СОСТАВЫ АНТАГОНИСТА VEGF, ПОДХОДЯЩИЕ ДЛЯ ИНТРАВИТРЕАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ Российский патент 2011 года по МПК A61K9/00 A61P27/02 

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим составам, подходящим для интравитреального введения, содержащим средства, способные ингибировать фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), и к способам получения и применения таких составов. Изобретение включает жидкие фармацевтические составы, имеющие увеличенную стабильность, а также составы, которые могут быть лиофилизованы и ресуспендированы для интравитреального введения.

Определение родственного уровня техники

Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) является почти повсеместной при раке у человека, что согласуется с его ролью как ключевого медиатора неоваскуляризации опухоли. Блокада функции VEGF, путем связывания с молекулой или ее рецептором VEGFR-2, ингибирует рост имплантированных опухолевых клеток во множестве различных моделей ксенотрансплантата (см., например, Gerber et al. (2000) Cancer Res. 60:6253-6258). Был описан растворимый антагонист VEGF-специфического белка слияния, называемый "ловушкой VEGF" (Kim et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11399-404; Holash et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11393-8).

Известны глазные составы, см., например, патенты США 7033604 и 6777429. Глазной состав антитела VEGF описан в патенте США 6676941.

Лиофилизация (сушка при температуре ниже нуля градусов в контролируемых условиях) обычно используется для длительного хранения белков. Лиофилизованный белок в высушенном сублимацией состоянии в основном устойчив к разложению, агрегации, окислению и другим дегенеративным процессам (см., например, патент США 6436897).

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к стабильным составам белка слияния VEGF-специфического антагониста. Изобретение относится к фармацевтически приемлемым составам, которые содержат антагонист VEGF типа «ловушки» с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к жидким и лиофилизованным составам.

В первом аспекте изобретение относится к стабильному жидкому глазному составу белка слияния VEGF-специфического антагониста, содержащему белок слияния, который включает компонент рецептора, состоящий по существу из подобного иммуноглобулину (Ig) домена 2 первого рецептора VEGF и домена Ig 3 второго рецептора VEGF, и мультимеризующий компонент (также называемый "ловушкой VEGF"). В определенном варианте белка слияния VEGF-специфического антагониста, первый рецептор VEGF представляет собой Flt1 и второй рецептор VEGF представляет собой Flk1 или Flt4. В более конкретном варианте осуществления белок слияния имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4. Предпочтительно, антагонист VEGF представляет собой димер, включающий два белка слияния SEQ ID NO:4.

В одном аспекте изобретение относится к стабильному жидкому глазному составу, содержащему 1-100 мг/мл белка слияния VEGF-специфического антагониста, 0,01-5% одного или более органических сорастворителей, 30-150 мМ одного или более средств, обеспечивающих тоничность, 5-40 мМ буферизующего средства и, в случае необходимости, 1,0-7,5% стабилизатора, рН приблизительно 5,8-7,0.

В одном или более частных вариантах осуществления органический сорастворитель может представлять собой полисорбат, например полисорбат 20 или полисорбат 80, полиэтиленгликоль (ПЭГ), например ПЭГ 3350, или пропиленгликоль, или их комбинацию; средство, обеспечивающее тоничность, может быть, например, хлоридом натрия или хлоридом калия; стабилизатор может быть сахарозой, сорбитом, глицерином, трегалозой или маннитом; и буферизующее средство может быть, например, фосфатным буфером. В частном варианте осуществления фосфатный буфер представляет собой фосфат натрия.

В различных вариантах осуществления органический сорастворитель представляет собой полисорбат и/или ПЭГ, стабилизатор представляет собой сахарозу, буферизующее средство является фосфатным буфером, и средство, обеспечивающее тоничность, представляет собой хлорид натрия.

Более конкретно, стабильный жидкий глазной состав включает приблизительно 40-50 мг/мл антагониста VEGF (SEQ ID NO:4), приблизительно 10 мМ фосфатного буфера, 0,01-3% полисорбата и/или ПЭГ, 40-135 мМ хлорида натрия и, в случае необходимости, 5,0% сахарозы, рН приблизительно 6,2-6,3.

В частном предпочтительном варианте осуществления стабильный жидкий глазной состав включает приблизительно 50 мг/мл антагониста VEGF (SEQ ID NO:4), 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 50 мМ хлорида натрия, 0,1% полисорбата и 5% сахарозы, рН приблизительно 6,2-6,3.

В частном предпочтительном варианте осуществления стабильный жидкий глазной состав включает приблизительно 50 мг/мл антагониста VEGF (SEQ ID NO:4), 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 50 мМ хлорида натрия, 3% ПЭГ и 5% сахарозы, рН приблизительно 6,2-6,3.

В частном предпочтительном варианте осуществления стабильный жидкий глазной состав включает приблизительно 40 мг/мл антагониста VEGF (SEQ ID NO:4), 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 40 мМ хлорида натрия, 0,03% полисорбата и 5% сахарозы, рН приблизительно 6,2-6,3.

В частном предпочтительном варианте осуществления стабильный жидкий глазной состав включает приблизительно 40 мг/мл антагониста VEGF (SEQ ID NO:4), 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 135 мМ хлорида натрия и 0,03% полисорбата, рН приблизительно 6,2-6,3.

В другом аспекте изобретение относится к стабильному жидкому глазному составу, содержащему 100 мг/мл белка слияния VEGF-специфического антагониста; 0,01-5% одного или более органических со-растворителей; 5-40 мМ буферизующего средства; и, в случае необходимости, 30-150 мМ одного или более средств, обеспечивающих тоничность и/или 1,0-7,5% стабилизатора; рН приблизительно 5,8-7,0.

В различных вариантах осуществления антагонист VEGF (SEQ ID NO:4) присутствует в концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 80 мг/мл. В различных вариантах осуществления антагонист VEGF (SEQ ID NO:4) присутствует в концентрации приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70 или приблизительно 80 мг/мл. В предпочтительном варианте осуществления антагонист VEGF (SEQ ID NO:4) присутствует в концентрации приблизительно 40 мг/мл.

В другом варианте осуществления стабилизатор выбран из одного или более соединений из числа сахарозы, сорбита, глицерина, трегалозы и маннита.

В другом варианте осуществления органический сорастворитель выбран из одного или более соединений из числа полисорбата, например полисорбата 20 или полисорбата 80, полиэтиленгликоля (ПЭГ), например ПЭГ 3350, и пропиленгликоля.

В другом варианте осуществления буфер представляет собой фосфатный буфер, например фосфат натрия.

В другом варианте осуществления средство, обеспечивающее тоничность, представляет собой соль, например хлорид натрия.

В одном варианте осуществления стабильный жидкий глазной состав включает 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,1% полисорбата и/или приблизительно 3% ПЭГ или пропиленгликоля, приблизительно 40 мМ хлорида натрия и приблизительно 5% сахарозы. В частном варианте осуществления стабильный жидкий глазной состав включает 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, приблизительно 0,03% полисорбата, приблизительно 40 мМ хлорида натрия и приблизительно 5% сахарозы. В другом частном варианте осуществления рН состава составляет от приблизительно 6,2 до приблизительно 6,3. В другом частном варианте осуществления рН получают, смешивая моно- и двухосновный фосфат натрия до желаемого рН без титрования кислоты/основания.

В частном варианте осуществления стабильный жидкий глазной состав состоит по существу из антагониста VEGF (SEQ ID NO:4) в количестве 40 мг/мл, 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,03% полисорбата, 40 мМ хлорида натрия и 5% сахарозы, рН 6,2-6,3.

В другом аспекте изобретение относится к стабильному жидкому глазному составу, содержащему от приблизительно 10 до приблизительно 80 мг/мл антагониста VEGF, 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,03% полисорбата и приблизительно 135 мМ хлорида натрия, рН от 6,2 до 6,3.

В различных вариантах осуществления антагонист VEGF (SEQ ID NO:4) присутствует в концентрации от приблизительно 10 до приблизительно 80 мг/мл. В различных вариантах осуществления антагонист VEGF (SEQ ID NO:4) присутствует в концентрации приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 30, приблизительно 40, приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70 или приблизительно 80 мг/мл. В частном варианте осуществления антагонист VEGF (SEQ ID NO:4) присутствует в концентрации приблизительно 40 мг/мл.

В одном варианте осуществления стабильный жидкий глазной состав включает 40 мг/мл антагониста VEGF (SEQ ID NO:4), 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,03% полисорбата и приблизительно 135 мМ хлорида натрия, рН от 6,2 до 6,3. В частном варианте осуществления стабильный жидкий глазной состав состоит по существу из 40 мг/мл антагониста VEGF (SEQ ID NO:4), 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,03% полисорбата и приблизительно 135 мМ хлорида натрия, рН от 6,2 до 6,3.

В другом аспекте изобретение относится к способному к лиофилизации составу антагониста VEGF, причем после лиофилизации с последующим восстановлением получают стабильный жидкий глазной состав как описано здесь.

В другом аспекте изобретение относится к способному к лиофилизации составу белка слияния фактора роста эндотелия сосудов (VEGF)-специфического антагониста, содержащему 5-50 мг/мл антагониста VEGF, 5-25 мМ буфера, такого как фосфатный буфер, от 0,01 до 0,15% одного или более органических сорастворителей, таких как полисорбат, пропиленгликоль и/или ПЭГ, и в случае необходимости, 1-10% стабилизатора, такого как сахароза, сорбит, трегалоза, глицерин или маннит, рН приблизительно 5,8-7,0. В различных вариантах осуществления антагонист VEGF (SEQ ID NO:4) присутствует в количестве приблизительно 5, приблизительно 10, приблизительно 20, приблизительно 30 или приблизительно 40 мг/мл. В частном варианте осуществления способный к лиофилизации глазной состав по изобретению включает 20 мг/мл антагониста VEGF, 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,03% полисорбата, 0,1% ПЭГ и 2,5% сахарозы, рН приблизительно 6,2-6,3. В других вариантах осуществления способный к лиофилизации состав дополнительно содержит хлорид натрия. В частном варианте осуществления хлорид натрий присутствует в концентрации приблизительно 20 мМ. В другом частном варианте осуществления хлорид натрий присутствует в концентрации приблизительно 67,5 мМ.

В другом частном варианте осуществления способный к лиофилизации глазной состав по изобретению включает 20 мг/мл антагониста VEGF, 5 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,015% полисорбата, 20 мМ хлорида натрия и 2,5% сахарозы, рН приблизительно 6,2-6,3.

В другом варианте осуществления способный к лиофилизации глазной состав включает 5 мг/мл, 10 мг/мл или 40 мг/мл антагониста VEGF, 5 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,015% полисорбата, 20 мМ хлорида натрия и 2,5% сахарозы, рН 6,2-6,3. В частном варианте осуществления способный к лиофилизации глазной состав состоит по существу из 5 мг/мл, 10 мг/мл или 40 мг/мл антагониста VEGF (SEQ ID NO:4), 5 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,015% полисорбата, 20 мМ хлорида натрия и 2,5% сахарозы, рН 6,2-6,3.

В другом частном варианте осуществления способный к лиофилизации глазной состав включает 20 мг/мл антагониста VEGF, 5 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,015% полисорбата и 67,5 мМ хлорида натрия, рН приблизительно 6,2-6,3. В более конкретном варианте осуществления способный к лиофилизации глазной состав состоит по существу из 20 мг/мл антагониста VEGF (SEQ ID NO:4), 5 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,015% полисорбата и 67,5 мМ хлорида натрия, рН приблизительно 6,2-6,3.

В другом частном варианте осуществления способный к лиофилизации глазной состав включает 5 мг/мл, 10 мг/мл или 40 мг/мл антагониста VEGF, 5 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,015% полисорбата и 67,5 мМ хлорида натрия, рН приблизительно 6,2-6,3. В более конкретном варианте осуществления способный к лиофилизации глазной состав состоит по существу из 5 мг/мл, 10 мг/мл или 40 мг/мл антагониста VEGF (SEQ ID NO:4), 5 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 0,015% полисорбата и 67,5 мМ хлорида натрия, рН приблизительно 6,2-6,3.

Обычно восстановленный состав имеет приблизительно 2-кратную концентрацию состава перед лиофилизацией, например состав, содержащий 20 мг белка слияния/мл до лиофилизации приводит после восстановления к составу с концентрацией 40 мг белка слияния/мл.

Обычно лиофилизованный состав восстанавливают с помощью стерильной воды, подходящей для инъекции. В одном варианте осуществления жидкостью для восстановления является бактериостатическая вода.

В другом аспекте изобретение характеризует способ получения лиофилизованного состава белка слияния VEGF-специфического антагониста, включающий лиофилизацию способного к лиофилизации состава по изобретению с получением лиофилизованного состава. Лиофилизованный состав может быть лиофилизован любым способом, известным в уровне техники для лиофилизации жидкостей.

В другом родственном аспекте изобретение характеризует способ получения восстановленного лиофилизованного состава антагониста VEGF, включающий восстановление лиофилизованного состава по изобретению с получением восстановленного состава. В одном варианте осуществления восстановленный состав имеет вдвое более высокую концентрацию по сравнению с составом до лиофилизации, например способ по изобретению включает: (a) получение предлиофилизованного состава белка слияния VEGF-специфического антагониста, (b) лиофилизацию предлиофилизованного состава со стадии (a); и (c) восстановление лиофилизованного состава со стадии (b).

Изобретение также относится к глазным составам в форме предварительно заполненного шприца или ампулы, особенно подходящим для интравитреального введения.

Другие объекты и преимущества станут очевидными в свете последующего подробного описания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными способами и экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Следует также понимать, что терминология, используемая здесь, дана только ради описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, если это не указано, так как объем настоящего изобретения ограничен только приложенной формулой изобретения.

Если не указано иное, все технические и научные термины и фразы, используемые здесь, имеют то же самое значение, как обычно понимаемое специалистом в области техники, к которой относится изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные, описанным здесь, могут использоваться в практике или испытании настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны далее.

Общее описание

Безопасное обращение с составами, включающими белки, и их введение представляют значительную проблему для составителя фармацевтической продукции. Белки обладают уникальными химическими и физическими свойствами, которые представляют проблемы стабильности: для белков существуют различные пути разложения, вовлекающие как химическую, так и физическую нестабильность. Химическая нестабильность включает дезаминирование, агрегацию, разрезание пептидного скелета и окисление остатков метионина. Физическая нестабильность охватывает много феноменов, включая, например, агрегацию и/или осаждение.

Химическая и физическая стабильность может быть поддержана путем удаления воды из белка.

Лиофилизация (сушка сублимацией в контролируемых условиях) обычно используется для длительного хранения белков. Лиофилизованный белок в высушенном сублимацией состоянии в основном устойчив к разложению, агрегации, окислению и другим дегенеративным процессам. Лиофилизованный белок может быть восстановлен до введения с помощью воды, в случае необходимости содержащей бактериостатический консервант (например, бензиловый спирт).

Определения

Термин "носитель" включает разбавитель, адъювант, эксципиент или носитель, с которыми композицию вводят. Носители могут включать стерильные жидкости, такие как, например, вода и масла, включая масла нефти, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п.

Термин "эксципиент" включает нетерапевтическое средство, добавляемое к фармацевтической композиции, чтобы обеспечить желаемую консистенцию или стабилизирующий эффект. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают, например, крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, порошок, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеринмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухой снятый латекс, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п.

Термин "лиофилизованный" или "высушенный сублимацией" включает состояние вещества, которое было подвергнуто процедуре сушки, такой как лиофилизация, где удаляют по меньшей мере 90% влажности.

Антагонисты VEGF

Антагонист VEGF представляет собой соединение, способное блокировать или ингибировать биологическое действия фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), и включает белки слияния, способные улавливать VEGF. В предпочтительном варианте осуществления антагонист VEGF представляет собой белок слияния SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:4; более предпочтительно, SEQ ID NO:4. В некоторых вариантах осуществления антагонист VEGF экспрессируется в линии клеток млекопитающих, такой как клетки CHO, и может быть посттрансляционно модифицирован. В частном варианте осуществления белок слияния включает аминокислоты 27-457 SEQ ID NO:4 и гликозилирован по остаткам Asn 62, 94, 149, 222 и 308. Предпочтительно, антагонист VEGF представляет собой димер, состоящий из двух белков слияния SEQ ID NO:4.

Антагонист VEGF в способах и составах по изобретению может быть получен любым подходящим способом, известным из уровня техники, или которые будут известны в будущем. Антагонист VEGF предпочтительно в основном не содержащий белковых примесей в момент применения для получения фармацевтически приемлемого состава. "В основном не содержащий белковых примесей" означает, предпочтительно, что по меньшей мере 90% веса препарата белка слияния VEGF-специфического антагониста, используемого для получения состава, составляет белок белка слияния антагониста VEGF, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%. Белок слияния предпочтительно в основном не содержащий агрегатов. "В основном не содержит агрегатов" означает, что по меньшей мере 90% веса белка слияния не присутствует в агрегате в момент, когда белок слияния используется для получения фармацевтически эффективного состава. Если не указано иное, используемые фосфаты представляют собой фосфаты натрия, а желаемый рН буфера достигают, смешивая подходящие количества моно- и двуосновного фосфата натрия.

Стабильные жидкие глазные составы

В одном аспекте изобретение относится к стабильному фармацевтически приемлемому составу, содержащему антагонист VEGF, причем состав представляет собой жидкий состав, подходящий для глазного использования. Предпочтительно, жидкий состав включает фармацевтически эффективное количество антагониста VEGF. Состав может также включать один или более фармацевтически приемлемых носителей, буферов, средств, обеспечивающих тоничность, стабилизаторов и/или эксципиентов. Пример фармацевтически приемлемого жидкого состава включает антагонист VEGF в фармацевтически эффективном количестве, буфер, органический сорастворитель, такой как полисорбат, средство, обеспечивающее тоничность, такое как NaCl, и, в случае необходимости, стабилизатор, такой как сахароза или трегалоза.

Стабильность определяют множеством способов в указанные моменты времени, включая определение рН, визуальную инспекцию цвета и внешнего вида, определение общего содержания белка способами, известными из уровня техники, например УФ-спектроскопией, и чистоту определяют, например, SDS-PAGE, ВЭЖХ с исключением по размеру, определением активности с помощью биологического теста, изоэлектрическим фокусированием и изоаспартатным количественным анализом. В одном примере определения биологической активности, пригодного для определения активности антагониста VEGF, линию клеток BAF/3 VEGFR1/EPOR используют, чтобы определить связывание VEGF165 антагонистом VEGF по изобретению.

Жидкие составы могут быть сохранены в лишенной кислорода среде. Лишенные кислорода среды могут быть получены путем сохранения составов в атмосфере инертного газа, например азота или аргона. Жидкие составы предпочтительно сохраняют при приблизительно 5°C.

Лиофилизированные глазные составы

В одном аспекте изобретение относится к офтальмически приемлемому составу, включающему антагонист VEGF, причем состав представляет собой способный к лиофилизации состав. Способные к лиофилизации составы могут быть восстановлены в растворы, суспензии, эмульсии или любую другую подходящую форму для введения или использования. Способные к лиофилизации составы обычно сначала получают в форме жидкостей, затем замораживают и лиофилизируют. Полный жидкий объем до лиофилизации может быть меньше, равен или больше конечного объема лиофилизованного состава после восстановления. Процесс лиофилизации известен специалисту и обычно включает сублимацию воды из замороженного состава в контролируемых условиях.

Лиофилизованные составы могут быть сохранены в широком диапазоне температур. Лиофилизованные составы могут быть сохранены при температуре ниже 25°C, например охлаждены при 2-8°C, или при комнатной температуре (например, приблизительно при 25°C). Предпочтительно, лиофилизованные составы сохраняют при температуре ниже, чем приблизительно 25°C, более предпочтительно, при приблизительно 4-20°C; ниже, чем приблизительно 4°C; ниже, чем приблизительно -20°C; приблизительно -40°C; приблизительно -70°C, или приблизительно -80°C. Стабильность лиофилизованного состава может быть определена множеством способов, известных специалисту, например визуальной оценкой внешним видом корки и/или определением содержания влаги.

Лиофилизованные составы обычно восстанавливают для использования путем добавления водного раствора, чтобы растворить лиофилизованный состав. Широкая разновидность водных растворов может использоваться для восстановления лиофилизованного состава. Предпочтительно, лиофилизованные составы восстанавливают с использованием воды. Лиофилизованные составы предпочтительно восстанавливают с помощью раствора, состоящего по существу из воды (например, USP WFI или воды для инъекции) или бактериостатической воды (например, USP WFI с 0,9% бензилового спирта). Однако растворы, включающие буферы и/или эксципиенты и/или один или более фармацевтически приемлемых носителей, также могут использоваться.

Высушенные сублимацией или лиофилизованные составы обычно получают из жидкостей, то есть из растворов, суспензий, эмульсий и т.п. Таким образом, жидкость, которая подвергается сушке сублимацией или лиофилизации, предпочтительно включает все компоненты, желаемые в заключительном восстановленном жидком составе. В результате при восстановлении высушенный сублимацией или лиофилизованный состав приводит к желаемому жидкому составу после восстановления.

ПРИМЕРЫ

Прежде чем способы по изобретению будут описаны, следует отметить, что это изобретение не ограничено конкретными описанными способами и экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Следует также понимать, что терминология, используемая здесь, дана только ради описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, так как объем настоящего изобретения ограничен только приложенной формулой изобретения.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, как обычно понимается специалистом в области техники, к которой относится это изобретение. Хотя любые способы и материалы, подобные или эквивалентные, описанным здесь, могут использоваться в практике или испытании настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны далее.

Пример 1. Стабильность жидкого состава ловушки VEGF с концентрацией 50 мг/мл, сохраненного при 5°C в стеклянных ампулах на 3 мл.

Глазной жидкий состав, содержащий 50 мг/мл ловушки VEGF (SEQ ID NO:4), 10 мМ фосфата, 50 мМ NaCl, 0,1% полисорбата 20, 5% сахарозы и имеющий рН 6,25, сохраняли при 5°C в стеклянных ампулах на 3 мл и образцы тестировали в моменты времени 3, 6, 9, 12, 18 и 24 месяца. Стабильность определяли с помощью SE-ВЭЖХ. Результаты показаны в Таблице 1. Мутность измеряли при OD₄₀₅ нм; и процент восстановленного белка и чистоту - с помощью ВЭЖХ с исключением по размеру.

Таблица 1 Стабильность белка ловушки VEGF в концентрации 50 мг/мл
(VGFT-SS065) Месяцы Внешний вид Мутность (OD₄₀₅ нм) рН % восстановленной ловушки VEGF % ловушки VEGF в нативной конфигурации 0 Уд. 0,00 6,2 100 98,8 3 Уд. 0,00 6,2 101 98,7 6 Уд. 0,01 6,3 100 98,3 9 Уд. 0,01 6,3 101 98,3 12 Уд. 0,01 6,3 104 98,4 18 Уд. 0,01 6,3 96 98,1 24 Уд. 0,01 6,3 105 98,1

Пример 2. Стабильность жидкого состава ловушки VEGF с концентрацией 50 мг/мл, сохраненного при 5°C в стеклянных ампулах на 3 мл.

Жидкий состав, содержащий 50 мг/мл ловушки VEGF (SEQ ID NO:4), 10 мМ фосфата, 50 мМ NaCl, 3% полиэтиленгликоля 3350, 5% сахарозы и имеющий рН 6,25, сохраняли при 5°C в стеклянных ампулах на 3 мл и образцы тестировали в моменты времени 3, 6, 9, 12, 18 и 24 месяца. Результаты стабильности показаны в Таблице 2. Мутность, процент восстановленного белка и чистоту определяли, как описано выше.

Таблица 2 Стабильность белка ловушки VEGF в концентрации 50 мг/мл
(VGFT-SS065) Месяцы Внешний вид Мутность рН % восстановленной ловушки VEGF % ловушки VEGF в нативной конфигурации 0 Уд. 0,00 6,2 100 98,9 3 Уд. 0,00 6,1 104 98,5 6 Уд. 0,01 6,3 99 98,3 9 Уд. 0,00 6,3 102 97,6 12 Уд. 0,01 6,3 103 98,0 18 Уд. 0,00 6,3 113 97,7 24 Уд. 0,00 6,2 106 97,6

Пример 3. Стабильность жидкого состава ловушки VEGF с концентрацией 40 мг/мл, сохраненного при 5°C в стеклянных ампулах на 3 мл.

Жидкий состав, содержащий 40 мг/мл ловушки VEGF (SEQ ID NO:4), 10 мМ фосфата, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20, 5% сахарозы и имеющий рН 6,3, сохраняли при 5°C в стеклянных ампулах на 3 мл и образцы тестировали в моменты времени 0,5, 1, 2, 3 и 4 месяца. Результаты стабильности показаны в Таблице 3. Мутность, процент восстановленного белка и чистоту определяли, как описано выше.

Таблица 3 Стабильность белка ловушки VEGF в концентрации 40 мг/мл
(VGFT-SS207) Месяцы Внешний вид Мутность рН % восстановленной ловушки VEGF % ловушки VEGF в нативной конфигурации 0 Уд. 0,00 6,3 100 99,5 0,5 Уд. 0,00 6,3 99 99,4 1 Уд. 0,00 6,2 98 99,5 2 Уд. 0,00 6,2 95 99,2 3 Уд. 0,01 6,4     4 Уд. 0,01 6,3    

Пример 4. Стабильность жидкого состава ловушки VEGF в концентрации 40 мг/мл, сохраненного при 5°C в предварительно заполненном стеклянном шприце.

Жидкий состав, содержащий ловушку VEGF в концентрации 40 мг/мл (SEQ ID NO:4), 10 мМ фосфата, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20,5% сахарозы и имеющий рН 6,3, сохраняли при 5°C в предварительно заполненном стеклянном шприце на 1 мл с покрытым 4023/50 FluroTec плунжером, и образцы тестировали в моменты времени 0,5, 1, 2, 3 и 4 месяца. Результаты стабильности показаны в Таблице 4. Мутность, процент восстановленного белка и чистоту определяли, как описано выше.

Таблица 4 Стабильность белка ловушки VEGF в концентрации 40 мг/мл
(VGFT-SS207) Месяцы Внешний вид Мутность рН % восстановленной ловушки VEGF % ловушки VEGF в нативной конфигурации 0 Уд. 0,00 6,3 100 99,4 0,5 Уд. 0,00 6,3 100 99,3 1 Уд. 0,00 6,3 100 99,4 2 Уд. 0,00 6,3 97 99,1 3 Уд. 0,01 6,4     4 Уд. 0,01 6,3    

Пример 5. Стабильность жидкого состава ловушки VEGF в концентрации 40 мг/мл, сохраненного при 5°C в стеклянных ампулах на 3 мл.

Жидкий состав, содержащий ловушку VEGF в концентрации 40 мг/мл (SEQ ID NO:4), 10 мМ фосфата, 135 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 и имеющий рН 6,3, сохраняли при 5°C в стеклянных ампулах на 3 мл, и образцы тестировали в моменты времени 0,5, 1, 2, 3 и 4 месяца. Результаты стабильности показаны в Таблице 5. Мутность, процент восстановленного белка и чистоту определяли, как описано выше.

Таблица 5 Стабильность белка ловушки VEGF в концентрации 40 мг/мл
(VGFT-SS203) Месяцы Внешний вид Мутность рН % восстановленной ловушки VEGF % ловушки VEGF в нативной конфигурации 0 Уд. 0,00 6,3 100 99,3 0,5 Уд. 0,00 6,2 87 99,2 1 Уд. 0,00 6,2 88 99,1 2 Уд. 0,00 6,3 103 99,2 3 Уд. 0,00 6,3 88 99,0 4 Уд. 0,00 6,2 85 98,9 5 Уд. 0,00 6,3 84 99,0

Пример 6. Стабильность жидкого состава ловушки VEGF в концентрации 40 мг/мл, сохраненного при 5°C в предварительно заполненном стеклянном шприце на 1 мл.

Жидкий состав, содержащий ловушку VEGF в концентрации 40 мг/мл (SEQ ID NO:4), 10 мМ фосфата, 135 мМ NaCl, 0,03% полисорбата 20 и имеющий рН 6,3, сохраняли при 5°C в предварительно заполненном медицинском стеклянном шприце на 1 мл с покрытым 4023/50 FluroTec плунжером, и образцы тестировали в моменты времени 0,5, 1, 2, 3, 4 и 5 месяцев. Результаты стабильности показаны в Таблице 6. Мутность, процент восстановленного белка и чистоту определяли, как описано выше.

Таблица 6 Стабильность белка ловушки VEGF в концентрации 40 мг/мл
(VGFT-SS203) Месяцы Внешний вид Мутность рН % восстановленной ловушки VEGF % ловушки VEGF в нативной конфигурации 0 Уд. 0,00 6,3 100 99,2 0,5 Уд. 0,01 6,3 101 99,2 1 Уд. 0,00 6,3 101 99,2 2 Уд. 0,00 6,3 - - 3 Уд. 0,01 6,3 102 99,1 4 Уд. 0,01 6,3 103 98,8 5 Уд. 0,00 6,3 99 98,9

Пример 7. Стабильность лиофилизованного состава ловушки VEGF в концентрации 20 мг/мл, сохраненного при 5°C в стеклянных ампулах на 3 мл и восстановленного до 40 мг/мл.

0,8 мл жидкого состава, содержащего ловушку VEGF в концентрации 20 мг/мл (SEQ ID NO:4), 5 мМ фосфата, 20 мМ NaCl, 0,015% полисорбата 20, 2,5% сахарозы и имеющего рН 6,3, лиофилизовали в стеклянных ампулах на 3 мл. Образцы сохраняли при 5°C и тестировали в моменты времени 1 и 2 месяца. Ловушку VEGF восстанавливали до конечной концентрации ловушки VEGF 40 мг/мл (конечный объем 0,4 мл). Результаты стабильности показаны в Таблице 7 (t = время в месяцах; * = внешний вид; ** = время восстановления). Мутность, процент восстановленного белка и чистоту определяли, как описано выше.

Таблица 7 Стабильность лиофилизованного белка ловушки VEGF
в концентрации 20 мг/мл (VGFT-SS216) t Внешний вид* Время восст.** (мин) Внеш. вид* восст. жидкости Мутность рН % восстановленной ловушки VEGF % ловушки VEGF в нативной конфигурации 0 Уд. 0,6 Уд. 0,00 6,3 100 99,5 1 Уд. 0,6 Уд. 0,01 6,3 106 99,4 2 Уд. 0,4 Уд. 0,01 6,2 103 99,3

Пример 8. Стабильность лиофилизованного состава ловушки VEGF в концентрации 20 мг/мл, сохраненного при 5°C в стеклянных ампулах на 3 мл.

0,8 мл жидкого состава, содержащего ловушку VEGF в концентрации 20 мг/мл (SEQ ID NO:4), 5 мМ фосфата, 67,5 мМ NaCl, 0,015% полисорбата 20 и имеющего рН 6,3, лиофилизовали в стеклянных ампулах на 3 мл. Образцы сохраняли при 5°C и тестировали в моменты времени 1, 2 и 3 месяца. Ловушку VEGF восстанавливали до конечной концентрации ловушки VEGF 40 мг/мл (конечный объем 0,4 мл). Результаты стабильности показаны в Таблице 8 (t = время в месяцах; * = внешний вид; ** = время восстановления).

Таблица 8 Стабильность лиофилизованного белка ловушки VEGF
в концентрации 20 мг/мл (VGFT-SS216) t Внешний вид* Время восст.** (мин) Внеш. вид* восст. жидкости Мутность рН % восстановленной ловушки VEGF % ловушки VEGF в нативной конфигурации 0 Уд. 0,7 Уд. 0,00 6,3 100 99,0 1 Уд. 0,7 Уд. 0,01 6,2 105 98,9 2 Уд. 0,4 Уд. 0,01 6,2 103 98,9

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии. Глазные составы белка слияния (VEGF)-специфического антагониста фактора роста эндотелия сосудов подходят для интравитреального введения в глаз. Глазной состав включает стабильный жидкий состав и способный к лиофилизации состав. Глазной состав содержит антагонист белка имеет аминокислоты 27-457 последовательности SEQ ID NO:4, органический растворитель, средство, обеспечивающее тоничность, буфер в виде фосфата натрия, и, дополнительно, стабилизатор. Изобретение обеспечивает стабильность глазного состава. 4 н. и 7 з.п. ф-лы, 8 табл.

1. Глазной состав антагониста фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), содержащий
(a) 1-100 мг/мл антагониста VEGF, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4;
(b) 0,01-5% одного или более органических сорастворителей, которые представляют собой одно или более соединений из числа полисорбата, полиэтиленгликоля (ПЭГ) и пропиленгликоля;
(c) 30-150 мМ средства, обеспечивающего тоничность, выбранного из хлорида натрия или хлорида калия; и
(d) 5-40 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия; и в случае необходимости дополнительно содержащий 1,0-7,5% стабилизатора, выбранного из группы, состоящей из сахарозы, сорбита, глицерина, трегалозы или маннита, рН приблизительно 5,8-7,0.

2. Глазной состав по п.1, содержащий приблизительно 1-100 мг/мл, предпочтительно 10-80 мг/мл, антагониста VEGF, 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, 40 мМ NaCl, 0,03% полисорбата и 5% сахарозы, рН приблизительно 6,2-6,3.

3. Глазной состав по п.2, содержащий антагонист VEGF в концентрации, выбранной из группы, состоящей из 10 мг/мл, 20 мг/мл, 40 мг/мл и 80 мг/мл.

4. Глазной состав по любому из пп.1-3, содержащий 10-80 мг/мл антагониста VEGF, 10 мМ фосфата натрия, 0,03% полисорбата и 135 мМ хлорида натрия, рН приблизительно 6,2-6,3.

5. Глазной состав по п.1, содержащий
(a) 10 мг/мл антагониста VEGF, включающего аминокислоты 27-457 последовательности SEQ ID NО:4;
(b) 0,3% полисорбата 20;
(c) 40 мМ ± 20% хлорида натрия; и
(d) 5-40 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, рН 6,2- 6,4; и
е) 5% сахарозы.

6. Способный к лиофилизации состав антагониста фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), содержащий
(а) 5-50 мг/мл антагониста VEGF, предпочтительно 5 мг/мл, 10 мг/мл, 20 мг/мл или 40 мг/мл, включающего аминокислоты 27-457 последовательности SEQ ID NO:4;
(b) 5-25 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, рН приблизительно 5,8-7,0;
(c) 0,01-0,15% органического сорастворителя, выбранного из группы, состоящей из полисорбата, полиэтиленгликоля (ПЭГ), пропиленгликоля и их комбинаций; и, в случае необходимости,
(d) 1-10% стабилизатора, выбранного из группы, состоящей из сахарозы, сорбита, глицерина, трегалозы и маннита; или 20-150 мМ средства, обеспечивающего тоничность, предпочтительно хлорида натрия; или 1-10% стабилизатора и 20-150 мМ средства, обеспечивающего тоничность.

7. Способный к лиофилизации состав по п.5, содержащий приблизительно 20 мг/мл антагониста VEGF, приблизительно 10 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, приблизительно 0,03% полисорбата, приблизительно 0,1% ПЭГ и приблизительно 2,5% сахарозы, рН приблизительно 6,2-6,3.

8. Способный к лиофилизации состав по п.5, содержащий приблизительно 20 мг/мл антагониста VEGF, приблизительно 5 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, приблизительно 0,015% полисорбата, приблизительно 2,5% сахарозы и дополнительно содержащий приблизительно 20 мМ хлорида натрия, рН приблизительно 6,2-6,3.

9. Способный к лиофилизации состав по п.6, содержащий приблизительно 20 мг/мл антагониста VEGF, приблизительно 5 мМ буфера, представляющего собой фосфат натрия, приблизительно 0,015% полисорбата и дополнительно содержащий приблизительно 67,5 мМ хлорида натрия, рН приблизительно 6,2-6,3.

10. Способ получения лиофилизованного состава антагониста VEGF, включающий лиофилизацию предварительно лиофилизованного состава по пп.6-9, с получением лиофилизованного состава.

11. Предварительно заполненный шприц, подходящий для интравитреального введения, содержащий состав по п.1.