителем выработки тестостерона. В частности, оно относится к составу, который повышает уровень эндогенного тестостерона.

[0002]

Тестостерон, который является видом андрогенов, активно способствует росту мышц, когнитивным функциям, эластичности кровеносных сосудов, липидному метаболизму, репродуктивным функциям и т.п. Хотя секреция тестостерона с возрастом уменьшается, присутствие разрушителей железы внутренней секреции также влияет на секрецию. Недавние исследования микропанели с ДНК стерильных крыс, находящихся в состоянии острого дефицита витамина К, предполагает возможность того, что менахинон-4 способствует биосинтезу тестостерона (Незапатентованные Документы 1 и 2).

[0003]

Все указывает на то, что когда секреция тестостерона уменьшается, концентрация и мотивация также снижаются. Память, мускульная сила, функции мочеиспускания и мужские сексуальные функции ухудшаются. В последние годы количество мужчин, страдающих от климактерических расстройств, увеличилось. При климактерических расстройствах у мужчин уровень тестостерона снижается в результате гипогонадизма, что приводит к появлению описанных выше симптомов.

[0004]

Одним из способов лечения климактерических расстройств у мужчин является гормонозаместительная терапия, при которой пациенту вводятся инъекции веществ, повышающих уровень тестостерона. Однако инъекция способствует быстрому росту уровня тестостерона в крови и может привести к возникновению болезни. Быстрый рост уровня гормонов может вызвать неблагоприятные побочные эффекты, вызывающие усталость, влияющие на кровеносные сосуды, печень, почки и т.д. Поэтому гормонозаместительная терапия иногда использует метод чрескожного введения, посредством которого тестостерон медленно освобождается.

[0005]

Помимо замены тестостерона, осуществляемой из внешних источников, как описано выше, предлагаются следующие методы увеличения уровня тестостерона в крови: введение бензила глюкозинолата и бензила изотиоцианата, содержащихся в мака и подобных растениях (Запатентованный документ 1); введение смеси мака и оленьих рогов (Запатентованный документ 2); и введение замещенных соединений пиразола (Запатентованный документ 3).

Незапатентованный Документ 1: 8^th Vitamin К and Bone Meeting Records, страницы 87-89, декабрь, 2005 г., Eisai Co., Ltd.

Незапатентованный Документ 2: Shirakawa, et al., Biochim. Biophys. Acta Vitamin К deficiency reduces testosterone production in the testis through down-regulation of the Cyp11a a cholesterol side chain cleavage enzyme in rats, ARTICLE In Press, принятый манускрипт, доступный в сети 6 июня 2006 г.

Запатентованный Документ 1: Japanese Patent Application Laid-open No. 2005-306754.

Запатентованный Документ 2: Japanese Patent Application Laid-open No. 2003-523945.

Запатентованный Документ 3: Japanese Patent Application Laid-open No. 2005-504093.

[0006]

Описанные выше составы, приводящие к усилению тестостерона, являются натуральными медикаментами или химически синтезированными лекарствами. Хотя широко потребляемые, безопасные компоненты пищевого продукта или питательные вещества, повышающие уровень тестостерона в крови, являются более предпочтительными, такие вещества еще не изучены. Поэтому необходимо вещество, которое будет представлять собой наиболее безопасный и широко потребляемый компонент, повышающий уровень тестостерона.

[0007]

Изобретатели обнаружили, что витамин К1 или витамин К2, потребляемые в пище, в тканях превращаются в менахинон-4. Так как в семенниках находится очень высокая концентрация менахинона-4, изобретатели предприняли попытку определить функцию витамина К в семенниках. Проводя данное исследование, изобретатели обнаружили, что уровень тестостерона в крови можно увеличить посредством введения витамина К, тем самым они приблизились к открытию. Другими словами, открытие привело к появлению усилителя тестостерона, в который входит витамин К.

[0008]

К традиционно известным функциям, которыми обладает витамин К, относятся поддержание нормального свертывания крови, усиление костеобразования, контроль резорбции костей, предотвращение артериосклероза путем предотвращения карбонизации артерии и лечение болезни печени. И было совершенной неожиданностью обнаружить, что витамин К способствует повышению уровня эстрогенов. Хотя Незапатентованные Документы 1 и 2 предполагают, что витамин К способствует биосинтезу тестостерона, увеличение уровня тестостеронов посредством введения витамина К было невозможно предвидеть.

[0009]

Описанный выше витамин К более предпочтителен, чем витамин К2.

[0010]

Описанный выше витамин К более предпочтителен, чем менахинон-4 и/или менахинон-7.

[0011]

Изобретение представляет собой лекарственные препараты, изготовленные из описанного выше усилителя тестостерона, который предотвращает, снижает и/или устраняет симптомы и болезни, вызванные снижением уровня тестостерона.

[0012]

Изобретение также обеспечивает появление добавок, диетических пищевых продуктов и пищевых продуктов, содержащих добавки усилителя тестостерона.

[0013]

В данном изобретении уровень тестостерона в крови можно легко повысить путем ведения витамина К, который безопасен для человека. Так как витамин К растворим в липидах, он легче накапливается в организме, чем традиционные вещества, содержащие усилители тестостерона, а эффект от его применения длится дольше. В результате уровень тестостерона становится нормальным, а функции, развитию которых способствует витамин К (мышечная сила, сексуальные функции и т.д.), будут поддерживаться или совершенствоваться. Либо будут устранены симптомы и болезни, такие как климактерические расстройства, вызываемые низким уровнем тестостерона. Открытый усилитель тестостерона может считаться диетическим пищевым продуктом или пищевым продуктом, содержащим добавки. Поэтому также можно предотвратить появление описанных выше симптомов и болезней.

[0014]

Хотя доза витамина К, которую необходимо вводить человеку ежедневно, составляет от 50 мг до 80 мг (Диетические рекомендации для Японии, 2005), наивысшим приемлемым уровнем является 30 мг. Витамин К является в высшей степени безопасным веществом. Поэтому открытый усилитель тестостерона намного более безопасен, чем традиционно известные усилители тестостерона.

Изобретение поясняется чертежами

[0015]

[Фиг.1] Диаграмма сравнения аналогичной концентрации витамина К в семенниках крыс, когда им предписывалась диета с добавлением МК-4, как указано в Примере 1, а также контрольная диетическая группа и диетическая группа с пониженным содержанием витамина К представлены в качестве примеров для сравнения.

[Фиг.2] Диаграмма сравнения уровня экспрессии P450scc мНРК у крыс на Фиг.1.

[Фиг.3] Диаграмма сравнения уровня протеина P450scc у крыс на Фиг.1.

[Фиг.4] Диаграмма сравнения концентрации плазмы тестостерона у крыс на Фиг.1.

[Фиг.5] Диаграмма ежедневных изменений веса, когда крысам предписывалась диета с введением витамина К, как показано в Примере 2, и контрольная диетическая группа для сравнения.

[Фиг.6] Диаграмма ежедневного изменения введения вещества крысам на Фиг.5.

[Фиг.7] Диаграмма сравнения концентрации витамина К в семеннике у крыс на Фиг.5.

[Фиг.8] Диаграмма ежедневного изменения величины тестостерона в крови у крыс на Фиг.5.

[Фиг.9] Диаграмма сравнения концентрации тестостерона в семеннике у крыс на Фиг.5.

ЛУЧШИЙ(ИЕ) РЕЖИМ(Ы) ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

[0016]

Ниже мы детально опишем, как было внедрено изобретение усилителя выработки тестостерона. Витамин К, используемый в изобретенном усилителе тестостерона, это витамин К1, витамин К2 и витамин К3. Витамин К1 (также называемый филлохинон) в большом количестве содержится в зеленых и желтых овощах, бобовых, растительных маслах, морских водорослях, морепродуктах и т.п. Витамин К2 (также называемый менахинон) производится микроорганизмами и в больших количествах содержится в натто (продукте, производимом из сброженных соевых бобов, родом из Японии) и молочных продуктах, таких как сыр. Бактерии кишечного тракта также производят витамин К2. В витамине К2 гомологи от менахинона-4 (МК-4) к менахинону-15 (МК-15) присутствуют в зависимости от длины изопреноидных боковых цепей на нафтохиноидном фрагменте. Например, высокие уровни МК-6 к МК-9 содержатся в сыре, а высокий уровень МК-7 в натто. Витамин К3 (также называемый менадион) является синтетическим.

[0017]

Побочные эффекты возникают при потреблении высокой дозы витамина К3. Поэтому в терминах экспериментальной диеты витамин К1, извлекаемый из овощей и затем очищенный, а также витамин К2, извлекаемый из ферментных веществ при помощи бацилл натто и т.п., являются более безопасными, а следовательно более предпочтительными. Витамин К2, который можно производить легче и с небольшими затратами, также является более предпочтительным. Менахинон-4, одобренный в качестве пищевой добавки, и/или менахинон-7, используемый в качестве компонента пищевого продукта, особенно желательны. Известно, что витамин К1 и витамин К2, потребляемые с пищей, в организме превращаются в менахинон-4.

[0018]

Методы производства каждого витамина К практически ничем не ограничены. Имеющиеся в продаже витамины также можно использовать без ограничений. Особенно можно использовать ферментацию при помощи микроорганизмов, извлечение из пищевых продуктов и очищение, а также химический синтез.

[0019]

Витамин К1 извлекается и очищается при помощи известных методов (таких как Japanese Patent Application Laid-open No. Heisei 5-155803) из зеленой периллы, периллы, мулухии, петрушки, съедобных листьев хризантемы, коматсуны (японского горчичного шпината), шпината, митсубы (японской дикой петрушки), люцерны, листьев лесного ореха, листьев каштана, побегов ячменя, побегов овса, капусты, брокколи, цветной капусты, томатов, растительных масел (соевое масло, рапсовое масло, кунжутное масло, арахисовое масло, кукурузное масло, сафлоровое масло, подсолнечное масло, рисовое масло и оливковое масло) и т.п. Витамин К1 также можно получить при помощи синтеза. Витамин К1 представляет собой растворимое в липидах масло светло-желтого цвета, теплоустойчивое, но неустойчивое к воздействию света. Витамин К может быть в форме оксида.

[0020]

Витамин К2 производится посредством ферментации при помощи микроорганизмов, таких как бациллы натто, а также при помощи методов, описанных в Japanese Patent Application Laid-open Nos. Heisei 08-073396, Heisei 11-92414, Heisei 10-295393, 2001-136959, и т.п.

[0021]

Содержимое витамина К, входящее в открытый усилитель тестостерона, изменяется в зависимости от количества потребленной композиции препарата. По весу содержимое обычно находится в диапазоне от 0,0001% до 100%, более предпочтительным является вес от 0,001% до 90%, еще более предпочтительным можно назвать вес от 0,01% до 70%, но наиболее предпочтителен вес от 1% до 50%. Когда содержание менее 0,0001%, количества, необходимого для достижения эффекта усиления тестостерона, не будет достаточно.

[0022]

Помимо необходимого ингредиента, которым является витамин К, открытый усилитель тестостерона может содержать один или более видов веществ, обладающих функцией усиления тестостерона. Такими веществами могут являться, к примеру, растения, такие как мака, природные медикаменты, такие как оленьи рога, экстракты из этих растений и природных медикаментов, бензил глюкозинолата и бензил изотиоцианата, а также замещенные соединения пиразола.

[0023]

Помимо необходимого ингредиента, которым является витамин К, и соответствующих веществ - усилителей тестостерона, открытый тестостерон может включать носители, наполнители, вспомогательные средства и т.п., которые могут использоваться фармакологически, в дозах, которые не препятствуют возникновению эффекта от использования обретения.

[0024]

В особенности можно включать следующее. Носители и наполнители, такие как лактоза, сахароза, фруктоза, глюкоза, гидрат глюкозы, белый сахар, очищенная сахароза, эритритол, ксилит, сорбит, маннитол, палатиноза, палатинит, сниженный солодовый сахар-песок, крахмальная патока, кармелоза, декстрин, кукурузный крахмал, пептизированный крахмал, частично пептизированный крахмал, картофельный крахмал, оксипропилированный крахмал, аминокислоты, каолин, двуокись кремния, кремниевая кислота, силикат алюминия, бикарбонат натрия, фосфат кальция, дигидрофосфат кальция, карбонат кальция, окись магния, гидроксид алюминия, жирные кислоты, соли жирных кислот, моноглицерид и диглицерид жирных кислот, этанол, растительное масло, оливковое масло, соевое масло, кукурузное масло, жирное масло, масла и жиры, вязкий парафин, пропиленгликоль, этиленгликоль, полиэтиленгликоль и глицерин; вяжущие материалы, такие как кристалическая целлюлоза, кристаллическая целлюлоза кармелоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза с низкой степенью замещения, гидроксипропилметилцеллюлоза, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетат сукцината гидроксипропилметилцеллюлозы, кармелоза натрия, этилцеллюлоза, карбоксиметилэтилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, пептизированный крахмал, частично пептизированный крахмал, оксипропилированный крахмал, декстрин, пуллулан, поливинилпирролидон, алкил амино метакрилат сополимер Е, алкил амино метакрилат сополимер RS, сополимер L метакриловой кислоты, сополимер метакриловой кислоты, поливинилацетал диэтиламиноацетат, поливиниловый спирт, аравийская камедь, порошковая камедь, агар, желатин, белый шеллак, трагакант и макрогол; смазочные вещества, такие как пшеничный крахмал, рисовый крахмал, кукурузный крахмал, синтетический алюминосиликат, высушенный гель гидроокиси алюминия, магниевый метасиликат алюмината, вторичный кислый фосфат кальция, безводный вторичный кислый фосфат кальция, воск, гидрогенизированное растительное масло, полиэтиленгликоль, легкая безводная кремниевая кислота, синтетический алюмосиликат, стеариновая кислота, макрогол, тальк, стеарат магния, стеарат кальция, водный диоксид кремния и сложный эфир жирной кислоты сахарозы; агенты, вызывающие дезинтеграцию, такие как кристаллическая целлюлоза, метилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза с низкой степенью замещения, кармелоза, кармелоза кальция, кармелоза натрия, кроскармелоза натрия, пшеничный крахмал, рисовый крахмал, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, частично пептизированый крахмал, оксипропилированный крахмал, натрий-карбоксиметиловый крахмал и трагакант; поверхностно-активные вещества, такие как соевый лецитин, sucrose сложный эфир жирной кислоты, полиоксил стеарат, полиоксиэтиленовое гидрогенизированное касторовое масло, полиоксиэтилен полиоксипропиленгликоль, полуторная окись сорбита, триолеат сорбита, сорбитмоностеорат, монопалмитат сорбита, монолаурат сорбита, эфир полиоксиэтиленовой жирной кислоты, глицерилмоностеарат, лаурилсульфат натрия и лауромакрагол; эмульсификаторы; солюбилизаторы, такие как фосфат; вещества, способствующие поглощению; регуляторы уровня рН, такие как соляная кислота, лимонная кислота, дигидрат цитрата натрия, уксусная кислота, винная кислота, гидроксид натрия, гидроксид калия, гидрокарбонат натрия, карбонат натрия и молочная кислота; осветлители, такие как натуральная смола; стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты; смачивающие вещества; красители; ароматизирующие вещества; успокаивающие средства и т.п.

[0025]

Открытый усилитель тестостерона используется для медикаментов, добавок, диетических пищевых продуктов и пищевых продуктов, содержащих добавки. Поэтому усилитель тестостерона обрабатывается и превращается в жидкость, порошок, гранулы, таблетки, капсулы, сиропы и т.п. Так как витамин К растворяется в липидах, усилитель тестостерона предпочтительней принимать в таблетках или капсулах.

[0026]

Открытый усилитель тестостерона может непосредственно добавляться к основным ингредиентам обычных пищевых продуктов, таких как хлеб, рис, суп, полуфабрикаты, закуски и конфеты, во время производства.

[0027]

Методы введения изобретенного усилителя тестостерона для использования в медикаментах практически ничем не ограничены. Например, можно использовать прероральный прием внутрь, подкожное введение препарата, употребление с жидкостью, инъекции (внутримышечные, внутрибрюшные, подкожные и внутривенные). Предпочтительней, чтобы усилитель тестостерона принимался в виде таблеток или капсул, так как при этом пациент испытывает меньше стресса.

[0028]

Доза и введение усилителя тестостерона для использования медикаментов могут определяться посредством изучения симптомов, наблюдаемых у пациента, его веса, интервалов приема препарата, метода приема и различных факторов, влияющих на другие клинические эффекты. Обычно, ежедневно взрослому вводится от 10 до 100 мг витамина К, предпочтительней от 20 до 200 мг. Когда витамин К используется для лечения, можно использовать от 6 до 100 мг.

[0029]

Когда усилитель тестостерона используется для добавок, диетических пищевых продуктов, пищевых продуктов, содержащих добавки, и обычных пищевых продуктов, то в целях безопасности ежедневная доза витамина К для взрослого человека должна по возможности составлять от 10 до 30 мг, а лучше от 50 до 6 мг.

[0030]

Помимо того, что изобретенный усилитель тестостерона является лекарственным средством для людей, он также может использоваться в медикаментах и пищевых продуктах, содержащих добавки, предназначенных для животных, таких как домашний скот и домашние животные мужского пола. Способ введения может быть не пероральным, например через инъекции, и пероральным, например через пищевые продукты, содержащие добавки и рецептированный корм.

[0031]

При приеме млекопитающей мужской особью, включая человека, открытого усилителя тестостерона медикаменты, произведенные с использованием усилителя тестостерона, пищевые продукты, в состав которых входит усилитель тестостерона, витамин К повышают уровень тестостерона. Поэтому открытый усилитель тестостерона должен выполнять функции лечебных и профилактических медикаментов для первичного и вторичного гипогонадизма и при дефиците тестостерона, вызванного старением или воздействием окружающей среды. Открытый усилитель тестостерона может предотвратить, снизить и/или устранить болезни, вызванные низким уровнем тестостерона. В частности, можно ожидать предотвращения, снижения и/или устранения истощения мышц, нарушения когнитивных функций, концентрации, мотивации, эластичности кровеносных сосудов, липидного метаболизма, репродуктивных, сексуальных функций, мочеиспускания и т.п.

[0032]

Далее мы опишем изобретение более детально и на примерах. Однако функции открытия не ограничиваются данными примерами.

Пример 1

Эффект повышения уровня тестостерона в крови, вызванный усилителем тестостерона, был изучен на обыкновенных крысах. Обыкновенная крыса - это крыса, у которой дефицит витамина К не появляется даже тогда, когда потребляемая ею пища не содержит витамин К, так как крыса поглощает витамин К, производимый бактериями в ее кишечном тракте. Обычная крыса - это модель, экстраполирующая обычную человеческую особь.

[0033]

Материалы и метод

I. Подготовка животных на основе модели

Разведение экспериментальных животных

Экспериментальные животные и условия содержания следующие:

экспериментальные животные: обычные крысы (Wistar/Std, восьминедельные мужские особи)

Условия разведения: которые содержались в предназначенном для этого помещении при температуре 23°С, влажности 50±5% и при двенадцатичасовом суточном освещении, которое начиналось в 8:00 и заканчивалось в 20:00.

[0034]

В качестве экспериментальных диетических групп было назначено три группы.

1. Диетическая группа с низким содержанием витамина К (витамин К в пищу не добавлялся).

2. Контрольная диетическая группа (добавление в пищу витамина К1 из расчета 0,75 мг/кг).

3. Диетическая группа, которая употребляет МК-4 (добавление в пищу менахинона-4 из расчета 75 мг/кг).

Количество витамина К1, потребляемое в контрольной диетической группе, представляло собой концентрацию витамина К, используемую в стандартной очищенной диете AIN93G. Поэтому контрольная диетическая группа относится к стандартной диете, включая количество витамина К, потребляемого крысами вместе с обычным кормом. Менахонин-4, добавляемый диетической группе, употребляющей МК-4, представлял собой менатетренон (Nisshin Pharma Inc.).

[0035]

В каждой экспериментальной группе в пищу был добавлен и тщательно перемешан витамин К или менахинон-4 (в дальнейшем называемый также МК-4) в пропорциях, указанных в Таблице 1. Состав экспериментальной диеты показан в Таблице 1.

Таблица 1 Состав экспериментальной диеты   Состав (%) Кукурузный крахмал 52.9486 Казеин 20 Сахароза 10 Соевое масло 7 Целлюлоза 5 Минеральная смесь 3.5 Витаминная смесь (оригинальный препарат) 1 L-цистин 0.3 Холи битартрат 0.25 Третичный бутилгидрохинон 0.0014   Витаминная смесь. Состав Витамин А 40000 МЕ Витамин B₁₂ 0.25 мг Витамин D₃ 10000 МЕ Витамин Е 750 МЕ Тиамин гидрохлорид 60 мг Рибофлавин 60 мг Пиридоксаль гидрохлорид 70 мг Никотиновая кислота 30 мг D-пантотеновая кислота Са 160 мг Фолиевая кислота 20 мг D-биотин 2 мг Витамин К * * В группе с низким содержанием витамина К, данный витамин не добавлялся. В контрольной диетической группе добавлялось 7,5 мг витамина К. В диетической группе, употребляющей МК-4, добавлялось 750 мг МК-4. Общее количество было изменено до 100 г при помощи сахарозы, в результате чего получалась витаминная смесь.

[0037]

В качестве метода разведения использовался метод подготовительного разведения, при котором у крыс был свободный доступ к еде и воде в течение 3-5 дней. Использовался имеющийся в продаже сухой корм (название продукции: MR Labostock by Nosan Corp.). В каждую экспериментальную группу входило четыре крысы, которые разводились колониями в клетке из проволочной сетки. После подготовительного разведения крыс кормили в соответствии с экспериментальными диетами и содержали в течение 35 дней со свободным доступом к еде и воде. Были взяты образцы крови, а семенники удалены.

[0038]

II. Измерение содержания витамина К

Подготовка образца измерения ВЭЖХ

Один грамм ткани был тщательно измерен и помещен в закрытую коричневую центрифужную пробирку. Было добавлено 2 мл 66% раствора изопропанола. Затем образец был гомогенизирован в гомогенизатор Политрон (Биотрон) на льду. Во время гомогенизации гомогенат, прикрепленный к оси, смывался 3 мл 66% раствора изопропанола и добавлялся к образцу. К 5 мл гексана добавлялся 1 мл раствора гексана, включая 9,96 нг/мл или 996 нг/мл МК-3, согласно внутреннему стандарту. Смесь перебалтывалась в течение пяти минут и извлекалась.

[0039]

Впоследствии смесь центрифугировалась (3000 оборотов в минуту при 4°С в течение 5 минут) и 5 мл верхнего слоя гексана отдельно помещалось в коричневую тестовую пробирку. Отделенный гексановый слой испарялся под пониженным давлением при помощи концентрирующей центрифуги. Высушенный, твердый гексановый слой снова растворялся в 2 мл гексана. Образец применялся к картриджу с диоксидом кремния Sep-pak (Waters Corp.), который предварительно очищался 10 мл раствора гексан-эфира (96:4, объем к объему) и 10 мл гексана.

[0040]

После того как картридж был очищен 10 мл гексана, в К-группах производилось промывание 5 мл раствора гексан-эфира (96:4, объем к объему). После того как смесь снова была высушена концентрирующей центрифугой, в остаток добавлялось 200 мкл (2 мл, если использовался стандарт 996 нг/мл МК-3) этанола, а остаток растворялся. Частицы удалялись 0,5 мкм фильтром (DISMIC03JP050AN, ADVANTEC). Профильтрованная смесь служила образцом измерения ВЭЖХ.

[0041]

Условия измерения ВЭЖХ

Гомологи витамина К в приготовленном образце ВЭЖХ являются нефлюоресцентными и окисленными. Группы с низким содержанием витамина К становились флюоресцентными, сокращенные виды в результате получения образца разделялись ВЭЖХ и использовался платиновый катализаторный стержень. Численность групп с низким содержанием витамина К определялась флюоресцентным методом сокращения ВЭЖХ, который измеряет интенсивность флюоресценции образца. Группы с низким содержанием витамина К определялись как относительная величина МК-3, которая являлась внутренним стандартом.

[0042]

Система измерения витамина К при помощи ВЭЖХ

Система измерения витамина К при помощи ВЭЖХ следующая:

Аппарат ВЭЖХ: Waters 600E System (Waters Corp.)

Стержень: Puresil C18, 5 мкм, 120А, 4.6 мм×50 мм (Waters Corp.)

Нагреватель стержня: Column Heater (Bio-Rad Laboratories)

Температура нагревателя стержня: 50°С

Редуктор: Platinum Reduction Column IRICA-RC-10-1 (IRICA Corp.)

Детектор флюоресценции: F-1000 (Hitachi, Ltd., длина волны детектирования экструзия 240 нм, эманация 430 нм)

Регистрирующий прибор: D-2000 (Hitachi, Ltd.)

Условия анализа: Подвижная фаза метанол-этанол (8:2), скорость потока 1.0 мл/мин

[0043]

В данном методе используется метод ВЭЖХ сокращения флюоресценции, при котором нефлюоресцентные, окисленные группы витамина К становились флюоресцентными, сокращенными типами в результате использования платинового катализаторного стержня. Была измерена интенсивность флюоресценции групп витамина К. Поэтому состояние, в котором при подвижной фазе растворялся кислород, негативно влияло на сокращение. Растворенный кислород удалялся ультразвуковыми волнами, заранее применяемыми к подвижной фазе под пониженным давлением. Газообразный азот (200 мл/мин или более) кипел в течение 2 часов до завершения измерения.

[0044]

III. Измерения РНК

Общая подготовка РНК

Примерно 0,1 г семенников каждой крысы был помещен в определенную пробирку. Один миллилитр ISOGEN (NIPPONGENE Co., Ltd.) был добавлен в семенники в качестве реактива, выделяющего РНК. Смесь была гомогенизирована в Политроновый гомогенизатор. Гомогенат был помещен в пробирку Эппендорфа и оставлен при комнатной температуре на 5 минут. Затем в гомогенат было добавлено 200 мкл хлороформа, и смесь была хорошо перемешана в течение 15 секунд с помощью прибора для встряхивания и перемешивания. Затем смесь была оставлена на 2-3 минуты, после чего ее подвергли центрифугированию (13000 оборотов в минуту при температуре 4°С в течение 15 минут), в результате которого она разделилась на 3 слоя. Был собран только верхний слой. 5000 мкл IPA было добавлено к верхнему слою. Смесь была немного взболтана в вертикальном направлении и оставлена на 10 минут.

[0045]

Смесь подвергли центрифугированию (13000 оборотов в минуту при температуре 4°С в течение 15 минут). Осадок, полученный в результате центрифугирования, был дважды смочен 1000 мкл и 500 мкл 75% этанола. Осадок был растворен в 300 мкл DEPC-dH₂O. Часть растворенного осадка была использована для измерения поглощаемости (260 нм м 280 нм) и электрофореза в агарозном геле (0,7% агарозного геля ТАЕ при 150 В в течение 35 минут). Была измерена чистота РНК и концентрация.

[0046]

кДНК. Подготовка посредством реакции обратной транскрипции

РНК, полученная от каждой отдельной крысы, была растворена с помощью DEPC-dH₂O до состояния 1 мкг/мкл. Раствор РНК был разделен на две ПЦР-пробирки таким образом, что каждая из них содержала 4 мкл раствора РНК. Одна пробирка была приготовлена для RT(-), куда не была добавлена обратная транскриптаза, другая для проверки того, был ли включен геном ДНК.

[0047]

Смесь 1 мкл Олигонуклеотида (dT)₂₀(50 мкМ) и 1 мкл 10 ммоль dNTPmix(dATP, dGTP, dCTP и dTTP) с 10 ммоль DEPC-dH₂O, была добавлена в каждую пробирку. Пробирки были установлены в термоциклер ПЦР (TaKaRa Bio Inc.) и нагревались при температуре 65°С в течение 5 минут.

[0048]

После нагревания они были помещены на лед, где находились более минуты, после чего циклометр остановили. Смесь, состоящая из 4 мкл 5х буфера для синтеза первой цепи, 1 мкл 0,1М DTT, 0,5 мкл RNase OUT и 0,5 мкл Super Script III (dH₂O было использовано для РТ(-)) была добавлена в каждую пробирку. Пробирки вновь были установлены в термоциклер, и была произведена реакция обратной транскрипции при температуре 50°С в течение 60 минут и при температуре 70°С в течение 15 минут. Таким образом, были получены образцы кДНК.

[0049]

Определенное количество ОТ-ПЦР

Раствор кДНК, подготовленный посредством реакции обратной транскрипции, который был растворен в соотношении 1 к 100, использовался как образец. SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time) (TaKaRa Bio Inc.) использовался как реагент.25 мкл SYBR Premix Ex Taq, 1 мкл Rox Reference Dye, 1,5 мкл каждого из растворов forward- и reverse-праймера и 17 мкл dH₂O было добавлено к 4 мкл образца или стандартного кДНК. 24 мкл раствора описанной выше реакции было добавлено в каждую из двух лунок оптической 96-луночной реакционной плашки для секвенатора MicroAmp, после чего плашку поместили в Систему обнаружения последовательностей ABI PRISM 7000.

[0050]

Был произведен 1 цикл реакции ПЦР при температуре 60°С в течение 2 минут, затем 1 цикл при температуре 95°С в течение 10 минут, и 50 циклов при температуре 95°С в течение 15 секунд, 60°С в течение 1 минуты. Таблица 2 показывает последовательности праймера (forward: последовательный номер 1, и reverse: последовательный номер 2), использованные в определенном количестве ОТ-ПЦР.

Таблица 2 Ген Уникальный номер в базе данных Genbank № Последовательность праймера P450scc АН002151 Forward GAGAAGCCTATCTTCTTCAACTTCCA (Сур11а)   Reverse TGCAGCCTGCAATTCATACAGT

[0051]

GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа) и эукариотические факторы инициации 1α1 (EF-1) в этом методе были использованы как внутренние стандартные гены экспрессии генов. Экспрессия каждого гена была вычислена путем деления экспрессии определенного гена на экспрессию внутреннего стандартного гена и была показана как относительные значения со значением контрольной диетной группы, равным 1.

[0052]

Измерение уровня протеина IV P450scc с помощью метода Вестерн блот

Образцы биологической ткани и антитела

Были использованы семенники каждой из описанных выше групп, которые хранились при температуре -80°С после удаления. Антитела anti-P450scc были приобретены в компании International, Inc.

[0053]

Подготовка гомогената ткани

0,2 г семенника, замороженного в 1 мл 1х фосфатно-солевого буферного раствора (PBS, включая 10 мкл 100 ммоль фенилметансульфонила фторида [ФМСФ]), было гомогенизировано в Политроновый гомогенизатор (биотрон). Поврежденные клетки были удалены путем центрифугирования со скоростью 3000 оборотов в минуту за 5 минут при температуре 4°С. Отстоявшийся слой жидкости семенника был собран в качестве гомогената ткани. Часть гомогената ткани была использована для определения количества протеина.

[0054]

Обработка образцов ДСН

Сто миллилитров 3× буферного раствора ДСН^(a) было добавлено к 200 мкл гомогената ткани, после чего образец был оставлен на 5 минут в кипящей водяной бане. Затем была произведена обработка ДСН.

[0055]

ДСН-ЭЛЕКТРОФОРОЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

Образец, по отношению к которому была применена обработка ДСН, был разбавлен 3× буферным раствором, в результате чего концентрация протеина составила 1 мкг/мкл. Затем 15 мкл образца было добавлено к полиакриламидному гелю^(b) и был осуществлен электрофорез ^(с) (100 В в течение 90 минут).

[0056]

Блоттинг

После электрофореза три листа 3MM(Whatman Ple), замоченных в буфере для блоттинга^(d), гель, ImmobilonTM (поливинилиденфторидная блоттинг-мембрана [Millipore Corporation], предварительно скорректированная метанолом и боттинг-мембраной) и три листа ЗММ были помещены на блокнот с промокательной бумагой со стороны анода и были обложены промокательной бумагой. Затем стек был помещен в блоттинговую ванну (Bio-Rad Laboratories), где был произведен боттинг (250 мА в течение 180 минут).

[0057]

Блокировка

После боттинга мембрана была промыта раствором TBS-T^(e) и помещена на час в TBS-T (раствор снятого молока), включая 5% снятое молоко.

[0058]

Реакция антител

Первоначальная реакция антител была произведена в течение часа в растворе снятого молока, включающем антитела anti-P450scc (1/5000). Вторая реакция антител была произведена в течение часа в растворе снятого молока, включающем антитела anti-Rabbit IgG-HRP (1/5000). Антитела anti-β-actin были использованы для контроля антител.

[0059]

Определение и анализ

Один миллилитр реагента для определения блоттинга ECLTM Western (Amersham Corp.) был вылит на всю мембрану. После этого мембрана была оставлена для реагирования на пять минут в темном месте. Люминесцентные сигналы собирались с помощью системы формирования изображения Las-1000 (Fujifilm Corp.), количество определялось с помощью программного обеспечения обработки изображения ImageGauge (торговая марка).

[0060]

(а) Буфер ДСН

70 ммоль Tris-HCl (pH 6,8), 33 ммоль NaCl, 1 ммоль Na2EDTA, 2% ДСН (w/v),

40 ммоль DTT, 0,01% бромфеноловый синий (w/v) и 10% глицерин

(b) Полиакриламидный гель

Растворяющий гель: 12,5% акриламид, 375 ммоль Tris-HCl (pH 8.8), 0.1%

ДСН, 0.05% TEMED и 0,075% APS (w/v)

Концентрирующий гель: 3,8% акриламид, 125 ммоль Tris-HCl (pH 6,8), 0,1%

SDS, 0,05% TEMED и 0,075% APS (w/v)

(c) Буфер электрофореза

25 ммоль трис, 0,19М глицерин и 0,1% ДСН (w/v)

(d) Буфер блоттинга

48 ммоль трис, 39 ммоль глицерин и 20% метанол

(e) Буфер TBS-T

0,1М Tris-HCl (pH 7,5), 0,37М NaCl и 0,5% Tween 20

[0061]

Качественный анализ протеина в гомогенате ткани

Концентрация протеина в гомогенате ткани была измерена по методу Брэдфорда. Двадцать миллилитров раствора соответствующим образом растворенного образца было помещено в пробирку Эппендорфа. Один миллилитр белкового спектра Bio-Rad, растворенного в пять раз, было добавлено к раствору образца и перемешано с помощью прибора для встряхивания и перемешивания. После того как раствор образца был оставлен при комнатной температуре на 5 минут, была измерена оптическая плотность при 595 нм. Бычий сывороточный альбумин (BSA) был использован в качестве калибровочной кривой.

[0062]

V. Измерение тестостерона

Для измерения был использован следующий набор.

Набор Testosterone EIA Kit (Cayman Chemical Co.)

[0063]

Подготовка образцов

Поскольку задерживающие спектр материалы могут быть включены в плазму и гомогенат семенника, стероидные гормоны были предварительно извлечены с помощью эфира.

[0064]

Извлечение из плазмы

0,5 миллилитров плазмы было помещено в тестовую пробирку. 0,5 миллилитров диэтилового эфира было добавлено в тестовую пробирку, после чего была произведено разделение при помощи центрифуги (3000 оборотов в минуту при 4°С за 5 минут). После был собран эфирный слой (верхний слой), образованный в результате центрифугирования, было вновь добавлено 2,5 мл диэтилового эфира в образец плазмы, и была произведена та же процедура.

[0065]

Собранный эфирный слой был высушен под воздействием вакуума посредством центробежного вакуумного концентратора (Taitec Corporation). Полученный концентрат был растворен в 0,5 мл буфера Е1А, входящего в набор. Растворенный концентрат служил образцом плазмы.

[0066]

Извлечение из семенников

100 миллиграмм ткани семенников было гомогенизировано в политроновом гомогенизаторе в процессе заморозки в 5 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Один миллилитр гомогената был помещен в тестовую пробирку. Пять миллилитров диэтилового эфира было добавлено в тестовую пробирку и перемешано в течение примерно одной минуты в приборе для встряхивания и перемешивания, одновременно выполняющем центрифугирование (3000 оборотов в минуту при 4°С в течение 5 минут).

[0067]

После был собран эфирный слой (верхний слой), образованный в результате центрифугирования, было вновь добавлено 5 мл диэтилового эфира в гомогенат семенников. Собранный эфирный слой был высушен под воздействием вакуума посредством центробежного вакуумного концентратора (Taitec Corporation). Полученный концентрат был растворен в 1 мл буфера EIA, входящего в набор. Растворенный концентрат служил образцом семенников.

[0068]

VI. Статистический анализ

После того как разница информации между группами была проверена при помощи однофакторного анализа отклонений, в отношении информации был произведен тест множественного сравнения Шеффе.

[0069]

На Фиг.1 показаны результаты анализа концентрации витамина К1 (право) и МК-4 (лево) в семенниках крыс, диета которых практически исключала витамин К из рациона, диета которых включала витамин К1 (0,75 мг/кг) и диета которых включала МК-4 (75 мг/кг) в течение 35 дней. Во всех случаях, как было подтверждено, витамин К в семенниках изменился на МК-4 независимо от диеты. Хотя не было замечено никакой значительной разницы между группой, диета которой практически исключала витамин К, и группой, диета которой включала небольшое количество витамина, концентрация МК-4 в группе с МК-4-диетой была значительно выше.

[0070]

На Фиг.2 показаны уровни экспрессии цитохрома P450scc иРНК, P450scc иРНК является генами стероидного гормона, полученного синтетическим путем. По сравнению с контрольной диетной группой и группой, употреблявшей МК-4, уровень экспрессии был немного ниже в группе, употреблявшей небольшое количество витамина К.

[0071]

На Фиг.3 показаны уровни протеина. Различия между контрольной диетной группой и группой, употребляющей небольшое количество витамина К, обнаружены не были. Однако уровень протеина был значительно выше в группе, употребляющей МК-4.

[0072]

Фиг.4 показывает концентрацию тестостерона в плазме. В сравнении с контрольной диетной группой концентрация тестостерона в плазме была значительно выше в группе, употреблявшей МК-4.

[0073]

Исходя из описанных выше результатов становится понятным, что уровень тестостерона в крови при употреблении витамина К увеличивается. Концентрация витамина К в контрольной группе является нормальной и может быть достигнута при обыкновенной диете. Предполагается, что уменьшение уровня тестостерона ввиду нехватки витамина К случается редко. С другой стороны, в результате того, что витамин К регулярно давался с пищей с целью открытия, уровень тестостерона в крови увеличился. По этой причине, когда уровень тестостерона в крови уменьшается по какой-либо причине, его можно увеличить, начав принимать витамин К.

Пример 2

Материалы и метод

Как и в Примере 1 экспериментальные животные и условия разведения были следующие: обыкновенные крысы (Wistar/Std, восьминедельные мужские особи), которые содержались в предназначенном для этого помещении при температуре 23°С, влажности 50±5% и при двенадцатичасовом суточном освещении, которое начиналось в 8:00 и заканчивалось в 20:00.

[0075]

В качестве экспериментальных диетических групп было назначено три группы.

1. Контрольная диетическая группа (добавление в пищу витамина К1 из расчета 0,75 мг/кг).

2. Диетическая группа, которая употребляет витамин К1 (добавление в пищу витамина К1 из расчета 75 мг/кг).

3. Диетическая группа, которая употребляет МК-4 (добавление в пищу менахинона-4 из расчета 75 мг/кг).

Витамин К1 был приобретен в компании Wako Pure Chemical Industries. Использовался менахинон-4 компании Nisshin Pharma Inc. Витамин К-1 или менахинон-4 добавлялись в каждой экспериментальной диете для достижения пропорций композиции, показанной в Таблице 1, и были равномерно перемешаны.

[0076]

Период разведения составлял 35 дней. Забор крови из вен производился каждую неделю в 18 часов. Производилось измерения веса, принимаемой диетической пищи, содержания витамина К в семенниках, концентрации тестостерона в семенниках, концентрации плазмы в семенниках. Метод анализа был схожим с тем, что применялся в Примере 1.

[0077]

Статистический анализ

Данные по концентрации витамина К в семенниках и концентрации тестостерона были проанализированы с помощью метода Тьюки. Периодический анализ изменений концентрации тестостерона в крови выполнялся при помощи двухфакторного анализа отклонений (периодического). Во всех случаях значительная разница составляла Р<0,05.

[0078]

Результаты

Различия в весе и приеме диетической пищи между контрольной диетической группой (добавление в пищу витамина К1 из расчета 0,75 мг/кг), группой, диета которой включала небольшое количество витамина К, и группой, диета которой включала МК-4, не обнаружены.

[0079]

Фиг.7 показывает результаты концентрации витамина К в семенниках (справа витамин К1, слева МК-4). Концентрация МК-4 в семенниках значительно увеличилась в группе, диета которой включала витамин К1, и в группе, диета которой включала МК-4. Предполагается, что витамин К1 сохранялся в организме в виде МК-4.

[0080]

Фиг.8 показывает изменения значений тестостерона в крови. Значения тестостерона в крови для группы, диета которой включала витамин К1, не отличалось от значения контрольной диетической группы на 4 и 5 недель. На 2 и 3 недели значения тестостерона в крови группы, диета которой включала витамин К1, было выше, чем у контрольной группы. Когда был произведен полный двухфакторный анализ отклонений, значительная разница составила Р<0.01.

[0081]

Фиг.9 показывает результаты концентрации тестостерона в семенниках. Значения тестостерона были выше и в группе, диета которой включала витамин К1, и в группе, которая принимала МК-4.

[0082]

Исходя из описанных выше результатов становится понятным, что витамин К1 и К2 (менахинон-4) увеличивает уровень тестостерона в крови и семенниках. Назначение витамина К2 является предпочтительным, поскольку изменения в весе и приеме пищи незаметны. Повышение уровня тестостерона с помощью витамина К можно назвать чрезвычайно безопасным методом.

[0083]

Предпочтительный способ применения изобретения был подробно описан выше. Однако подразумевается, что возможны изменения в объеме изобретения и его направленности, которые могут быть внесены специалистом в этой области, принимая во внимание раскрытие в приложении.

Случаи применения изобретения

1. Усилитель выработки тестостерона, включающий витамин К в качестве активного ингредиента.

2. Усилитель выработки тестостерона согласно описанному выше пункту 1, в котором содержание витамина К составляет 0,0001% по весу к 100% по весу.

3. Усилитель выработки тестостерона согласно описанному выше пункту 1, в котором описанный выше витамин К является витамином К2.

4. Усилитель выработки тестостерона согласно описанному выше пункту 1, в котором витамин К является менахиноном-4 и/или менахиноном-7.

5. Лекарства, которые предотвращают появление и/или лечат симптомы или заболевания, вызванные снижением тестостерона, созданные на основе усилителя выработки тестостерона, который включает витамин К в качестве активного ингредиента.

6. Лекарства согласно описанному выше пункту 5, в которых симптомы и заболевание проявляются в истощении мышц, нарушении когнитивных функций, концентрации, мотивации, гибкости кровеносных сосудов, метаболизма жидкости, репродуктивных функций, мужских сексуальных функций и мочеиспускания.

7. Добавки, диетическая пища, пищевые продукты, содержащие добавки, которые содержат усилитель тестостерона, включая витамин К в качестве активного ингредиента.

8. Добавки, диетическая пища, пищевые продукты, содержащие добавки, согласно описанному выше пункту 7, используемые для предотвращения, облегчения или лечения состояния при истощении мышц, нарушении когнитивных функций, концентрации, мотивации, гибкости кровеносных сосудов, метаболизма жидкости, репродуктивных функций, мужских сексуальных функций и мочеиспускания.

9. Метод предотвращения, облегчения и/или лечения симптомов или заболевания, вызванных снижением тестостерона, включающий применение эффективной дозы усилителя выработки тестостерона, содержащей витамин К в качестве активного ингредиента.

10. Метод согласно описанному выше пункту 9, в котором содержание витамина К составляет 0,0001% по весу к 100% по весу.

11. Метод согласно описанному выше пункту 9, в котором витамин К является витамином К2.

12. Метод согласно описанному выше пункту 9, в котором витамин К является менахиноном-4 и/или менахиноном-7.

13. Метод согласно описанному выше пункту 9, в котором симптомы и заболевание проявляются в истощении мышц, нарушении когнитивных функций, концентрации, мотивации, гибкости кровеносных сосудов, метаболизма жидкости, репродуктивных функций, мужских сексуальных функций и мочеиспускания.

14. Использование витамина К для производства усилителя тестостерона, который предотвращает, облегчает и/или лечит симптомы или заболевание, вызванное снижением тестостерона.

15. Использование согласно описанному выше пункту 14, в котором содержание витамина К составляет 0,0001% по весу к 100% по весу.

16. Использование согласно описанному выше пункту 14, в котором витамин К является витамином К2.

17. Использование согласно описанному выше пункту 14, в котором витамин К является менахиноном-4 и/или менахиноном-7.

18. Использование согласно описанному выше пункту 14, в котором симптомы и заболевание проявляются в истощении мышц, нарушении когнитивных функций, концентрации, мотивации, гибкости кровеносных сосудов, метаболизма жидкости, репродуктивных функций, мужских сексуальных функций и мочеиспускания.

Изобретение относится к усилителю тестостерона, к лекарственному препарату, который предотвращает, ослабляет и/или лечит симптомы или заболевания, вызванные недостатком тестостерона, и к добавке для лечения климактерического расстройства у мужчин. В качестве активного ингредиента используется витамин К (витамин К2, манахинон-4 или менахинон-7) в дозировках от 10 мкг до 100 мг. Заявленные изобретения повышают уровень эндогенного тестостерона. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 табл., 9 ил.

1. Усилитель тестостерона, включающий витамин К в диапазоне от 10 мкг до 100 мг в качестве активного ингредиента.

2. Усилитель тестостерона по п.1, отличающийся тем, что витамин К является витамином К2.

3. Усилитель тестостерона по п.1, отличающийся тем, что витамин К представляет собой менахинон-4 и/или менахинон-7.

4. Лекарственный препарат, который предотвращает, ослабляет и/или лечит симптомы или заболевания, вызванные недостатком тестостерона, изготовленный из усилителя тестостерона, включающего витамин К в диапазоне от 10 мкг до 100 мг в качестве активного ингредиента.

5. Добавка для лечения климактерического расстройства у мужчин, которая содержит усилитель тестостерона, включающий витамин К в диапазоне от 10 мкг до 100 мг в качестве активного ингредиента.