СОСТАВЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ЛИПИДОПОНИЖАЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2011 года по МПК A61K31/00 A61K31/66 A61K31/662 A61K31/355 A61K31/375 A61P3/10 A61P3/06 A61P9/00 A61P9/10 

Изобретение относится к терапии, в которой используется способность модифицированных агентов электронного переноса снижать уровни циркуляции в крови одного или более из следующих липидов: холестерин с липопротеином низкой плотности, триглицериды и общий холестерин.

Те места данного описания изобретения, где упоминаются или обсуждаются документ, акт или источник информации, не предполагают допущения, что такой документ, акт или источник информации или любая их комбинация были на дату приоритета общедоступны, широко известны или связаны с попыткой решить какую-либо проблему, касающуюся предмета настоящего описания изобретения.

Хотя следующее ниже описание относится к сердечно-сосудистым заболеваниям, следует понимать, что оно носит лишь иллюстративный характер и что изобретение не ограничивается сердечно-сосудистыми заболеваниями, но относится к любым состояниям, при которых повышено содержание липидов.

Сердечно-сосудистые заболевания, куда входят болезни сердца и инсульты, являются причиной смерти номер один в западных обществах. Представляется, что это обусловлено рядом факторов, в том числе избыточным разрастанием клеток гладких мышц сосудов, повышенным уровнем общего холестерина и холестерина с липопротеином низкой плотности (ЛНП). Хотя в этих случаях рекомендуются, прежде всего, изменения образа жизни, включая диету и физические упражнения, лекарственная терапия не только используется, но часто бывает необходимой.

Хотя часто думают, что сердечные и сердечно-сосудистые заболевания - это одно и то же, они различны и затрагивают разные части тела. Сердечные заболевания включают только заболевания сердца и находящейся в нем кровеносной системы. Сердечно-сосудистые заболевания включают заболевания сердца и заболевания кровеносных сосудов (артерий, капилляров, вен) во всем организме человека, например, в мозгу, ногах, легких.

Сердце представляет собой мощный мышечный насос размером чуть больше кулака. Оно непрерывно прокачивает кровь через сердечно-сосудистую систему, сеть эластичных трубок, разносящих кровь по всему телу. Сердечно-сосудистая система включает два крупных органа - сердце и легкие, а также кровеносные сосуды (артерии, капилляры и вены). Артерии и капилляры разносят кислород и богатую питательными веществами кровь от сердца и легких по всем частям тела. Вены несут обедненную кислородом и питательными веществами кровь обратно к сердцу и легким. Проблемы с сердцем и кровеносными сосудами возникают не сразу. Со временем артерии, транспортирующие кровь к мозгу и легким, могут сужаться вследствие нарастания клеток, отложений жира и холестерина (бляшки). Сниженный ток крови к сердцу вследствие снижения проходимости артерий вызывает сердечные приступы. Ухудшенное кровоснабжение мозга вследствие сгустка крови или кровоизлияние из разорванного кровеносного сосуда вызывает инсульт.

Существует много форм сердечных и сердечно-сосудистых заболеваний; ниже перечисляются наиболее распространенные из них.

- Ишемическая болезнь сердца (или болезнь коронарной артерии).

- Стенокардия.

- Инсульт.

- Высокое кровяное давление (или гипертензия).

- Сердечная недостаточность.

Существует множество факторов, которые могут стать для человека факторами риска сердечных и сердечно-сосудистых заболеваний. Чем больше у человека факторов риска (или факторов, которые усиливают риск), тем больше вероятность развития сердечного или сердечно-сосудистого заболевания.

Эти факторы включают следующее:

- возраст;

- курение (активное или пассивное);

- высокое кровяное давление;

- высокое содержание холестерина в крови;

- малоподвижность;

- избыточный вес тела; и

- диабет.

Некоторые факторы не поддаются контролю, например возраст, наследственность, раса. Однако можно контролировать три самых серьезных фактора риска для сердечных и сердечно-сосудистых заболеваний: курение, высокое кровяное давление и высокое содержание холестерина в крови. Соблюдение диеты с низким содержанием насыщенных жиров и холестерина, а также регулярные физические упражнения весьма полезны для здоровья. Они снизят кровяное давление и будут удерживать содержание сахара и холестерина в крови на низком уровне.

Холестерин представляет собой жирное вещество, которое вырабатывается печенью и которое можно обнаружить во всех частях организма. Организм использует холестерин для построения клеточных мембран, выработки гормонов, витамина D и желчных кислот, которые помогают переваривать жир. Для всех этих нужд необходимо лишь небольшое количество холестерина в крови, и печень создает весь холестерин, в котором нуждается организм.

Холестерин накапливается также из пищи. Потребление слишком большого количества холестерина с животной пищей, такой как мясо, цельномолочные продукты, яичные желтки, птица и рыба, может повышать уровень холестерина. Однако насыщенные жиры в питании являются главной причиной повышения уровня холестерина.

Холестерин транспортируется кровью в виде липопротеинов. Имеется два типа липопротеинов: липопротеин низкой плотности (ЛНП) и липопротеин высокой плотности (ЛВП). ЛНП часто называют "плохим" холестерином, так как он может откладываться и блокировать артерии, несущие кровь к сердцу. ЛВП известен как "хороший" холестерин, так как он помогает удалять холестерин из крови, предотвращая его отложение и закупорку артерий.

При необходимости вместе с изменением образа жизни используются лекарства. Основной целью лечения, направленного на снижение уровней холестерина, является снижение уровней ЛНП (плохого холестерина) до такой степени, чтобы уменьшить риск заболевания сердца или сердечного приступа. Существует несколько типов лекарств для снижения холестерина, в том числе статины, усилители экскреции желчных кислот, никотиновая кислота и фибраты. Каждый класс лекарств имеет свои преимущества, побочные эффекты и недостатки.

Хотя все эти понижающие холестерин лекарства очень важны для уменьшения риска заболеваний сердца, у всех у них есть и обратная сторона: когда желаемый уровень холестерина достигнут, для его поддержания необходимо продолжать принимать эти лекарства постоянно.

Существует потребность в фармакологической субстанции, которую можно было бы использовать для снижения уровня липидов, которая имела бы меньше побочных эффектов, чем существующие лекарства, и которая не приводила бы к необходимости принимать лекарство до бесконечности.

Токоферол

Повышенная заболеваемость ишемической болезнью сердца связывается с низкими уровнями α-токоферола (витамина E). И наоборот, было показано, что увеличенный прием α-токоферола оказывает защитное действие против заболеваний сердца. Поскольку витамин E является антиоксидантом, то, как представляется, он воздействует на причину атеросклероза, предотвращая окисление ЛНП. Были также проведены исследования потенциальных неантиоксидантных механизмов витамина Е, которые могли бы предотвратить образование атеросклеротических бляшек. Такие возможности включают ингибирование разрастания клеток гладких мышц, сохранение эндотелиальной функции, ингибирование моноцито-эндотелиальной адгезии, ингибирование моноцито-реактивных видов кислорода и высвобождения цитокина, а также ингибирование адгезии и агрегации тромбоцитов. Однако клинические испытания витамина Е не выявили однозначно его пользы при лечении атеросклероза. Поэтому существующие в настоящее время добавки с витамином Е не являются полезным клиническим вариантом лечения атеросклероза.

В международной заявке WO 03/026673 указывается, что увеличенные уровни накопления витаминов, в том числе токоферилфосфата, могут быть полезными для облегчения симптомов или лечения воспалительных состояний, таких как ишемическая болезнь сердца, атеросклероз и диабет. Однако в этом документе не говорится о снижении уровней липидов, таких как холестерин, в крови. Процесс воспаления затрагивает сложную систему метаболических путей, и это не всегда пути метаболизма липидов, усвоения холестерина и т.д.

Кроме того, токоферилфосфат описывается в международной патентной заявке № WO 2004/064831 как обладающий свойствами ингибирования распространения моноцитов/макрофагов, разрастания клеток гладких мышц, экспрессии рецепторов CD36 и усвоения окисленных ЛНП. Однако в этом документе не говорится о снижении уровней липидов, таких как холестерин. Проведено множество исследований, которые показали, что CD36 стимулирует изменения под действием белков, которые накапливаются при болезни Альцгеймера и атеросклерозе. Эти процессы не имеют ничего общего с метаболизмом липидов. Лекарства для лечения малярии и болезни Альцгеймера направлены на экспрессию CD36, но не изменяют профилей липидов.

Сущность изобретения.

Установлено, что фосфатные производные агентов электронного переноса более эффективны, чем нефосфорилированные агенты электронного переноса, для снижения содержания в крови одного или более из следующих липидов:

- ЛНП-холестерин,

- триглицериды, и

- общий холестерин.

Согласно первому аспекту изобретения предлагается терапия для снижения содержания в крови липидов, выбранных из группы, состоящей из ЛНП-холестерина, триглицеридов, общего холестерина и их смесей, включающая введение эффективного количества одного или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса.

Специалисты поймут, что терапия, соответствующая изобретению, будет полезна при терапевтическом лечении заболеваний, которые связаны с повышенным содержанием в крови одного или более из следующих липидов: ЛНП-холестерин, триглицериды и общий холестерин. Примерами таких заболеваний являются, но не ограничительно, ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, сахарный диабет, хроническая почечная недостаточность, первичные и вторичные гиперлипемии и дислипемия, ретинопатии, увеличение печени и селезенки и ксантомы.

Таким образом, изобретение включает терапию для облегчения симптомов, лечения или предупреждения заболевания, выбранного из группы, состоящей из ишемической болезни сердца, атеросклероза, сахарного диабета, хронической почечной недостаточности, первичных и вторичных гиперлипемий и дислипемии, ретинопатий, увеличения печени и селезенки, ксантом и их комбинаций, включающую введение фармацевтического состава, содержащего эффективное количество одного или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса, субъекту, у которого имеется такое заболевание или риск развития такого заболевания.

Еще в одном аспекте изобретения предлагается фармацевтический состав, используемый для снижения содержания в крови липидов, выбранных из группы, состоящей из ЛНП-холестерина, триглицеридов, общего холестерина и их смесей, содержащий эффективное количество одного или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса.

Еще в одном аспекте изобретения предлагается использование эффективного количества одного или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса вместе с соответствующим наполнителем или разбавителем при изготовлении лекарственного средства для снижения содержания в крови липидов, выбранных из группы, состоящей из ЛНП-холестерина, триглицеридов, общего холестерина и их смесей.

Еще в одном аспекте изобретения предлагается терапия для снижения содержания в крови липида, выбранного из группы, состоящей из ЛНП-холестерина, триглицеридов, общего холестерина и их смесей, включающая доставку эффективного количества одного или более фосфатных одного или более производных агентов электронного переноса. В одном из вариантов осуществления этого аспекта изобретения эффективное количество одного или более фосфатных одного или более производных агентов электронного переноса доставляется в виде пролекарства.

Субъект предпочтительно является животным, более предпочтительно человеком.

Термин "эффективное количество" в том смысле, в каком он здесь используется, обозначает количество, достаточное для снижения уровней в циркулирующей крови одного или более из следующих липидов: ЛНП-холестерин, триглицериды и общий холестерин. Специалист поймет, что это количество будет различным для различных пациентов; оно обычно определяется из опыта клинического введения лекарства различным пациентам.

Термин “агент электронного переноса” в данном документе обозначает класс химических соединений, которые могут быть фосфорилированы и которые (в нефосфорилированном виде) могут принимать электрон с образованием относительно стабильного молекулярного радикала или принимать два электрона, что позволяет соединению участвовать в обратимой окислительно-восстановительной системе. Среди примеров классов агентов электронного переноса, которые могут быть фосфорилированы, можно назвать гидроксихроманы, в том числе альфа-, бета, гамма- и дельта-токолы в энантиомерной и рацемической форме; хинолы, которые являются восстановленными формами витамина К1 и убихинона; гидроксикаратиноиды, в том числе ретинол; кальциферол и аскорбиновую кислоту. Предпочтительно агент электронного переноса выбирается из группы, состоящей из токоферола и других токолов, ретинола, витамина К1 и их смесей.

Более предпочтительно агент электронного переноса выбирается из группы, состоящей из токолов и их смесей. Токолы включают все изомеры производных 6:гидрокси 2:метилхромана (структурная формула приводится ниже), где R₁, R₂ и R₃ могут быть водородом или метильными группами, то есть производными α-5:7:8-триметила, β-5:8-диметила, γ-7:8-диметила и δ-8-метила. У токоферолов R4 замещен 4:8:12-триметилтридецильной группой, включая различные стереоизомеры и оптические изомеры (хиральные центры обозначены *). У токотриенолов R4 замещен 4:8:12-триметилтридека-3:7:11-триеновой группой, а позиция 2 может быть стереоактивной, например, она может быть занята стереоизомерами R или S. Наиболее предпочтительно агент электронного переноса выбирается из группы, состоящей из α-токоферола, δ-токоферола, γ-токоферола, α-токотриенола, δ-токотриенола, γ-токотриенола и их смесей

Термин "фосфатные производные" используется здесь для обозначения соединений, ковалентно связанных посредством кислорода с атомом фосфора фосфатной группы, так что образуется связь углерод - кислород - фосфор. Атом кислорода, как правило, берется из гидроксильной группы агента электронного переноса. Этот термин охватывает кислотные формы фосфорилированных агентов электронного переноса, соли фосфатов, в том числе металлические соли, например, натриевые, магниевые, калийные и кальциевые, а также любые другие производные, в которых протон фосфата заменен на другие заместители, такие как этильные либо метильные группы или фосфатидильные группы. Термин включает смеси фосфатных производных, особенно полученные в результате реакций фосфорилирования, а также каждое из фосфатных производных по отдельности. Например, термин включает смесь монотокоферилфосфата (TP) и дитокоферилфосфата (T2P), а также TP и T2P по отдельности. Смеси, пригодные для использования, описаны в международной патентной заявке № PCT/AU01/01475.

Предпочтительно одно или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса выбирается из группы, состоящей из монотокоферилфосфата, дитокоферилфосфата, монотокотриенилфосфата, дитокотриенилфосфата и их смесей. В одном предпочтительном варианте изобретения одно или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса представляет собой смесь, состоящую из одного или более из следующих соединений: монотокоферилфосфат, дитокоферилфосфат, монотокотриенилфосфат и дитокотриенилфосфат.

В некоторых ситуациях возникает необходимость использовать такое фосфатное производное, как фосфатид, обладающий дополнительными свойствами, например лучшей растворимостью в воде. Фосфатидильные производные являются аминоалкильными производными органических фосфатов. Эти производные можно получить из аминов, имеющих структуру R₁R₂N(CH₂)_nOH, где n - целое число от 1 до 6, а R₁ и R₂ могут представлять собой либо H, либо короткие алкильные цепи с 3 или менее атомами углерода. R₁ и R₂ могут быть одинаковыми или различными. Фосфатидильные производные получают путем замещения гидроксильного протона агента электронного переноса фосфатом, который затем реагирует с амином, таким как этаноламин или N,N'-диметиламин, с образованием фосфатидильного производного агента электронного переноса. В одном из методов получения фосфатидильных производных используется основный растворитель, такой как пиридин или триэтиламин с хлорокисью фосфора, для получения промежуточного соединения, которое затем реагирует с гидроксигруппой амина с образованием соответствущего фосфатидильного производного, такого как дигидрофосфат Р-холила Р-токоферила.

В некоторых ситуациях, если требуются дополнительные свойства, такие как повышенная стабильность или улучшенная доставка, могут использоваться также комплексы фосфатных производных агентов электронного переноса. Термин "комплексы фосфатных производных" обозначает продукт реакции одного или более фосфатных производных агентов электронного переноса с одним или несколькими комплексообразующими агентами, выбранными из группы, включающей амфотерные поверхностно-активные вещества, катионные поверхностно-активные вещества, аминокислоты с азотными функциональными группами, а также белки, богатые такими аминокислотами, как описано в международной патентной заявке № PCT/AU01/01476, включенной в данный документ путем отсылки. Примерами белков, богатых такими аминокислотами, являются белки, в которых по крайней мере 1 из 62 аминокислот является аргинином, или по крайней мере 1 из 83 - гистидином, или по крайней мере 1 из 65 - лизином, например различные формы белкового казеина. Другие примеры включают инсулин, паратиреоидный гормон (ПТГ), глюкагон, кальцитонин, адренокортикотропный гормон (АКТГ), пролактин, интерферон-α и -β и -γ, лютеинизирующий гормон (ЛГ) (известный также под названием гонадолиберин), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) и колониестимулирующий фактор (КСФ). Аминокислотный состав большинства из этих веществ приведен в таблице.

Аминокислоты в белке Аминокислоты Отношение к суммарным аминокислотам Инсулин 110   арг. 5 1 к 22 гис. 2 1 к 55 лиз. 2 1 к 55       ПТГ 84   арг. 5 1 к 17 гис. 0 0 лиз. 5 1 к 17       Глюкагон 180   арг. 16 1 к 11 гис. 4 1 к 45 лиз. 10 1 к 18       Кальцитонин 93   арг. 6 1 к 16 гис. 3 1 к 31 лиз. 5 1 к 19       АКТГ 41   арг. 3 1 к 14 гис. 1 1 к 41 лиз. 4 1 к 10       Пролактин 220   арг. 12 1 к 18 гис. 9 1 к 13 лиз. 11 1 к 11 Интерферон - альфа и бета 133   арг. 7 1 к 19 гис. 2 1 к 83 лиз. 7 1 к 19       Интерферон - гамма 166   арг. 8 1 к 21 гис. 2 1 к 83 лиз. 21 1 к 8

ЛГ 92   арг. 5 1 к 18 гис. 2 1 к 46 лиз. 7 1 к 13       ФСГ 129   арг. 5 1 к 26 гис. 2 1 к 65 лиз. 9 1 к 14       КСФ 144   арг. 6 1 к 24 гис. 3 1 к 48 лиз. 6 1 к 24       Гормон роста домен AOD9604 16   арг. 2 1 к 8

Предпочтительные комплексообразующие агенты выбираются из группы, состоящей из аргинина, лизина и третично-замещенных аминов, например, следующей формулы:

NR¹R²R³

где R¹ выбирается из группы, включающей смешанные алкильные радикалы с прямой или разветвленной цепью от С6 до С22 и их карбонильные производные;

R² и R³ независимо выбираются из группы, содержащей H, CH₂COOX, CH₂CHOHCH₂SO₃X, CH₂CHOHCH₂OPO₃X, CH₂CH₂COOX, CH₂CH₂CHOHCH₂SO₃X или CH₂CH₂CHOHCH₂OPO₃X, причем X представляет собой H, Na, K или алканоламин, при условии, что R² и R³ оба не являются H; и

где, если R1 представляет собой RCO, то R² может быть CH₃, а R³ может быть (CH₂CH₂)N(C₂H₄OH)-H₂CHOPO₃, либо R² и R³ вместе могут быть N(CH₂)₂N(C₂H₄OH)CH₂COO-.

Предпочтительные комплексообразующие агенты включают аргинин, лизин или лаурилиминодипропионовую кислоту, где комплексообразование происходит между основным центром на азоте и сложным эфиром фосфорной кислоты с образованием стабильного комплекса.

Фосфатное производное агента электронного переноса может вводиться животным или людям в виде различных лекарственных, таких как пищевые добавки, энтеральное питание, парентеральные лекарственные формы, суппозитории, пероральные лекарственные формы, формы для пульмональной и назальной доставки, для чрескожной доставки, включая накладки и кремы.

Например, фосфатное производное агента электронного переноса может вводиться в лекарственной форме для перорального или парентерального применения. Такие формы включают таблетки, порошки, жевательные таблетки, капсулы, пероральные суспензии, суспензии, эмульсии или жидкости, детские составы, энтеральное питание, нутрацевтики и функциональное питание.

Лекарственная форма может содержать любые добавки, обычно используемые в приготовлении этой лекарственной формы, такие как крахмал или полимерные связующие, подсластители, красящие вещества, эмульгаторы, покрытия и т.п. Другие возможные добавки очевидны для специалистов в этой области.

В одном варианте осуществления изобретения лекарственная форма имеет энтеросолюбильное покрытие, как описано в международной заявке PCT/AU01/01206, включенной в данный документ путем отсылки.

В другом варианте лекарственная форма является составом для местного применения, как описано в международной заявке PCT/AU02/01003, включенной в данный документ путем отсылки.

Лекарственная форма может содержать другие фармацевтические соединения, которые не препятствуют действию фосфатных производных агентов электронного переноса. Другое фармацевтическое соединение может вводиться до, совместно или после введения одного или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса. Предпочтительно другими фармацевтическими соединениями являются лекарства от сердечных и сердечно-сосудистых заболеваний, а также средства, применяемые при гиперхолестеринемии или дислипемии. Более предпочтительно другие соединения выбираются из группы, состоящей из ингибиторов абсорбции холестерина, таких как эзетимиб, ингибиторов белка переноса эфира холестерина, таких как торцетрапиб, других повышающих ЛВП фармацевтических соединений, статинов, фосфатных производных статинов и их смесей. Примерами пригодных для такого применения статинов являются провастатин, ловастатин и аторвастатин и их фосфаты.

Предпочтительно субъект является животным. Более предпочтительно животное является млекопитающим. Наиболее предпочтительно млекопитающее является человеком.

Чертежи.

Далее будут описаны различные варианты/аспекты изобретения со ссылками на следующие чертежи, на которых:

Фиг.1 - результаты примера 1 через 2 недели.

Фиг.2 - результаты примера 1 через 4 недели.

Фиг.3 - результаты примера 2.

Примеры

Далее будут описаны различные варианты/аспекты изобретения на примерах, не носящих ограничительного характера.

Пример 1

В этом примере оцениваются потенциальные эффекты токоферилфосфатной смеси при лечении сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) на признанной модели мыши с ССЗ, т.е. мыши с алипопротеином Е (APOE). Эти эффекты оценивались по снижению повышенных уровней холестерина, триглицерида и ЛНП в плазме.

Модель мыши APOE широко используется в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний, так как она имитирует многие из свойств, наблюдаемых клинически в заболеваниях человека. Мышь APOE имеет повышенные уровни липидов в крови примерно с 6-месячного возраста. Помещение этих животных на диету с высоким содержанием жира и холестерина (т.е. 21% жира, 0,15% холестерина) усугубляет ССЗ, и поэтому симптомы заболевания наблюдаются раньше.

Методики

Животные: Самцы модельной мыши APOE (15-20 г) были получены из Центра исследований на животных, Перт, Австралия. Их кормили лишенной витамина Е диетой, которая содержала 21% жира и 0,15% холестерина; это были гранулы для грызунов фирмы Glen Forrest Stockfeeders, Западная Австралия. Мышей держали в стандартных лабораторных клетках с естественным освещением; их акклиматизация проводилась в течение 7 дней перед использованием.

В данном исследовании мыши APOE получали диету с высоким содержанием жира и холестерина в течение 8 недель. Через 4 недели такой диеты животным давали ежедневно через желудочный зонд, с наполнителем (карбоксиметилцеллюлоза - КМЦ), токоферолацетат (TA) в дозе 100 мг/кг или смесь TP mixture (TPm) в дозе 33,25; 66,5 или 133 мг/кг. Для оценки каких-либо улучшений в течении ССЗ этих мышей у них забирали кровь с регулярными интервалам в течение курса лечения и определяли уровни липидов, а также в конце периода лечения рассекали дугу аорты для оценки образования бляшек.

Реагенты:

Токоферолацетат (TA) (Sigma, № по каталогу T-3001)

Смесь токоферилфосфатов (TPm), содержащая монотокоферилфосфат и дитокоферилфосфат в соотношении 2:1 (приготовлена самостоятельно, партия № SGNaTPm/21-10-04)

Карбоксиметилцеллюлоза (Sigma, № по каталогу C-5678)

Вода в милликоличествах (внутренняя поставка)

Приготовление состава: Растворы TPm и TA в 1% карбоксиметилцеллюлозе (КМЦ) приготавливались в следующих концентрациях: для TA 15 мг/мл, для TPm 4,99; 9,98 и 19.95 мг/мл, чтобы мыши получали дозу TA 100 мг/кг и дозу TPm 33,25; 66,5 и 133 мг/кг, соответственно. При приготовлении этих растворов соответствующее количество каждого соединения разводилось в 1% КМЦ и затем помещалось в ванну, наполненную теплой водой (около 50°C), с ультразвуковым диспергатором на 15 минут. (Доза TPm 133 мг/кг используется в качестве дозы, эквивалентной 100 мг/кг TA. Следовательно, последующие дозы 66,5 и 33,25 мг/кг составляют 50 и 25% эквивалентных доз TA 100 мг/кг соответственно).

Дозирование: Мышей еженедельно взвешивали и на основе этого взвешивания рассчитывали дозы каждого соединения на эту неделю. Препараты вводили животным каждое утро в течение периода лечения между 7:30 и 11:00 утра с помощью зонда из нержавеющей стали.

Забор крови: В 3 случаях мышей жестко обездвиживали, делали надрез на хвосте и забирали около 59 мкл крови в пробирки Capiject™. Затем пробирки центрифугировали при 8000×g и собирали плазму для анализа на липиды (т.е. общий холестерин, триглицериды, ЛВП и ЛНП; анализы проводились фирмой Gribbles Pathology).

У мышей брали кровь перед началом исследования, через 4 недели пребывания на соответствующей диете (до начала лечения препаратами) и через 2 недели периода лечения. В конце периода лечения кровь у животных забирали прямо из сердца после их умерщвления путем асфиксии с помощью CO₂. У мышей APOE, получавших диету с высоким содержанием жиров и холестерина, за период такого кормления в 2-3 раза повышалось содержание холестерина, ЛНП и триглицерида в плазме. Этот уровень рассматривался как очень высокий, поскольку у этих мышей и так был высокий уровень липидов в крови, взятой натощак, еще до того, как их посадили на атерогенную диету. Это представлялось хорошей отправной точкой для оценки эффективности TPm в снижении этих повышенных уровней липидов.

Анализ триглицерида в плазме: При измерении триглицерида в плазме использовался набор для определения триглицеридов (Sigma, № по каталогу TR0100). Процедура включает ферментный гидролиз триглицеридов липазой с образованием глицерина и свободных жирных кислот. Затем образовавшийся глицерин измеряют посредством представленных ниже сопряженных ферментных реакций:

Липопротеин-липаза Триглицериды -----------------> Глицерин+Жирные кислоты Глицерокиназа Глицерин+ATФ ---------------> Глицерин -1-фосфат+AДФ Глицерофосфат-оксидаза Глицерин-1-фосфат -------> Дигидроацетонфосфат+H₂O₂ Пероксидаза H₂O₂+4-аминоантипирин+натрий-N-этил-N-(3-сульфопропил) m-анисидин --------------> Хинониминовый краситель+H₂O

Реагенты в наборе подготавливаются согласно указаниям изготовителя. Свободный глицерин (реагент-стандарт) и пробы подогреваются до комнатной температуры. Приготавливается набор кювет для стандарта, контроля и проб. В каждую кювету добавляется 0,8 мл свободного глицерина-реагента, затем 10 мкл воды, глицеринового стандарта или плазмы соответственно. Образцы перемешиваются переворачиванием и инкубируются при 37°C в течение 5 минут. Затем замеряется поглощательная способность на 540 нм, которая записывается как исходное поглощение (ИП). Затем в каждую кювету добавляется 0,2 мл триглицерида-реагента, снова производится перемешивание путем перевертывания и инкубирование в течение еще 5 минут при 37°C. После этого измеряется и записывается конечная поглощательная способность (КП) на 540 нм. Затем рассчитывается общая концентрация триглицерида в плазме по следующей формуле:

Анализ холестерина в плазме: Измерение холестерина в плазме производилось с помощью набора реагентов для определения холестерина Infinity™ (Thermo Electron Corp., №по каталогу TR13521). Определение основано на следующих реакциях:

Холестерин-эстераза Холестериновые эфиры ----------------> Холестерин+Жирные кислоты Холестерин-оксидаза Холестерин+O₂ ------------------------> Холест-4-ен-он+H₂O₂ Пероксидаза 2H₂O₂+Гидробензойная кислота+4-аминоантипирин -----> Хинониминовый краситель+4H₂O

(1). Холестериновые эфиры ферментативно гидролизуются холестерин-эстеразой с образованием холестерина и свободных жирных кислот.

(2). Затем свободный холестерин, включая тот, что присутствовал изначально, окисляется холестерин-эстеразой с образованием холест-4-ен-3-она и перекиси водорода.

(3). Перекись водорода соединяется с гидробензойной кислотой и 4-аминоантипирином, образуя хромофор (хинониминовый краситель), который можно количественно измерить на длине волны 500-550 нм.

Плазму инкубируют с холестеролом-реагентом Cholesterol Reagent™ (1:100). Например, пробу объемом 3 мкл инкубируют с 300 мкл реагента Cholesterol Reagent™ в пластине микротитратора при 37°C в течение 5 минут. Это производится для калибратора, который также входит в набор.

Затем рассчитывается общий холестерин следующим образом:

Пример:

Поглощательная способность калибратора =0,35

Поглощательная способность неизвестного =0,25

Значение калибратора =7,0 ммоль/л

Холестерин=0,25/0,35×7.0=5.0 ммоль/л

Анализ ЛВП в плазме: Измерение ЛВП проводилось с помощью набора реагентов для определения ЛВП-холестерина Infinity™ (Thermo Electron Corp., № по каталогу TR39601).

Плазму (4 мкл) помещают в пластину микротитратора и инкубируют при 37°C в течение 5 минут с 300 мкл Реагента 1, после чего инкубируют еще 3 минуты после добавления 100 мкл Реагента 2. Затем измеряют поглощательную способность на 600 нм. В набор также входит калибратор, используемый для расчета.

Анализ ЛНП в плазме: Измерение ЛНП проводилось с помощью набора реагентов для определения ЛНП-холестерина Infinity™ (Thermo Electron Corp., № по каталогу 3365-030).

Плазму (4 мкл) помещают в пластину микротитратора и инкубируют при 37°C в течение 5 минут с 300 мкл Реагента 1, после чего инкубируют еще 5 минут после добавления 100 мкл Реагента 2. Затем измеряют поглощательную способность на 600 нм. В набор также входит калибратор, используемый для расчета.

Статистический анализ: Результаты выражаются как среднее±среднеквадратическое отклонение. Проводилась проверка по критерию Стьюдента, чтобы определить, имеются ли существенные различия (по холестерину, триглицеридам, ЛВП, ЛНП или размеру бляшек) у мышей, получавших TA или TPm, по сравнению с мышами, которые не получали лечения или получали только наполнитель. Для исследования этого типа P<0.05 (*) было сочтено значимым.

Результаты и обсуждение

На фиг.1 представлены результаты, полученные через 2 недели лечения.

На фиг.2 представлены результаты, полученные через 4 недели лечения.

Введение TPm, в особенности в дозе 33,25 мг/кг, привело к значимому снижению концентраций общего холестерина и ЛНП в плазме по сравнению с мышами, которые не получали лечения или получали только наполнитель, после 2 недель лечения. Через 4 недели лечения доза TPm 33,25 мг/кг все еще давала значимое уменьшение уровней триглицерида в плазме по сравнению с контрольными мышами, не получавшими лечения или получавшими только наполнитель. Эти результаты заставляют предположить, что TPm (в особенности в дозе 33,25 мг/кг) является потенциально эффективным средством снижения повышенных уровней холестерина, триглицерида и ЛНП в крови.

Пример 2

В этом примере оценивалось воздействие токоферилфосфатной смеси (TPm) (монотокоферилфорсфат и дитокоферилфосфат) на развитие патологических атеросклеротических изменений у самцов мыши APOE.

Методика

Двадцать восемь мышей были разделены на 4 группы: 2 контрольные группы, группа, получавшая токоферилацетат (TA) (150 мг TA/кг корма), и группа, получавшая TPm (200 мг TPm/кг корма, содержавшего 7% жира).

Диеты:

'Фаза индукции' - Фаза индукции состояла из первых 16 недель периода эксперимента. Во время этого периода животные получали гранулированный корм для мышей с низким содержанием витамина Е (менее 20 мг витамина Е на кг корма при общем содержании жира 7%; модифицированная версия стандартного корма для грызунов AIN93G (SF05-040, Specialty feeds, Глен Форрест, Западная Австралия). Контрольных животных держали исключительно на этой диете, тогда как корм с ТА содержал 150 мг TA/кг корма, а корм с TPm содержал 200 мг TPm/кг корма. Эти препараты давали в средних дозах 21 и 26 мг/кг веса, тела соответственно. Доза TPm 26 мг/кг была рассчитана так, чтобы она была эквивалентна по токоферолу дозе TA.

'Фаза провокации' - Эта фаза занимала последние 8 недель периода эксперимента. В это время животные получали специализированную диету в виде гранулированного корма для грызунов с низким содержанием витамина Е и высоким содержанием жира (21%) и холестерина (0,15%) (диета мышей с высоким содержанием жира и холестерина SF04-055 является вариантом стандартной диеты SF00-219 с содержанием витамина Е менее 20 мг на кг; фирма Specialty feeds, Глен Форест, Западная Австралия).

4 группы животных держали на следующих диетических режимах:

Группа Диета недель 0-16 Диета недель 16-24 Контроль (C24) SF05-040 SF05-040 Контроль (C16/8) SF05-040 SF04-055 TA SF05-040+TA (150 мг TA/кг корма) SF04-055+TA (150 мг TA/кг корма) TPm SF05-040+TPm (200 мг TPm/кг корма) SF04-055+TPm (200 мг TPm/кг)

Из двух контрольных групп только одну держали на диете SF04-055 с высоким содержанием жира и холестерина, тогда как другую контрольную группу держали на гранулированном корме для мышей SF05-040 (всего 7% жира) в течение всех 24 недель эксперимента (C24). Это было сделано, чтобы установить степень воздействия одной только диеты с высоким содержанием жира и холестерина на различные измеряемые атеросклеротические параметры и оценить полезность лечения различными соединениями по сравнению с содержанием животных на нормальной диете. Мышей, получавших TA, кормили гранулированным кормом с содержанием ТА 150 мг TA на кг корма, а мышей, получавших TPm, - гранулированным кормом с содержанием 200 мг TPm на кг корма. С этим кормом животные получали дозы 21 и 26 мг/кг веса тела соответственно. Доза TPm 26 мг/кг была рассчитана так, чтобы она была эквивалентна по токоферолу дозе TA.

Во время фазы индукции у контрольных мышей развилась слабая гиперхолестеринемия и патологические атеросклеротические поражения. Через 16 недель лечения TPm мыши продемонстрировали снижение общего холестерина на 34% (11.44+/-1,37 против 17,38+/-1,47 ммоль/л), снижение триглицеридов на 51% (0,99+/-0,14 против 2,00+/-0,58 ммоль/л) и снижение ЛНП-холестерина на 44% (4,67+/-0,70 против 8,38+/-0,76 ммоль/л) по сравнению с контрольными животными. Эти снижения значимо отличались от контрольных животных и были намного больше, чем показало лечение ТА.

После фазы провокации у контрольных мышей развилась очень сильные гиперхолестеринемия и патологические атеросклеротические поражения. Мыши, получавшие TA, не показали значимого снижения уровней липидов в плазме или регрессии патологических поражений, хотя площадь таких поражений сократилась в среднем на 12% (это является значимым). Однако лечение TPm снизило общий холестерин на 15% (43,8+/-4,38 против 37,08+/-5,15 ммоль/л), триглицериды на 28% (1,63+/-0,22 против 2,27+/-0,20 ммоль/л) и ЛНП-холестерина на 16% (15,02+/-2,61 против 17,95+/-1,51 ммоль/л), а также существенно сократило (на 58%) патологические образования в аорте.

Таблица 1
Сравнение уровня общего холестерина у мышей (среднее±среднеквадратичное отклонение; ммоль/л) на фазах индукции и провокации во время исследования Группа (n - численность) Базисная линия Фаза индукции Фаза провокации Неделя 0 16 24 Контроль: только диета SF05-040 (n=8-12) 11,96±0,82
(n=12) 13,43±2,21
(n=12) 11,43±1,89
(n=8) Контроль (n=8) 12,80±1,35 17,38±1,47 43,8±4,38# TA (n=8) 12,75±1,41 14,47±1,32 47,13±4,44 TP (n=8) 11,61±1,24 11,44±1,37* 37,08±5,15 # указывает, что контрольные мыши, содержавшиеся на диете с высоким содержанием жира и холестерина (в течение последних 8 недель лечения), имели существенно более высокие уровни холестерина в плазме, чем контрольные мыши, получавшие нормальную диету (P<0.05). * указывает на значимость (P<0.05) по сравнению с контрольными животными.

Таблица 2
Сравнение уровней триглицеридов у мышей (среднее±среднеквадратичное отклонение; ммоль/л) на фазах индукции и провокации Группа (n - численность) Базисная линия Фаза индукции Фаза провокации Неделя 0 16 24 Контроль: только диета SF05-040
(n=8-12) 1,73±0,13
(n=12) 1,10±0,25
(n=12) 1,45±0,21
(n=8) Контроль (n=8) 1,18±0,28 2,00±0,58 2,27±0,20# TA (n=8) 1,75±0,25 1,30±0,22* 2,23±0,29 TP (n=8) 1,54±0,38 0,99±0,14* 1,63±0,22* # указывает, что контрольные мыши, содержавшиеся на диете с высоким содержанием жира и холестерина (в течение последних 8 недель лечения), имели существенно более высокие уровни холестерина в плазме, чем контрольные мыши, получавшие нормальную диету (P<0.05). * указывает на значимость (P<0.05) по сравнению с контрольными животными.

Таблица 3
Сравнение уровней ЛНП-холестерина у мышей (среднее±среднеквадратичное отклонение; ммоль/л) на фазах индукции и провокации Группа (n - численность) Базисная линия Фаза индукции Фаза провокации Неделя 0 16 24 Контроль: только диета SF05-040
(n=8-12) 6,83±0,54
(n=12) 7,65±0,54
(n=12) 5,20±0,96
(n=8) Контроль (n=8) 8,08±1,20 8,38±0,76 17,95±1,51# TA (n=8) 8,85±1,66 6,51±0,71 18,98±2,29 TP (n=8) 7,84±1,51 4,67±0,70* 15,02±2,61 # указывает, что контрольные мыши, содержавшиеся на диете с высоким содержанием жира и холестерина (в течение последних 8 недель лечения), имели существенно более высокие уровни холестерина в плазме, чем контрольные мыши, получавшие нормальную диету (P<0.05). * указывает на значимость (P<0.05) по сравнению с контрольными животными.

Таблица 4
Площадь атеросклеротических поражений (среднее±среднеквадратичное отклонение, % площади поражения) в конце периода лечения Группа (n - численность) % площадь поражения Контроль: только диета SF05-040 (n=8) 8,9±1,7 Контроль C16/8 (n=8) 10,7±1,3 TA (n=8) 9,4±1,1 TPm (n=8) 4,5±1,3* * указывает на значимость (P<0.05) по сравнению с контрольными животными.

На фиг.3 показана оценка образования поражений аорты путем окрашивания масляным красным.

Корень аорты, грудная и брюшная аорты были окрашены масляным красным О (ORO) (который окрашивает липиды в красный цвет) и продемонстрировали значительные отложения липидов в виде сосудистых атеросклеротических поражений. В таблице 4 показаны размеры поражений в конце 24-й недели по каждой из экспериментальных групп. В среднем в конце периода индукции (16-я неделя) каждая мышь имела 5% покрытие атеросклеротическими поражениями в аортальной области (данные не показаны). К концу 24-1 недели у животных, содержавшихся только на диете периода индукции (7% жира), площадь поражений увеличилась до 8,9%. Животные, которые в последние 8 недель получали атерогенную диету, имели в среднем 10,7% атеросклеротических поражений в аортальной области по сравнению с 9,4% у мышей, получавших TA, и 4,5% у мышей, получавших TPm. Лечение ТА дало улучшение атеросклеротических поражений на 12% (что не является статистически значимым), тогда как лечение TPm дало значимое снижение поражений на 58% по сравнению с контрольными мышами, которых держали на таком же диетическом режиме.

Представляем данные, полученные на людях и демонстрирующие улучшение состояния дислипидемии по сравнению с использованием токоферола ацетата.

Токоферола ацетат использовался в этом эксперименте потому, что он является источником витамина Е. Один из авторов изобретения, Роксана Либинаки, установила, что после 6 недель лечения наблюдалось ~9% увеличение ЛВП- холестерина в группе, получавшей фосфа-Е, и это было сочтено статистически значимым: (n=38) р=0.017.

  Плацебо Вит.Е (токоферола ацетат) 200 ME Фосфа-Е 400 ME Базисная линия (Неделя 0) - Общий холестерин 5.90±0.99 ммоль/л 6.07±1.16 ммоль/л 5.93±0.77 ммоль/л 6 недель лечения (Неделя 6) - Общий холестерин 5.87±1.15 ммоль/л 6.10±1.03 ммоль/л 5.99±0.76 ммоль/л Базисная линия (Неделя 0) - Триглицериды 149.5±76.2 мг/дл 173.2±69.4 мг/дл 165.3±61.5 мг/дл 6 недель лечения (Неделя 6) - Триглицериды 154.4±73.9 мг/дл 180.0±67.2 мг/дл 155.6±52.7 мг/дл Базисная линия (Неделя 0)- ЛНП-Х 3.71±0.84 ммоль/л 3.85±0.94 ммоль/л 3.64±0.73 ммоль/л 6 недель лечения (Неделя 6) - ЛНП-Х 3.70±0.87 ммоль/L 3.91±0.94 ммоль/л 3.75±0.65 ммоль/л Базисная линия (Неделя 0) - ЛВП-Х 45.8±10.7 мг/дл 42.5±11.6 мг/дл 46.3±15.0 мг/дл 6 недель лечения (Неделя 6) - ЛВП-Х 46.3±12.5 мг/дл 43.7±12.6 мг/дл 50.3±16.5 мг/дл

"Дислипидемия" представляет собой нарушение липидного состава крови. Дислипидемию лечат снижением в циркулирующей крови уровней липидов, выбранных из группы, состоящей из повышенных общего холестерина, ЛНП-холестерина и/или триглицеридов, а также повышением низкого уровня ЛВП-холестерина, которые, как было показано, способствуют возникновению сердечно-сосудистых заболеваний, причем улучшение этого состояния фактически повышает способность человека исключить или уменьшить риск сердечно-сосудистого заболевания.

В известных публикациях D1, D2 и D3 указывается, что сердечно-сосудистые заболевания могут быть связаны с дислипидемией и/или что можно предотвратить такое заболевание или снизить риск его возникновения, улучшив состояние дислипидемии.

Эти ссылки до некоторой степени предполагают связь дислипидемии с сердечно-сосудистыми заболеваниями, хотя прямо и не заявляют о ней, однако мы считаем, что они будут достаточны для целей нашей аргументации.

D1 - Robins et al. обсуждают связь между уровнями циркулирующего ЛВП- и ЛНП-холестерина и ишемической болезнью сердца, а также воздействие лечения гемфиброзилом на эти факторы и на риск для сосудов сердца. Исследование показало, что увеличение уровня циркулирующего ЛВП-холестерина соотносится с уменьшением риска сердечного заболевания.

D2 - Capuzzi et al. рассматривают эффект монотерапии ниаспином, и в реферате указываются конечные цели, включающие уровни различных липопротеинов и отношение общий холестерин / ЛВП-холестерин, а также желаемые эффекты. На стр.80, колонка 1, абзац 2 ведется обсуждение, связанное с тем, что "совокупность различных комбинаций аномальных уровней липопротеина весьма часто встречается у пациентов с преждевременным заболеванием коронарной артерии". Здесь показано, что дислипидемия представляет риск для сердца.

D3 - Cullen et al., хотя он и не так прямо связан со специфической корреляцией между дислипидемией и болезнями сосудов сердца, рассматривается курение как фактор риска возникновения ишемической болезни сердца и обсуждается, можно ли повышенный риск заболевания у курильщиков объяснить неблагоприятными измерениями в их липидном профиле. В частности, даются различные допущения относительно связи между уровнями триглицеридов и ЛВП-холестерина и риском сердечного заболевания.

Если рассматривать эти документы в совокупности, то видно, что связь между уровнями различных липопротеинов и заболеванием сосудов сердца сложна, но в целом снижение риска ишемической болезни сердца достигается либо при увеличении уровня ЛВП-холестерина, либо при снижении ЛНП-холестерина, либо при обоих этих факторах.

Это неизбежно связано с лечением дислипидемии, т.е. регулированием уровней различных липидов относительно друг друга.

Следует также отметить, что в описании изобретения указывается, что сердечно-сосудистые заболевания могут быть вызваны, например, повышенными общим холестерином и ЛНП- холестерином. Кроме того, в описании представлены составы, которые понижают общий холестерин и ЛНП-холестерин.

Заключение

Результаты демонстрируют значимое снижение профилей липидов (ЛНП, общий холестерин и триглицерид) у животных, получавших TPm, что говорит о том, что TPm можно использовать для лечения гипердислипидемии и связанных с ней заболеваний. Кроме того, результаты демонстрируют значимое уменьшение размера атеросклеротических поражений у мышей АРОЕ, что говорит о том, что использование TPm может излечивать или замедлять распространение атеросклеротических поражений у этого штамма мышей.

Слово "содержащий" или "включающий" во всех его формах, используемое в данном описании и формуле изобретения, не ограничивает настоящее изобретение и не исключает различных вариантов и дополнений.

Модификации и усовершенствования изобретения будут очевидны для специалистов в данной области. Такие модификации и усовершенствования будут входить в объем изобретения.

Предложены способ снижения содержания в циркулирующей крови ЛНП-холестерина, триглицеридов, общего холестерина и их смесей, включающий введение эффективного количества одного или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса, представляющих собой монотокоферилфосфат, дитокоферилфосфат, монотокотриенилфосфат, дитокотриенилфосфат и их смеси, их применение для изготовлении лекарственного средства того же назначения и их применение для облегчения симптомов, лечения и/или предупреждения заболевания, выбранного из группы, состоящей из хронической почечной недостаточности, первичных и вторичных гиперлипемий и дислипемии, ретинопатии, увеличения печени и селезенки, ксантом и их комбинаций путем снижения содержания липидов в циркулирующей крови. Показано снижение под действием заявленных токоферилфосфатов уровней общего холестерина, ЛНП у мышей, несмотря на их содержание на диете с 21% жира и 0,15% холестерина, и снижение у них атеросклеротических поражений. У людей показано улучшение состояния дислипидемии и 9%-ное увеличение ЛВП-холестерина по сравнению с использованием токоферола ацетата. 3 н. и 2 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл.

1. Способ снижения содержания в циркулирующей крови липида, выбранного из группы, состоящей из ЛНП-холестерина, триглицеридов, общего холестерина и их смесей, включающий введение эффективного количества одного или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса, представляющих собой монотокоферилфосфат, дитокоферилфосфат, монотокотриенилфосфат, дитокотриенилфосфат и их смеси.

2. Способ по п.1, где фосфатное производное агентов электронного переноса представляет собой смесь монотокоферилфосфата и дитокоферилфосфата.

3. Способ по п.1, в котором снижение содержания в циркулирующей крови липида облегчает симптомы, лечит или предупреждает заболевание, выбранное из группы, состоящей из хронической почечной недостаточности, первичных и вторичных гиперлипемий и дислипемии, ретинопатии, увеличения печени и селезенки, ксантом и их комбинаций.

4. Применение эффективного количества одного или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса, представляющих собой монотокоферилфосфат, дитокоферилфосфат, монотокотриенилфосфат, дитокотриенилфосфат и их смеси, при изготовлении лекарственного средства для снижения содержания в циркулирующей крови липидов, выбранных из группы, состоящей из ЛНП-холестерина, триглицеридов, общего холестерина и их смесей.

5. Применение одного или более фосфатных производных одного или более агентов электронного переноса, представляющих собой монотокоферилфосфат, дитокоферилфосфат, монотокотриенилфосфат, дитокотриенилфосфат и их смеси, для облегчения симптомов, лечения и/или предупреждения заболевания, выбранного из группы, состоящей из хронической почечной недостаточности, первичных и вторичных гиперлипемий и дислипемии, ретинопатии, увеличения печени и селезенки, ксантом и их комбинаций путем снижения содержания липидов в циркулирующей крови.