Набор праймеров и зондов для генотипирования полиморфного локуса rs12566098 (CG) гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" Российский патент 2023 года по МПК A61K38/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs12566098 (C>G) гена SERPINE1 мРНК-связывающего белка 1 молекулярно-генетическим методом исследования.

Ген SERBP1 (Gene ID: 26135) локализован на хромосоме 1p31.3. Согласно SNPinfo Web Server/ LD TAG SNP Selection [https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpinfo/snptag.html] полиморфный вариант rs12566098 гена SERBP1 является таргетным (то есть репрезентативным однонуклеотидным полиморфизмом в геномной области с высокой степенью неравновесия по сцеплению с группами других полиморфных локусов, составляющих гаплотип).

Однонуклеотидный полиморфизм rs12566098, позиция chr1:67423888 (GRCh38.p14) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs12566098] локализован в интроне и характеризуется заменой С>G,T. Однако, аллель T встречается с частотой <0.000001 в европейских популяциях и также характеризуется низкой частотой в других популяциях мира, в связи с чем именно замена С>G является наиболее актуальной для проведения исследований. По данным транскриптомного анализа GTex Portal rs12566098 влияет на уровень экспрессии SERBP1 [https://gtexportal.org/home/].

Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорогого и доступного всем исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации таргетного полиморфного варианта rs12566098 (С>G) гена SERBP1.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006-2016 //Nature protocols. - 2017. - Vol. 12. - №. 2. - P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. - 2022. - Vol. 2. - №. 5. - P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.

За прототип выбран коммерческий набор по генотипированию rs12566098 (C/G) SERBP1 (Assay ID C___2694736_10; каталожный номер 4351379) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческого набора характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем данные методику невозможно воспроизвести в ПЦР-лабораториях со стандартным набором оборудования и реактивов.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs12566098 (C>G) гена SERBP1, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в ПЦР-лабораториях со стандартным набором оборудования и реактивов.

Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs12566098 (C>G), локализованного в позиции chr1:67423888 (GRCh38.p14) гена SERBP1 (Gene ID:26135) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs12566098 (C>G) гена SERBP1 осуществляют с использованием прямого общего праймера 5′-CAGTTGTATGACAATGGTAAAATGA-3′ (SEQ ID NO 1), обратного общего праймера 5′-CTCCCAAAGTGCTGGGATTA-3′ (SEQ ID NO 2), C-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′- (FAM)CACATAAACCACTCTTTTAAG(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′- (ROX)CACATAAAGCACTCTTTTAAG(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs12566098 гена SERBP1 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs12566098-С/С показаны оранжевыми кругами, генотипы rs12566098-С/G показаны зелеными треугольниками, генотипы rs12566098-G/G показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену C/G rs12566098 SERBP1, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер rs12566098 5′-CAGTTGTATGACAATGGTAAAATGA-3′ (SEQ ID NO 1),

обратный общий праймер rs12566098 5′-CTCCCAAAGTGCTGGGATTA-3′ (SEQ ID NO 2). Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена SERBP1 с использованием данных праймеров составляет 156 пар нуклеотидов:

2) Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. - New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2. На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

rs12566098-C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′- (FAM)CACATAAACCACTCTTTTAAG(RTQ1)-3′(SEQ ID NO 3),

rs12566098-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′- (ROX)CACATAAAGCACTCTTTTAAG(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 15 секунд и 56°C в течение 1 минуты].

5) Разработанный способ был апробирован на 95 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зонда с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs12566098 5 человек (5,3%) оказались гомозиготами по аллелю C (генотип C/C); 31 человек (32,6%) являлись гетерозиготами (генотип C/G), 59 человек (62,1%) оказались гомозиготами G/G.

6) Валидацию способа проводили с методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs12566098 (C>G) гена SERBP1 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37°C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs12566098 (C>G) гена SERBP1 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: С-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).

ПЦР в реальном времени проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкМ каждого праймера, по 5 мкМ каждого зонда, 0.03 мМ каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов (95°C в течение 15 секунд и 56°C в течение 1 минуты).

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs12566098 (C>G) гена SERBP1 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю C, зонд с красителем ROX - аллелю G (фиг.). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов - соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот C/C. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер зеленых треугольников позволяет идентифицировать гетерозигот C/G.

Резюме

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс- идентификации аллельных вариантов С и G полиморфизма rs12566098 гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфного варианта rs12566098 гена SERBP1, а также в научных целях.

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярно-генетической диагностике и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфного варианта rs12566098 (C>G) гена SERPINE1 мРНК-связывающего белка 1. Предложен набор праймеров для генотипирования полиморфного локуса rs12566098 (C>G) гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени». Изобретение позволяет расширить арсенал средств для генотипирования полиморфных вариантов гена SERBP1, повысить точность генотипирования. 1 ил.

Набор праймеров и зондов для генотипирования полиморфного локуса rs12566098 (C>G) гена SERBP1 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени», отличающийся тем, что в качестве праймеров используют прямой общий праймер 5′-CAGTTGTATGACAATGGTAAAATGA-3′ (SEQ ID NO: 1), обратный общий праймер 5′-CTCCCAAAGTGCTGGGATTA-3′ (SEQ ID NO: 2), а в качестве зондов – C-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM)CACATAAACCACTCTTTTAAG(RTQ1)-3′ (SEQ ID NO: 3) и G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX)CACATAAAGCACTCTTTTAAG(BHQ2)-3′ (SEQ ID NO: 4).