СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПЛОТИПИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА УЧАСТКА АУТОСОМНОЙ ДНК ИНДИВИДУУМА Российский патент 2011 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к области генетики и биотехнологии и может быть использовано для определения полиморфизма участка аутосомной ДНК.

Гипервариабельные районы генома нашли широкое применение в качестве генетических маркеров при изучении генома человека. Данные локусы оказались высокоинформативными маркерами для генетического картирования, изучения генетической гетерогенности популяций, проведения судебно-медицинской экспертизы, при установлении родства, а также в экологических исследованиях.

Минисателлитные локусы являются важным компонентом генома человека, используемым в геномных и популяционных исследованиях. Минисателлитный локус D1S80 используется в качестве маркеров для исследования популяций. Например, в популяциях Восточно-Европейского региона [Вербенко Д.А., Лимборская С.А. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №2, 2008].

Надо отметить, что одним из наиболее часто используемых в популяционных исследованиях является гипервариабельный минисателлитный локус D1S80 (рМСТ 118), расположенный в коротком плече хромосомы 1. Длина элементарного звена тандемно организованного повторяющегося участка маркера составляет 16 пар нуклеотидов (п.н.). В гене аполипопротеина В обнаружен высокополиморфный участок на расстоянии 500 пар оснований после 3′-конца гена. Повторяющимся звеном минисателлитного маркера 3'АРОВ является тандем двух последовательностей длиной 14 и 16 п.н.

Исследования гипервариабельных минисателлитных локусов 3'АРОВ и D1S80 активно проводятся во многих популяциях, благодаря чему стало возможным использование этих данных для анализа эволюционных механизмов, объясняющих современную изменчивость популяций человека. Общеизвестно, что данные по анализу материнских и отцовских линий популяций всего мира прямо указывают на расселение современных популяций из Африки. Проведенный недавно сравнительный анализ данных изменчивости минисателлита D1S80 и минисателлита 3'АРОВ в популяциях всего мира еще раз подтвердил эту гипотезу [Herrera et al., 2004; Destro-Bisol et al., 2000].

Однако способы генетического картирования по маркеру D1S80 в существующем уровне техники не позволяют анализировать конкретные гаплотипы изучаемых индивидуумов.

Настоящее изобретение направлено на достижение технического результата, заключающегося в определении конкретных гаплотипов, представляющих собой сочетания аллелей VNTR локуса D1S80 и SNP rs16824398, имеющихся на обеих хромосомах изучаемого индивидуума.

Указанный технический результат достигается тем, что разработана двухкомпонентная полиморфная система, состоящая из гипервариабельного минисателлитного локуса D1S80 (VNTR) и лежащего в непосредственной близости от него однонуклеотидного полиморфного сайта (SNP).

Суть способа состоит в том, что конкретный вариант локуса D1S80 индивидуума амплифицируют вместе с расположенным на той же хромосоме аллельным вариантом однонуклеотидного полиморфного сайта rs16824398 с помощью аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с двумя вариантами праймеров, 5′-конец которых метится соответствующим флуоресцентным красителем. По комбинации цвета красителей аллель-специфичного праймера и размера аллельного варианта локуса D1S80 определяются конкретные гаплотипы, присущие изучаемому индивидууму.

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами, которые не ограничивают объем заявленного изобретения.

Пример 1

Проведение аллель-специфичной ПЦР:

ПЦР проводили отдельно для каждой цепи ДНК с помощью двух реакций, включающих одинаковый, так называемый «обратный», немеченый праймер и один из двух аллель-специфичных праймеров, флуоресцентномеченных двумя различными красителями (Таблица).

Первая реакция (далее реакция "С") проводилась с двумя праймерами: «обратным» и аллель-специфичным праймером, 3′-конец которого комплементарен SNP аллельному варианту «С» (меченный красителем R6G). Смесь для проведения второй реакции (далее реакция "А") включала тот же самый обратный праймер и аллель-специфичный праймер, комплементарный SNP аллельному варианту «А» (меченный красителем FAM). По окончании ПЦР реакционные смеси «А» и «С» объединялись и анализировались совместно.

В результате реакции получали ампликоны, включающие в себя область гипервариабельного минисателлитного локуса D1S80, начинающуюся от «обратного» праймера и продолжающуюся до полиморфной позиции SNP. Таким образом, получаемые ампликоны различались, во-первых, по длине, определяющейся размером (числом повторов) VNTR, во-вторых, по эмиссии флуоресценции волн разной длины (цветом), зависящей от присутствия в позиции rsl6824398 либо нуклеотида «А» (зеленый цвет, λ_макс520 нм), либо «С» (синий цвет, λ_макс 557 нм).

Таблица Последовательности аллель-специфичных праймеров Определяемый аллельный вариант SNP rs16824398   последовательность праймера   А FAM-^5' GCCGGTCCTGCGTGTGAATT³' С R6G-^5' GCCGGTCCTGCGTGTGAATG^3' Обратный праймер ^5' GACAAATGCCACGCTGGTGACAAG^3'

FAM - 5(6) - Карбоксифлуоресцеин (флуоресценция λ_макс 520 нм)

R6G - 5(6) - Карбоксиродамин (флуоресценция λ_макс 557 нм)

Смесь для амплификации подготавливали следующим образом: в буферный раствор для проведения ПЦР (изготовитель - Синтол, Россия) конечным объемом 20 мкл, содержащий сульфат аммония, вносили хлорид магния (MgC12) до концентрации 1,5 мМ, 100 мкмоль каждого дезоксирибонуклеотида (dNTP, Fermentas, Lithuania), 0,175 единиц фермента Taq-полимеразы (Синтол, Россия), по 10 нг «обратного» и одного из аллель-специфичных праймеров и 40 нг ДНК-матрицы изучаемого индивидуума. Реакционную смесь перемешивали, помещали в предварительно прогретый до температуры 95°С прибор для проведения ПЦР (Терцик, Россия). Амплификацию проводили при следующих температурных условиях: 4 мин - денатурация при 94°С, а затем проводили 30 циклов амплификации в режиме 94°С - 45 сек, 68°С - 30 сек, 72°С - 45 сек, после чего охлаждали.

Пример 2

Разделение продуктов ПЦР:

Аллельные варианты определяли с помощью капиллярного электрофореза в приборе 3130XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Для проведения процедуры использовали капилляр Applied Biosystems длиной 50 см с внутренним диаметром 50 мкм на полимере РОР7 (Applied Biosystems, США) и 0,1 М буфер TAPS (N-трис [гидроксиметил]метил-3-аминопропансульфоновая кислота). Нанесение образца проводилось в течение 30 сек при напряжении 3 кВ, разделение - в течение 2800 сек при 13,4 кВ и температуре капилляра 60°С.

Для анализа аллельных вариантов по 1 мкл ПЦР-продукта, полученного в каждой из реакций «А» и «С», соединяли и разбавляли в 50 раз деионизированной водой. К 1 мкл полученной смеси добавляли 9 мкл формамида (Applied Biosystems, США), и 0,07 мкл маркера длины GeneScan 500 меченого флуорофором ROX (Applied Biosystems) Перед нанесением на капилляр образцы денатурировали при 95°С в течение 5 мин с последующим охлаждением.

Благодаря аллельной специфичности флуоресцентно-меченых праймеров, по цвету пиков на электрофореграмме удается определить тип полиморфной точковой замены (А - зеленый цвет или С - синий цвет). Количество тандемных повторов минисателлитного локуса D1S80, расположенных на той же хромосоме, рассчитывалось исходя из размера фрагмента реакции ПЦР.

Пример 3

Определение комбинаторных гаплотипов минисателлитного локуса D1S80 и точковой замены:

Анализ полученных электрофореграмм проводили в программе GeneMapper v4.0. Чаще всего в ДНК индивидуума наблюдали два пика, которые различались по времени выхода и цвету. В случае гомозиготы, по обеим полиморфным позициям пики сливались в один (см. чертежи). Цвет пика предоставлял информацию о конкретном аллельном варианте SNP, время выхода пика позволяло определять длину продукта в нуклеотидах (что соответствует определенному количеству повторов звена в минисателлитном кластере локуса D1S80). Длину продуктов определяли с помощью программы Peak View относительно маркера GeneScan 500, включающего 16 фрагментов следующих длин: 35, 50, 75, 100, 139, 150, 160, 200, 250, 300, 340, 350, 400, 450, 490, 500 пн. Аллельные варианты локуса D1S80 идентифицировали по калибровочной таблице длины фрагмента в зависимости от числа повторов.

Пример 4

Гаплотипирование SNP-VNTR полиморфизма у индивидуума, являющегося гетеорзиготным по гаплотипам С-24 и А-24, содержащего разные аллельные варианты точковой замены и одинаковое количество повторов в кластере минисателлитного локуса.

В результате реакции ПЦР с последующим разделением в капиллярном электрофорезе (см. фиг.1) у индивидуума обнаружено два пика, не различающихся по времени выхода, но различающихся по цвету. Из этого следует, что данный индивидуум гетерозиготен по точковому полиморфизму и гомозиготен по минисателлитному маркеру D1S80: обе хромосомы содержат по 24 повтора в кластере минисателлитного локуса D1S80, но разные аллельные варианты в позиции однонуклеотидной замены rs16824398. Сопоставляя размер фрагмента с цветом красителя, определили гаплотипы SNP-VNTR (сочетания числа повторов в кластере минисателлитного локуса D1S80 с аллельным вариантом точковой замены rs16824398 для отдельных хромосом) данного индивидуума. На одной из хромосом у него имеется гаплотип С-24, а на другой - А-24.

Вариант точковой замены определяли по цвету флуоресцентного красителя: по зеленому каналу регистрировалась флуоресценция красителя R6G (что соответствует аллельному варианту С), по синему - флуоресценция красителя FAM (что соответствует аллельному варианту аллель А), по красному - флуоресценция красителя ROX (маркер длины фрагментов). Число повторов в кластере минисателлитного локуса D1S80 определяли по калибровочной таблице, исходя из размера фрагмента ПЦР, меченного синим или зеленым красителем.

Пример 5

Гаплотипирование SNP-VNTR полиморфизма у индивидуума, являющегося гетерозиготным по гаплотипам С-18 и С-22, содержащего одинаковые аллельные варианты точковой замены и разное количество повторов в кластере минисателлитного локуса.

В результате реакции ПЦР с последующим разделением в капиллярном электрофорезе (см. фиг.2) у индивидуума обнаружено два пика, различающихся только по времени выхода. Из этого следует, что данный индивидуум гомозиготен по точковому полиморфизму и гетерозиготен по минисателлитному маркеру D1S80: обе хромосомы содержат в позиции однонуклеотидной замены rs16824398 аллельный вариант «С», но на одной из них обнаружено 18 повторов в кластере минисателлитного локуса D1S80, а на другой - 22 повтора. Сопоставляя размер фрагмента с цветом красителя, определяли гаплотипы SNP-VNTR (сочетания числа повторов в кластере минисателлитного локуса D1S80 с аллельным вариантом точковой замены rs16824398 для отдельных хромосом) данного индивидуума. На одной из хромосом у него имеется гаплотип С-18, а на другой - С-22.

Вариант точковой замены определяли по цвету флуоресцентного красителя; по зеленому каналу регистрировалась флуоресценция красителя R6G (что соответствует аллельному варианту С), по синему - флуоресценция красителя FAM (что соответствует аллельному варианту аллель А), по красному - флуоресценция красителя ROX (маркер длины фрагментов). Число повторов в кластере минисателлитного локуса D1S80 определяли по калибровочной таблице, исходя из размера фрагмента ПЦР, меченного синим или зеленым красителем.

Пример 6

Гаплотипирование SNP-VNTR полиморфизма у индивидуума, являющегося гетерозиготным по гаплотипам С-18 и А-24, содержащего разные аллельные варианты точковой замены и разное количество повторов в кластере минисателлитного локуса.

В результате реакции ПЦР с последующим разделением в капиллярном электрофорезе (см. фиг.3) у индивидуума обнаружено два пика, различающихся по времени выхода и цвету. Из этого следует, что данный индивидуум гетерозиготен по обоим локусам: на одной из хромосом, содержащей в позиции однонуклеотидной замены rs16824398 аллельный вариант «С», оказалось 18 повторов в кластере минисателлитного локуса D1S80; на другой хромосоме, содержащей в позиции однонуклеотидной замены rs16824398 аллельный вариант «А», оказалось 24 повтора в кластере минисателлитного локуса D1S80. Сопоставляя размер фрагмента с цветом красителя, определили гаплотипы SNP-VNTR (сочетания числа повторов в кластере минисателлитного локуса D1S80 с аллельным вариантом точковой замены rs16824398 для отдельных хромосом) данного индивидуума. На одной из хромосом у него имеется гаплотип С-18, а на другой - А-24.

Вариант точковой замены определяли по цвету флуоресцентного красителя: по зеленому каналу регистрировалась флуоресценция красителя R6G (что соответствует аллельному варианту С), по синему - флуоресценция красителя FAM (что соответствует аллельному варианту аллель А), по красному - флуоресценция красителя ROX (маркер длины фрагментов). Число повторов в кластере минисателлитного локуса D1S80 определяли по калибровочной таблице, исходя из размера фрагмента ПЦР, меченного синим или зеленым красителем.

Пример 7

Гаплотипирование SNP-VNTR полиморфизма у индивидуума, являющегося гомозиготным по гаплотипу А-24, содержащего одинаковые аллельные варианты точковой замены и одинаковое количество повторов в кластере минисателлитного локуса.

В результате реакции ПЦР с последующим разделением в капиллярном электрофорезе (см. фиг.4) у индивидуума обнаружено два пика, слившихся в один. Из этого следует, что данный индивидуум гомозиготен и по точковому полиморфизму, и по минисателлитному маркеру D1S80: обе хромосомы содержат в позиции однонуклеотидной замены rs16824398 аллельный вариант «А», и по 24 повтора в кластере минисателлитного локуса D1S80. Сопоставляя размер фрагмента с цветом красителя, определяли гаплотипы SNP-VNTR (сочетания числа повторов в кластере минисателлитного локуса D1S80 с аллельным вариантом точковой замены rs16824398 для отдельных хромосом) данного индивидуума. На обеих хромосомах у него имеется гаплотип А-24.

Вариант точковой замены определяли по цвету флуоресцентного красителя: по зеленому каналу регистрировалась флуоресценция красителя R6G (что соответствует аллельному варианту С), по синему - флуоресценция красителя FAM (что соответствует аллельному варианту аллель А), по красному - флуоресценция красителя ROX (маркер длины фрагментов). Число повторов в кластере минисателлитного локуса D1S80 определяли по калибровочной таблице, исходя из размера фрагмента ПЦР, меченного синим или зеленым красителем.

Таким образом, данный способ позволяет сразу определить конкретные гаплотипы, представляющие собой сочетания аллелей VNTR локуса D1S80 и SNP rs16824398, имеющиеся на обеих хромосомах изучаемого индивидуума.

Способ был использован для анализа генетического разнообразия популяций, относящихся к разным расам: монголоидной (якуты из села Тюнгюлю, республика Саха (Якутия), негроидной (смешанная популяция индивидов африканского происхождения) и европеоидной (популяции русского населения севера - Мезенский р-н Архангельской обл.) и запада (с.Сычевка Смоленской обл.) Европейской части России.

Изобретение относится к биотехнологии и генетике. Раскрыт способ определения гаплотипического полиморфизма участка аутосомной ДНК путем одновременной амплификации минисателлитного маркера и близко расположенной точковой замены. Способ состоит в том, что конкретный вариант локуса D1S80 индивидуума амплифицируют вместе с расположенным на той же хромосоме аллельным вариантом однонуклеотидного полиморфного сайта rs16824398 с помощью аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с двумя вариантами праймеров, 5'-конец которых метится соответствующим флуоресцентным красителем. По комбинации цвета красителей аллель-специфичного праймера и размера аллельного варианта локуса D1S80 определяются конкретные гаплотипы, присущие изучаемому индивидууму. Изобретение позволяет сразу определить конкретные гаплотипы, представляющие собой сочетания аллелей VNTR локуса D1S80 и SNP rs16824398, имеющиеся на обеих хромосомах изучаемого индивидуума. 4 ил., 1 табл.

Способ определения гаплотипического полиморфизма участка аутосомной ДНК индивидуума, включающий одновременную амплификацию мини-сателлитного маркера, представляющего собой гипервариабельный мини-сателлитный локус D1S80 и близко расположенного на той же хромосоме аллельного варианта однонуклеотидного полиморфного сайта rs 16824398 с помощью аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с двумя вариантами праймеров, 5'-конец которых метится соответствующим флуоресцентным красителем, по комбинации цвета красителей аллель-специфичного праймера и размера аллельного варианта локуса D1S80 определяют конкретные гаплотипы, присущие индивидууму.