СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВЕНТРИКУЛОМЕГАЛИИ И ГИДРОЦЕФАЛИИ У ПЛОДОВ И НОВОРОЖДЕННЫХ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 G01N1/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, и позволяет иммуногистохимическим методом на клеточном уровне дифференцировать вентрикуломегалию и гидроцефалию у плодов и новорожденных 22-27 недель гестации.

Актуальность предлагаемого способа определяется тем, что в некоторых ситуациях искусственное прерывание беременности по результатам скринингового УЗИ во втором триместре, выявившего внутреннюю гидроцефалию плода, является неоправданным. Анатомические изменения в вентрикулярной системе головного мозга еще обратимы и ограничиваются умеренной дилятацией тел и/или задних рогов боковых желудочков и вовсе не сопровождаются атрофическими изменениями мозговой паренхимы как при гидроцефалии (Пренатальная эхография / Под редакцией М.В.Медведева. - М.: Реальное время, 2005. - 560 с.). Данные о частоте встречаемости последней противоречивы и варьируют от 0,1 до 2,5 случаев на 1000 новорожденных (Недзъведь М.К. Болезни центральной нервной системы // Болезни плода, новорожденного и ребенка / Под ред. Черствого Е.Д., Кравцовой Г.И. - Минск: Высш. шк. - 1996. С.202; Ermini M., Uranda А., Campana Н., Lopez-Camelo J.S. Birth prevalence rates of La Plata County // 10^th international Conference on Prenatal Diagnosis and Therapy Barcelona (Spain). - 2000. - P.362; Myrianthopoulos N.C.Epidemiology of central nervous system malformations. Handbook of clinical neurology. - Amsterdam: Elsevier, 1997. - P.139-171), а в общем потоке беременных при УЗИ плода составляют 0,6% (Пренатальная эхография / Под редакцией М.В.Медведева. - М.: Реальное время, 2005. - 560 с.). Между тем, гидроцефалия любой степени, выявленная при трансабдоминальном сканировании плода у беременных в 22-27 недель гестации, является медицинским показанием к прерыванию беременности. Поэтому необходимость разграничения врожденной вентрикуломегалии и гидроцефалии весьма актуальна и предполагает разработку объективных дифференциально-диагностических критериев указанной патологии.

В патологоанатомической практике известен способ диагностики тяжелой степени врожденной гидроцефалии, осуществляемый с помощью морфометрии ядер нейронов 3-го слоя поля 40. Согласно методике при объеме ядер, не превышающем 270 мкм³, диагностируют тяжелую степень водянки головного мозга (Патент №2318446 Российская Федерация. Способ диагностики тяжелой степени врожденной гидроцефалии / Воробьев A.M., Старых B.C., Зинчук С.Ф., Воробьев М.А. - Изобретения. Полезные модели. - 2008. - №7).

Основным недостатком способа является невозможность диагностировать пограничные состояния - вентрикуломегалию и легкую степень гидроцефалии. Последняя, как и другие формы врожденной водянки головного мозга, требует решения вопроса о досрочном прерывании беременности в допустимые сроки (до 25-27 недель гестации) с последующим патологоанатомическим подтверждением правильности избранной тактики.

Другой способ диагностики гидроцефалии основан на методе компьютерно-томографической морфометрии головного мозга, согласно которому при значении объема ликворных пространств от 3,8% до 10% краниальной полости определяют легкую степень гидроцефалии; от 10,1% до 30% - среднюю степень; более 30% - тяжелую (Патент №2301625 Российская Федерация. Способ диагностики гидроцефалии головного мозга / Ларькин В.И., Ларькин И.И., Ларькин Д.В., Атрошенко А.В. Изобретения. Полезные модели. - 2007. - №18).

Недостатки способа:

1) данный метод неморфологический; предполагает использование дорогостоящего оборудования;

2) невозможность диагностировать пограничные состояния - вентрикуломегалию и гидроцефалию.

Известен способ диагностики вентрикуломегалии при скрининговом ультразвуковом исследовании беременных во втором триместре, осуществляемый посредством оценки размеров вентрикулярной системы, полученных при трансабдоминальном поперечном сканировании головки плода. При вентрикуломегалии ширина боковых желудочков составляет от 10 до 15 мм. Средний срок диагностики вентрикуломегалии указанным способом - 22,3-26 недель гестации (Arora A., Bannister S.M., Russell S. et al. Outcome and clinical course of prenatally diagnosed cerebral ventriculomegaly // Eur. J. Pediatr. Surg. - 1998. - Vol.8, Suppl. 1. - P.63-64; Pilu G., Falco P., Gabrielli S. et al. The clinical significance of fetal isolated cerebral borderline ventriculomegaly: report of 31 cases and review of the literature // Ultrasound Obstet. Gynecol. - 1999. - Vol.14, №5. - P.320-326; Pinzano R., Meir J., Natale R. et al. Fetal cerebral ventriculomegaly. An observational study // Ultrasound Obstet. Gynecol. - 2000. - Vol.16, Suppl. 1. - P.70-71).

Недостатки способа:

1) не является методом дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии.

2) оценка результатов данного способа диагностики вентрикуломегалии субъективна и зависит от чувствительности датчиков и квалификации врача УЗ-диагностики;

3) ультразвуковые диагностические критерии вентрикуломегалии и гидроцефалии не совпадают с морфологическими (Пренатальная эхография. Под редакцией М.В.Медведева. - М.: Реальное Время, 2005. - 560 с.).

Способов морфологической дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии, в доступных литературных источниках не выявлено. Указанные недостатки перечисленных способов предлагается устранить в заявляемом способе.

Заявляемым техническим результатом является разработка способа морфологической дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии у плодов и новорожденных 22-27 недель гестации, повышающего объективность диагностики указанных патологических состояний. Технический результат достигается путем исследования вентрикулярной системы головного мозга. При этом осуществляют иммуногистохимическое исследование герминативного матрикса в зоне задних рогов боковых желудочков, оценивая уровень экспрессии белка S-100 по количеству окрашенных нейробластов, и при окрашивании 30% нейробластов или менее диагностируют вентрикуломегалию, а при окрашивании 50% или более - гидроцефалию.

У погибших плодов и новорожденных 22-27 недель гестации осуществляют иммуногистохимическое исследование герминативного матрикса в зоне задних рогов боковых желудочков головного мозга путем подсчета количества окрашенных нейробластов и при окрашивании 30% нейробластов или менее диагностируют вентрикуломегалию, а при окрашивании 50% или более - гидроцефалию.

Впервые предложен способ морфологической дифференциальной диагностики вентрикуломегалии (обратимое состояние) и истинной гидроцефалии, сопровождающейся атрофическими изменениями в мозговой паренхиме, у плодов и новорожденных 22-27 недель гестации, основанный на оценке результатов иммуногистохимической реакции. В качестве искомого антигена избран нейроспецифический белок S-100, экспрессию которого оценивают в герминативном матриксе.

Нейроспецифический кальцийсвязывающий протеин S-100 находится, в основном, в астроцитарной глии (85-90%), нейронах (10-15%) и в минимальном количестве - в олигодендроцитах (Isobe Т., Takahashi К., Okuyama Т. S-100a0 (alpha alpha) protein is present in neurons of the central and peripheral nervous system // J.Neurochem. - 1984. - N 43. P.1494-1496). Непосредственно в клетках он содержится в цитоплазме, синаптической мембране и ядерном хроматине. Протеин S-100 участвует в регуляции всех основных мембранных, цитоплазматических и ядерных метаболических процессов, связанных с обеспечением восстановления механизмов интеграции в нервной системе (Schafer B.W., Heizmann C.W. The S-100 family of EF-hand calcium-binding proteins: function and pathology // Trends Biochem. Sci. - 1996. - N 21. - P.134-140), реализации генетических программ апоптоза и антиапоптозной защиты. Увеличение концентрации S-100 в спинномозговой жидкости и плазме крови служит маркером повреждения ЦНС (Голосная Г.С., Петрухин А.С., Маркевич К.А., Трифонова О.Е. Изменение уровня белка S-100 у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС // Педиатрия. - 2004. - №1. - С.10-15; Патент №2256914 Российская Федерация. Способ прогнозирования перинатальной патологии у беременных с хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями / Тареева Т.Г., Ткачева И.И., Микаелян А.В. и др. // Изобретения. Полезные модели. - 2005. - №20).

В онкоморфологии иммуногистохимическую реакцию на S-100 используют для определения тканевой принадлежности опухоли (Константинова М.М. Гастроинтестинальные стромальные опухоли (GIST). Стандарты диагностики и тактики лечения // Вестник Московского Онкологического общества. - 2005. - С.42-43; В.Г.Лихванцева, О.А.Анурова, М.В.Верещагина. Способ одновременной диагностики и прогнозирования исхода неопластического процесса при увеальной меланоме // Российский биотерапевтический журнал. - 2007. - Т.IV, №1. - С.68).

Основываясь на собственных наблюдениях, считаем, что интенсивность иммуногистохимической реакции в герминативном матриксе, возрастающую пропорционально степени повреждения нервной ткани, можно считать эквивалентом компенсаторного увеличения количества S-100 в ЦНС. Поэтому мы предлагаем использовать оценку экспрессии протеина S-100 в герминативном матриксе у плодов и новорожденных 22-27 недель гестации с целью дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии.

Способ осуществляется следующим образом

Головной мозг целиком фиксируют в 10% нейтральном формалине в течение 2-3 недель. Взятие материала для гистологического исследования осуществляют на горизонтальном срезе больших полушарий головного мозга на уровне спайки свода в зоне задних рогов боковых желудочков (наиболее расширенный отдел вентрикулярной системы). Кусочки паренхимы головного мозга размерами 0,5×0,5 см из перивентрикулярной области после обычной проводки заливают в парафин. Для иммуногистохимического исследования используют парафиновые срезы толщиной 5 мкм и стандартный набор реактивов для определения S-100 («Dako», Дания). Оценку уровня экспрессии протеина S-100 проводят в герминативном матриксе путем подсчета количества окрашенных нейробластов (Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.) и при окрашивании 30% нейробластов или менее диагностируют вентрикуломегалию, а при окрашивании 50% или более таковых - гидроцефалию.

Сущность способа поясним следующими примерами.

Пример 1.

Новорожденная Ф. от 1-й беременности, осложнившейся внутриутробной инфекцией и многоводием, I-х родов в срок гестации 27 недель с массой тела при рождении 1020 г. Жила 1 месяц 2 дня.

Заключительный клинический диагноз

Гидроцефалия постгеморрагическая на фоне двустороннего внутрижелудочкового кровоизлияние III степени в постнатальном периоде (по данным нейросонографии).

Результат морфологической диагностики

Иммуногистохимически в герминативном матриксе идентифицирован белок S-100, экспрессия которого выявлена в 22% нейробластов в виде светлых желто-коричневых гранул в перинуклеарной зоне цитоплазмы, что соответствует вентрикуломегалии задних рогов боковых желудочков головного мозга.

На аутопсии в головном мозге обнаружена дилятация задних рогов боковых желудочков (8 мм слева; 10 мм справа). Остальные отделы вентрикулярной системы щелевидной формы: передние рога - 3 мм слева и 4 мм справа, тела - по 3 мм слева и справа, нижние рога - по 2 мм с обеих сторон. Под эпендимой обоих передних рогов и тел выявлены симметричные мелкоочаговые кровоизлияния. Герминативный матрикс в виде полосы из светлых глиобластов с периваскулярным скоплением темных клеток и субэпендимальной локализацией капилляроподобных сосудов. В неокортексе не завершена дифференцировка III-VI цитоархитектонических слоев. Атрофические изменения в мозговой паренхиме отсутствуют.

Таким образом, по уровню экспрессии белка S-100 в герминативном матриксе (22% окрашенный нейробластов) диагностирована вентрикуломегалия задних рогов боковых желудочков головного мозга. Правильность иммуногистохимической диагностики подтверждена другими морфологическими признаками указанной патологии - умеренной, до 8-10 мм, дилятацией задних рогов боковых желудочков и замедлением дифференцировки неокортекса на фоне отсутствия атрофических изменений в мозговой паренхиме.

При сличении заключительного клинического и патологоанатомического диагнозов констатировано расхождение по нозологическому принципу.

Пример 2.

Плод женщины С. 31 года мужского пола с массой тела при рождении 875 г, длиной 33 см. Беременность III, прервана на акушерском сроке 22-23 недели методом амниоцентеза по медицинским показаниям - врожденный порок развития плода (гидроцефалия).

Иммуногистохимическое исследование герминативного матрикса в зоне задних рогов боковых желудочков выявило экспрессию белка S-100 в виде умеренного желтовато-коричневатого окрашивания цитоплазмы в 30% нейробластов, что соответствует вентрикуломегалии задних рогов боковых желудочков головного мозга.

Кроме того, в головном мозге выявлена умеренная дилятация задних (9 мм слева и справа) и нижних (8 мм слева и 6 мм справа) рогов боковых желудочков. Остальные отделы вентрикулярной системы (передние рога и тела) щелевидной формы, их стенки сомкнуты. Герминативный матрикс представлен светлыми глиобластами с периваскулярным скоплением темных клеток и субэпендимальной локализацией капилляроподобных сосудов. В неокортексе - незавершенная дифференцировка III-VI цитоархитектонических слоев без атрофических изменений в мозговой паренхиме.

Таким образом, по уровню экспрессии белка S-100 в герминативном матриксе (30% окрашенных нейробластов) диагностирована вентрикуломегалия задних рогов боковых желудочков головного мозга. Правильность иммуногистохимической диагностики подтверждена другими морфологическими признаками указанной патологии - умеренной (8-10 мм) дилятацией задних и нижних рогов боковых желудочков и замедлением дифференцировки неокортекса без атрофических изменений в паренхиме головного мозга.

При сличении клинического диагноза, учитывающего результаты ультразвукового исследования беременной (врожденный порок развития плода - гидроцефалия), и патологоанатомического диагноза (вентрикуломегалия задних и нижних рогов боковых желудочков головного мозга) констатировано расхождение таковых по нозологическому принципу. Следовательно, акушерская тактика в отношении досрочного прерывания беременности признана неадекватной.

Пример 3.

Плод женщины К. 30 лет мужского пола с массой тела при рождении 1050 г, длиной 35 см. Беременность IV, прервана на акушерском сроке 26-27 недель методом амниоцентеза по медицинским показаниям - врожденный порок развития плода (гидроцефалия).

Иммуногистохимически в герминативном матриксе идентифицирован белок S-100, экспрессия которого выявлена в 87% нейробластов в виде интенсивного желто-коричневого окрашивания цитоплазмы и нуклеоплазмы, что соответствует гидроцефалии.

На аутопсии в головном мозге обнаружена дилятация всех отделов боковых желудочков (передние, задние, нижние рога и тела) до 2,5-3 см и атрофия мозговой паренхимы. Герминативный матрикс представлен преимущественно темными клетками. Сосуды типа капилляров расположены в толще герминативного матрикса. В неокортексе отсутствуют признаки дифференцировки цитоархитектонических слоев.

Таким образом, по уровню экспрессии белка S-100 в герминативном матриксе (87% окрашенных нейробластов) установлена гидроцефалия. Правильность иммуногистохимической диагностики подтверждена другими морфологическими признаками указанной патологии - выраженной дилятацией полостей боковых желудочков головного мозга, а также полным отсутствием признаков естественного регресса в герминативном матриксе и дифференцировки цитоархитектонических слоев в неокортексе на фоне атрофии мозговой паренхимы.

При сличении клинического диагноза, оформленного с учетом результатов ультразвукового исследования беременной (врожденный порок развития плода - гидроцефалия), и патологоанатомического диагноза (внутренняя гидроцефалия) констатировано совпадение и подтверждена правильность акушерской тактики в отношении досрочного прерывания беременности.

Пример 4.

Плод женщины И. 37 лет мужского пола с массой тела при рождении 985 г, длиной 36 см. Беременность V, прервана на акушерском сроке 26-27 недель методом амниоцентеза по медицинским показаниям - врожденный порок развития плода (гидроцефалия).

Иммуногистохимическим методом в герминативном матриксе задних рогов боковых желудочков обнаружен белок S-100, экспрессия которого выявлена в 50% глиобластов в виде окрашивания цитоплазмы и нуклеоплазмы таковых в желто-коричневый цвет, что соответствует гидроцефалии.

На аутопсии в головном мозге обнаружена дилятация всех отделов боковых желудочков (передние, задние, нижние рога и тела) до 2-2,5 см и атрофия мозговой паренхимы. Герминативный матрикс представлен преимущественно темными клетками. Сосуды типа капилляров расположены в толще герминативного матрикса. Признаки дифференцировки цитоархитектонических слоев в неокортексе отсутствуют.

Таким образом, по уровню экспрессии белка S-100 в герминативном матриксе (50% окрашенных нейробластов) установлена гидроцефалия. Правильность иммуногистохимической диагностики подтверждена другими морфологическими признаками указанной патологии - выраженной дилятацией полостей боковых желудочков головного мозга, полным отсутствием признаков естественного регресса в герминативном матриксе и дифференцировки цитоархитектонических слоев в неокортексе на фоне атрофии мозговой паренхимы.

При сличении клинического диагноза, оформленного с учетом результатов ультразвукового исследования беременной (врожденный порок развития плода - гидроцефалия), и патологоанатомического диагноза (внутренняя гидроцефалия) констатировано совпадение и подтверждена правильность акушерской тактики в отношении досрочного прерывания беременности.

Преимущества способа

1. Является объективным морфологическим методом дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии.

2. Позволяет в течение нескольких минут (3-5) на клеточном уровне осуществить диагностику вентрикуломегалии и гидроцефалии у плодов и новорожденных 22-27 недель гестации.

3. В патологоанатомической практике может послужить способом контроля за точностью ультразвуковой диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии у плодов и новорожденных 22-27 недель гестации.

4. Повышает качество оформления патологоанатомического диагноза и эпикриза.

5. Заявленный способ высокоинформативен и прост в осуществлении оценки результатов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии. Способ заключается в том, что у погибших плодов и погибших новорожденных 22-27 недель гестации исследуют вентрикулярную систему головного мозга, а именно осуществляют иммуногистохимическое исследование герминативного матрикса в зоне задних рогов боковых желудочков, оценивая уровень экспрессии белка S-100 по количеству окрашенных нейробластов. При окрашивании 30% нейробластов или менее диагностируют вентрикуломегалию, а при окрашивании 50% или более - гидроцефалию. Использование заявленного способа позволяет на клеточном уровне дифференцировать вентрикуломегалию и гидроцефалию у погибших плодов и погибших новорожденных 22-27 недель гестации.

Способ дифференциальной диагностики вентрикуломегалии и гидроцефалии у плодов и новорожденных путем исследования вентрикулярной системы головного мозга, отличающийся тем, что у погибших плодов и погибших новорожденных 22-27 недель гестации осуществляют иммуногистохимическое исследование герминативного матрикса в зоне задних рогов боковых желудочков, оценивая уровень экспрессии белка S-100 по количеству окрашенных нейробластов, и при окрашивании 30% нейробластов или менее диагностируют вентрикуломегалию, а при окрашивании 50% или более - гидроцефалию.