СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИИ У БЕРЕМЕННЫХ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования развития артериальной гипертонии у беременных.

Артериальная гипертония (АГ) - это болезнь, которая характеризуется стойким повышением уровня артериального давления. Изменения, происходящие в организме во время беременности, предрасполагают к развитию гипертонии и потому у беременных риск развития АГ выше, чем среди общего населения [1]. Артериальная гипертония при беременности встречается у 5-15% женщин и существенно осложняет ее прогноз; она является основной причиной материнской смертности, преждевременных родов, перинатальных потерь и сердечно-сосудистых заболеваний [2]. АГ представляет немалую опасность не только для организма матери, но и для плода. Под действием повышенного артериального давления изменяется структура кровеносных сосудов организма женщины, что в свою очередь приводит к нарушению кровоснабжения тканей и органов [3]. Синдром преэклампсии/эклампсии, основным элементом которого является артериальная гипертония беременности, как раз характеризуется нарушением циркуляции крови и повреждением почек. Стоит отметить, что эклампсия относится к чрезвычайно опасным состояниям беременности [1]. К настоящему времени накоплено множество сведений, указывающих, что в развитии гипертонии наследственные факторы могут играть значительную роль [4]. При этом данная патология носит полигенный характер. Согласно экспериментальным и клиническим данным, важную роль в развитии патологии играют так называемые гены - кандидаты «сосудистых реакций», участвующие в регуляции кровяного давления [5, 6, 7, 8, 9].

Авторами в доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен способ оценки прогнозирования развития артериальной гипертензии у беременных на основе данных о генетическом полиморфизме гена α-аддуцина 1.

Задачей настоящего исследования является разработка способа оценки прогнозирования развития артериальной гипертензии у беременных на основе данных о полиморфизме гена α-аддуцина 1.

Основная задача молекулярно-генетического типирования локуса гена α-аддуцина 1 - это определение единичной нуклеотидной замены в гене, которая вызывает замену аминокислоты глицина на трипофан в 460-м кодоне молекулы полипептида, что может влиять на развитие гипертонических реакций при беременности.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки развития гипертонии у беременных, позволяющих в короткие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ оценки состояния сердечно-сосудистой системы у беременных на основе анализа полиморфизма гена α-аддуцина 1, заключающийся в выделении ДНК из периферической венозной крови и проведении полимеразной цепной реакции. Вывод о риске развития гипертонии у беременных делают в случае выявления носительства генотипа 460WW гена α-аддуцина 1 ADD1 G460W.

Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не известен способ определения риска развития гипертонии у беременных по наличию аллелей и генотипов гена α-аддуцина 1.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови беременных в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl (рН=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (real-time ПЦР) с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и олигонуклеотидных зондов типа TaqMan.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза полиморфного локуса α-аддуцина 1 выполняется в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 65 мМ трис-HCl (рН=8,8), 2,5 мМ MgCl₂, 1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера и зонда, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 2 единицы активной Taq-полимеразы. Температурные режимы ПЦР и последовательности праймеров и зондов приведены в таблице.

Последовательность праймеров и зондов, температурный протокол, длина амплифицированного фрагмента локуса G460W ADD1 Последовательность праймеров и зондов Длина амплифицированного фрагмента Температурный протокол F:5'-GTCTTCGACTTGGGACTGCTT-3' 83 п.н. 5 мин - 95°С 35 циклов: 1 мин - 50°С (real-time) 15 сек -95°С R:5'-GAGAAGACAAGATGGCTGAACTCT-3 5'-ROX-CATTCTGCCCTTCCTC-RTQ-1-3' 5'-FAM- ATTCTGCCATTCCTC-RTQ-1-3'

Генотипирование осуществляется с помощью программного обеспечения прибора IQ5 производства фирмы BioRad на основе данных об уровне относительной флюоресценции по каждому зонду. Мутантный аллель 460W α-аддуцина 1 обуславливает изменение первичной структуры белка, что может приводить к развитию гипертонических реакций у беременных при гестозе.

Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использован критерий χ², наблюдаемая гетерозиготность, ожидаемая гетерозиготность, индекс фиксации Райта. Ассоциации аллелей и генотипов ДНК-маркера с предрасположенностью к развитию гипертонии оценивают с помощью анализа таблицы сопряженности 2×2 с расчетом критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI).

Изобретение подтверждается изображениями, представленными на чертежах:

Фиг.1 - диаграмма «Распределение беременных, имеющих аллель 460G локуса

G460W ADD1, по уровню артериального давления»;

Фиг.2 - диаграмма «Распределение беременных, имеющих генотип 460WW локуса G460W ADD1, по уровню артериального давления».

В качестве конкретного примера проведен анализ результатов наблюдений 241 беременной. Выборка беременных формировалась на базе перинатального центра областной клинической больницы г.Белгорода. Все женщины были разделены на 3 группы, в зависимости от уровня артериального давления: 1) >140/90 мм рт.ст. - гипертоники (n=97); 2) <90/60 мм рт.ст - гипотоники (n=7); 3) 90-140/60-90 мм рт.ст. - нормотоники (n=137).

Как видно из диаграмм, представленных на фиг.1 и на фиг.2, наличие аллеля 460G (генотипы 460GG и 460GW) связано с нормотонией - в данной группе наибольший процент беременных с нормальным артериальным давлением (58,1% против 14,3% у носителей генотипа 460WW, OR=8,3 (Cl 1,02-189,43), р=0,05). Напротив, наличие аллеля 460W в гомозиготном состоянии обуславливает развитие гипертонии - преобладающее большинство беременных с мутантным генотипом имеют повышенное артериальное давление (85,7% против 38,9% у носителей аллеля 460G, OR=0,1 (Cl 0,005-0,91), р=0,036).

Таким образом, наличие генотипа 460WW локуса G460W ADD1 может считаться неблагоприятным фактором в развитии артериальной гипертензии у беременных и свидетельствует о возможной прогностической значимости данного генетического маркера.

Литература

1. Шехтман М.М., Бурдули Г.М. Болезни органов дыхания и кровообращения у беременных. - М: «Триада-Х», 2002. - 232 с.

2. Ткачева О.Н., Барабашкина А.В. Актуальные вопросы патогенеза, диагностики и фармакотерапии артериальной гипертонии у беременных. - М: «ПАГРИ», 2006 - 140 с.

3. Савельева Г. М. Акушерство. - М.: Медицина, 2000. - 160 с.

4. Торшин И.Ю., Громова О.А. Сосудистые заболевания сердца, мозга и молекулярные гены. ЧастьЗ: роль молекулярных генов в вазоконстрикции, вазодилятации, обмене электролитов и в васкулярном ремоделировании // Трудный пациент.- 2008. - т.6, №5-6. - С.8-11.

5. Вшсе М. Psaty, Nicholas L. Smith, Susan R. Heckbert. et al. Diuretic Therapy, the alpha-Adducin Gene Variant, and the Risk ofMyocardial Infarction or Stroke in Persons With Treated Hypertension // JAMA. - 2002, April 3. - v.287, №13. - P.1680-1689.

6. Iwai С., Akita H., Kanazawa К. et al. Arg389Gly polymorphism of the human betal-adrenergic receptor in patients with nonfatal acute myocardial infarction // Am Heart J. - 2003. - v.1, №146. - Р. 106-109.

7. Min-Ho Shin, Eun-Kyung Chung, Hee-Nam Kim et al. Alpha-adducin Gly460Trp and Essential Hypertension in Korea // J Korean Med Sci. - 2004. - №19. - P. 812-814.

8. Rubattu S., Stanzione R., Di Angelantonio E., Zanda B. et al. Atrial natriuretic peptide gene polymorphisms and risk of ischemic stroke in humans // Stroke. - 2004. - v.4, №35. - P.814-818.

Изобретение относится к области медицины, а именно к молекулярной генетике. Способ прогнозирования развития артериальной гипертонии у беременных заключается в том, что осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, проведение полимеразной цепной реакции, выявление данных о наличии полиморфизма гена α-аддуцина 1. При выявлении носительства генотипа 460WW гена α-аддуцина 1 ADD1 G460W делают вывод о риске развития гипертонии у беременных. Использование заявленного способа позволяет повысить эффективность прогнозирования развития артериальной гипертонии у беременных. 1 табл., 2 ил.

Способ прогнозирования развития артериальной гипертонии у беременных, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, проведение полимеразной цепной реакции, выявление данных о наличии полиморфизма генов, отличающийся тем, что в случае выявления носительства генотипа 460WW гена α-аддуцина 1 ADD1 G460W делают вывод о риске развития гипертонии у беременных.